段旭昌免疫磁珠分離技術(shù)(IMB)及在食品生產(chǎn)中的應(yīng)用

1、 段旭昌段旭昌 副教授副教授 西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 2022 9 10 磁性微球磁性微球 磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn)磁性微球結(jié)構(gòu)、分類及特點(diǎn) 磁性微球的制備磁性微球的制備 磁性微球分離技術(shù)磁性微球分離技術(shù) 免疫磁株免疫磁株 免疫磁珠結(jié)構(gòu)與性質(zhì)免疫磁珠結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 免疫磁株的特點(diǎn)免疫磁株的特點(diǎn) 免疫磁珠的分類免疫磁珠的分類 免疫磁珠的制備免疫磁珠的制備 免疫磁珠分離技術(shù)免疫磁珠分離技術(shù) 免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)的應(yīng)用 免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用 免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用免疫磁珠與其它檢測(cè)手段的聯(lián)用 免疫磁珠技

2、術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)在其他領(lǐng)域的應(yīng)用 免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展望免疫磁珠技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)及發(fā)展望 是通過(guò)一定方法將磁性無(wú)機(jī)粒子與有機(jī)高分子結(jié)合 形成的具有一定磁性及特殊結(jié)構(gòu)的體積在幾納米到 幾十微米之間的復(fù)合微球。 高分子磁性微球表面具有眾多表面功能基 團(tuán)，同時(shí) 具有磁響應(yīng)性，在外加磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向功能。 目前已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分離工程等領(lǐng) 域。 磁性核材料多為磁性核材料多為Fe、Co、 Pt 、Ni等金屬及其氧化物。如等金屬及其氧化物。如Fe3O4、- Fe2O3、 Me Fe2O3（Me= Co、Mn、Ni）、）、 BaFe12O19、鐵鈷合金（、鐵鈷合金（Fe-Co

3、和和Ni- Fe）。最常用的是）。最常用的是Fe、 Fe2O3、 Fe3O4。其中。其中Fe3O4 應(yīng)用最多。應(yīng)用最多。 構(gòu)成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質(zhì)。天然高分子有明構(gòu)成磁性微球的高分子材料有天然高分子和合成高分子物質(zhì)。天然高分子有明 膠、球蛋白、牛血清白蛋白、聚賴氨酸、淀粉和多種聚糖如纖維素、葡聚糖、膠、球蛋白、牛血清白蛋白、聚賴氨酸、淀粉和多種聚糖如纖維素、葡聚糖、 瓊脂糖、殼聚糖、果膠等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯瓊脂糖、殼聚糖、果膠等。合成高分子材料有聚苯乙烯、聚乙烯亞胺、聚乙烯 醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。這些材料

4、可單醇、聚丙烯酸（酯）及其共聚物、聚酰胺類、聚苯胺及硅烷等。這些材料可單 獨(dú)用，也可復(fù)合使用。獨(dú)用，也可復(fù)合使用。 磁性微球表面可根據(jù)需要賦予不同的功能基磁性微球表面可根據(jù)需要賦予不同的功能基 團(tuán)團(tuán)(如如OH、COOH、CHO、 NH2,SH、CONO2、CONH2、SO3H、SiH3、環(huán)氧基、環(huán)氧基、 CHCl等等)，使其表現(xiàn)具有疏水，使其表現(xiàn)具有疏水-親水、非極性親水、非極性-極性、帶正電荷極性、帶正電荷-帶負(fù)電荷等不同帶負(fù)電荷等不同 物理性質(zhì)。同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向性。物理性質(zhì)。同時(shí)具有磁響應(yīng)性，在外磁場(chǎng)作用下具有磁導(dǎo)向性。 導(dǎo)電聚合磁微球?qū)щ娋酆洗盼⑶?聚合磁微球聚

5、合磁微球 對(duì)磁性微球的要求：粒徑均勻、大小合適、對(duì)磁性微球的要求：粒徑均勻、大小合適、 比表面積大、吸附力強(qiáng)、具有強(qiáng)的超順磁比表面積大、吸附力強(qiáng)、具有強(qiáng)的超順磁 性、懸浮均勻穩(wěn)定性好、不易聚集沉淀、性、懸浮均勻穩(wěn)定性好、不易聚集沉淀、 表面具有多種活性基團(tuán)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、表面具有多種活性基團(tuán)、理化性質(zhì)穩(wěn)定、 具有較好生物相容性、對(duì)細(xì)胞、機(jī)體、活具有較好生物相容性、對(duì)細(xì)胞、機(jī)體、活 性物質(zhì)損傷小。性物質(zhì)損傷小。 由于環(huán)氧基、氯甲基功能基團(tuán)非常活躍，由于環(huán)氧基、氯甲基功能基團(tuán)非?；钴S， 不需連接其他活性基團(tuán)即可與生物配基不需連接其他活性基團(tuán)即可與生物配基 （如抗體、抗原等）偶聯(lián)，及其他基團(tuán)的（如抗

6、體、抗原等）偶聯(lián)，及其他基團(tuán)的 微型磁珠在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用較為廣微型磁珠在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用較為廣 泛。泛。 磁性微球制備方法：共沉淀法、懸浮聚合 法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合法等。 1.共沉淀法共沉淀法 金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應(yīng)生成磁性高分子微球的方法。金屬離子在堿性條件下與高分子共沉淀，一步反應(yīng)生成磁性高分子微球的方法。 2Fe2Fe3+ 3+ Fe + Fe2+ 2+8OH +8OHFeFe3 3O O4 4+4H+4H2 2O O Pich Pich等先通過(guò)單體聚合反應(yīng)得到等先通過(guò)單體聚合反應(yīng)得到PS-AAEMPS-AAEM顆粒分散

7、劑，再把配制好的顆粒分散劑，再把配制好的Fe3+Fe3+、Fe2+Fe2+ 溶液加入聚苯乙烯（溶液加入聚苯乙烯（PSPS）- -乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（乙酰乙酸基甲基丙烯酸乙酯（AAEMAAEM）顆粒的分散劑中，）顆粒的分散劑中， 然后滴加然后滴加NHNH3 3HH2 2O O。FeFe3 3O O4 4 粒子在粒子在PS-AAEM PS-AAEM 表面沉積，制得表面沉積，制得PS-AAEMPS-AAEM為核心、為核心、 Fe3O4 Fe3O4 粒子為殼層的磁性微球。微球的磁性能通過(guò)改變粒子為殼層的磁性微球。微球的磁性能通過(guò)改變FeClFeCl2 2 和和FeClFeCl3 3 的濃度或改變

8、的濃度或改變 PS-AAEM PS-AAEM 核心的尺寸來(lái)控制。核心的尺寸來(lái)控制。Xia Xia 等把一定配比的等把一定配比的FeClFeCl2 2、FeClFeCl3 3 與葡聚糖（與葡聚糖（dextran dextran T-10T-10）共混，然后滴加）共混，然后滴加NHNH3 3HH2 2O O，在超聲連續(xù)作用下水浴加熱，制得以，在超聲連續(xù)作用下水浴加熱，制得以FeFe3 3O O4 4 為為 核、核、dextran dextran 為殼的磁性微球。楊玉東等把一定配比的為殼的磁性微球。楊玉東等把一定配比的FeClFeCl3 36H6H2 2O O、FeClFeCl2 26H6H2 2O

9、 O 與配體（如二亞乙基三胺五乙酸（與配體（如二亞乙基三胺五乙酸（DTPADTPA）或乙二氨四乙酸（）或乙二氨四乙酸（EDTAEDTA）等）組成的）等）組成的 混合液體加入到混合液體加入到7575的葡聚糖的葡聚糖T-10 T-10 溶液中，并快速滴加溶液中，并快速滴加NHNH3 3HH2 2O O，制備了葡聚糖，制備了葡聚糖 為殼、氧化鐵為核的磁性微球。為殼、氧化鐵為核的磁性微球。 異相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、懸浮液聚合三種。該法是異相聚合法包括分散聚合、乳液聚合、懸浮液聚合三種。該法是 將磁性粒子用表面改性劑、偶聯(lián)劑、引發(fā)劑等處理后分散到含有將磁性粒子用表面改性劑、偶聯(lián)劑、引發(fā)劑等處理

10、后分散到含有 聚合物單體的溶劑中進(jìn)行聚合反應(yīng)。通常以磁性粒子為活性中心聚合物單體的溶劑中進(jìn)行聚合反應(yīng)。通常以磁性粒子為活性中心 進(jìn)行單體聚合。進(jìn)行單體聚合。 是將免疫學(xué)免疫學(xué)+ +細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞生物學(xué)+ +磁力學(xué)結(jié)合為一體，磁力學(xué)結(jié)合為一體，利用磁性微球表面功能基團(tuán) 的專一親和特性或多孔吸附特性吸附特定組分，然后用外力磁場(chǎng)作用將吸 附了特定物質(zhì)的磁珠加以分離，再經(jīng)過(guò)洗脫磁珠上吸附的目標(biāo)物質(zhì)的一種 新型分離技術(shù)，具有廣泛的用途。 幾種幾種 DNA 分離方法的比較分離方法的比較 Comparation of several DNA extraction methods 方法方法 傳統(tǒng)法傳統(tǒng)法鰲合樹(shù)

11、脂法鰲合樹(shù)脂法玻璃粉法玻璃粉法磁珠法磁珠法免疫親和法免疫親和法 DNA 提取提取 酚酚 / 氯仿等氯仿等 溶劑抽提溶劑抽提 Chelex 100 樹(shù)脂樹(shù)脂 吸附吸附 玻璃粉吸附玻璃粉吸附 離心分離離心分離 磁珠吸附磁珠吸附 磁場(chǎng)分離磁場(chǎng)分離 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 磁場(chǎng)分離磁場(chǎng)分離 適用范圍適用范圍 大多數(shù)標(biāo)本大多數(shù)標(biāo)本 DNA 提取純化提取純化 培養(yǎng)及培養(yǎng)及 各種臨床標(biāo)本各種臨床標(biāo)本 土壤標(biāo)本土壤標(biāo)本冰凍、陳舊組織冰凍、陳舊組織 冰凍、陳舊組織，冰凍、陳舊組織， 樣本含量很少的標(biāo)樣本含量很少的標(biāo) 本本 方法評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià) DNA 純度高、含純度高、含 量多，但較費(fèi)時(shí)，量多，但較費(fèi)時(shí)， 步驟繁

12、瑣，用有步驟繁瑣，用有 機(jī)溶劑，有損操機(jī)溶劑，有損操 作者健康。作者健康。 可用于培養(yǎng)標(biāo)本可用于培養(yǎng)標(biāo)本 和各種臨床標(biāo)本和各種臨床標(biāo)本 細(xì)菌及部分病毒細(xì)菌及部分病毒 核酸的提取。核酸的提取。 方法簡(jiǎn)便，可用于方法簡(jiǎn)便，可用于 土壤中細(xì)菌芽孢土壤中細(xì)菌芽孢 DNA 的提取，不能的提取，不能 徹底除去徹底除去PCR抑制抑制 劑。劑。 簡(jiǎn)單、快速，整簡(jiǎn)單、快速，整 個(gè)過(guò)程不到個(gè)過(guò)程不到 2h ， 可獲得較純可獲得較純 DNA 。 適于少適于少 量樣本。量樣本。 DNA 純度高，含量純度高，含量 多，適于樣本含量多，適于樣本含量 少標(biāo)本，單克隆抗少標(biāo)本，單克隆抗 體的制備是關(guān)鍵。體的制備是關(guān)鍵。 9、

13、 人的價(jià)值，在招收誘惑的一瞬間被決定。21.8.1321.8.13Friday, August 13, 2021 10、低頭要有勇氣，抬頭要有低氣。22:51:2222:51:2222:518/13/2021 10:51:22 PM 11、人總是珍惜為得到。21.8.1322:51:2222:51Aug-2113-Aug-21 12、人亂于心，不寬余請(qǐng)。22:51:2222:51:2222:51Friday, August 13, 2021 13、生氣是拿別人做錯(cuò)的事來(lái)懲罰自己。21.8.1321.8.1322:51:2222:51:22August 13, 2021 14、抱最大的希望，作最

14、大的努力。2021年8月13日星期五下午10時(shí)51分22秒22:51:2221.8.13 15、一個(gè)人炫耀什么，說(shuō)明他內(nèi)心缺少什么。2021年8月下午10時(shí)51分21.8.1322:51August 13, 2021 16、業(yè)余生活要有意義，不要越軌。2021年8月13日星期五22時(shí)51分22秒22:51:2213 August 2021 17、一個(gè)人即使已登上頂峰，也仍要自強(qiáng)不息。下午10時(shí)51分22秒下午10時(shí)51分22:51:2221.8.13 免疫磁珠（免疫磁珠（IMBIMB）也稱免疫磁性微球，）也稱免疫磁性微球， 是在磁性微球表面偶聯(lián)上免疫配基的一是在磁性微球表面偶聯(lián)上免疫配基的一

15、種磁性微球，是將磁性微球技術(shù)和免疫種磁性微球，是將磁性微球技術(shù)和免疫 學(xué)相結(jié)合的特殊磁性微球。學(xué)相結(jié)合的特殊磁性微球。 免疫磁珠核心為順磁性粒子，核心外層包免疫磁珠核心為順磁性粒子，核心外層包 裹一層高分子材料，裹一層高分子材料， 最外層是免疫配基。最外層是免疫配基。 免疫配基免疫配基 免疫配基通過(guò)生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球免疫配基通過(guò)生物高分子的功能基團(tuán)結(jié)合到磁性載體微球 上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其上形成免疫磁珠。由于載體微球制備材料和方法不同，其 表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同，表現(xiàn)出的物理性質(zhì)也不同， 從而可結(jié)合不同的免疫配基，從而可結(jié)合不同的免疫配基， 如抗

16、原、抗體、凝集素、如抗原、抗體、凝集素、DNA 和和RNA 等。配基必須具有等。配基必須具有 生物專一性的特點(diǎn)，生物專一性的特點(diǎn)， 而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或而且載體微球與配基結(jié)合要不影響或 改變配基原有的生物學(xué)特性，改變配基原有的生物學(xué)特性， 保證磁珠的特殊識(shí)別功能。保證磁珠的特殊識(shí)別功能。 具有均勻性、超順磁性及保護(hù)性外殼，由磁性載體微球和免疫具有均勻性、超順磁性及保護(hù)性外殼，由磁性載體微球和免疫 配基結(jié)合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。配基結(jié)合而成，表面具有專一親和性和吸附作用。 免疫磁珠大小和形狀具有均一性，免疫磁珠大小和形狀具有均一性， 可使靶物質(zhì)迅速有效地結(jié)合可使靶物質(zhì)迅

17、速有效地結(jié)合 到磁珠上，可使新生成復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同磁響應(yīng)性，且到磁珠上，可使新生成復(fù)合物在磁場(chǎng)中具有相同磁響應(yīng)性，且 行為一致。行為一致。 磁珠球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子間的非特異性結(jié)合，順磁珠球形結(jié)構(gòu)可消除與不規(guī)則形狀粒子間的非特異性結(jié)合，順 磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)，磁性可使磁珠置于磁場(chǎng)時(shí)顯示其磁性，并做定向移動(dòng)， 從磁場(chǎng)從磁場(chǎng) 移出時(shí)磁性消除，移出時(shí)磁性消除， 磁珠分散，磁珠分散， 可方便地進(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向?？煞奖愕剡M(jìn)行分離和磁性導(dǎo)向。 保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕；保護(hù)性殼可防止磁性內(nèi)核漏出或被載液腐蝕； 免疫配基可專一性結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的

18、抗原、抗體、核酸等免疫配基可專一性結(jié)合反應(yīng)體系中相應(yīng)的抗原、抗體、核酸等 生物活性物質(zhì)。生物活性物質(zhì)。 磁性微球與免疫配基結(jié)合牢固。磁性微球與免疫配基結(jié)合牢固。 不影響或改變免疫配基原有的生物特性和不影響或改變免疫配基原有的生物特性和 特異性。特異性。 免疫微球的識(shí)別專一性。免疫微球的識(shí)別專一性。 在磁場(chǎng)中具有順磁性，離開(kāi)磁場(chǎng)磁性消失，在磁場(chǎng)中具有順磁性，離開(kāi)磁場(chǎng)磁性消失， 易于分散易于分散。 由于聚苯乙烯磁性微球強(qiáng)度高、表面易進(jìn)行化學(xué)維修飾，是由于聚苯乙烯磁性微球強(qiáng)度高、表面易進(jìn)行化學(xué)維修飾，是 比較理性的制造免疫磁珠的材料。比較理性的制造免疫磁珠的材料。 根據(jù)磁珠在磁場(chǎng)中受力大小及磁珠體積

19、，分為小 磁珠和大磁珠。 大磁珠：1-5um，粒徑較大、懸浮穩(wěn)定性差、易 沉淀、比表面積小、吸附能力低、吸附活性配基 少、對(duì)細(xì)胞影響大，特別是陽(yáng)性分選時(shí)需將磁珠 與細(xì)胞解離后方可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。但磁力強(qiáng)， 無(wú)需特殊分離柱即可實(shí)現(xiàn)樣品分離，分離速度快、 過(guò)程簡(jiǎn)單、成本低。 小磁珠：50nm以下，粒徑較小、懸浮穩(wěn)定、比 表面積大、表面吸附活性配基多，只有細(xì)胞體積 的萬(wàn)分之一，對(duì)細(xì)胞表型和功能影響小，不影響 細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng)。但磁力弱，需特殊分離柱才能 實(shí)現(xiàn)樣品分離，分離速度慢，成本高 免疫磁珠的制備是將磁性微球和抗體等配基結(jié)合而成。磁性 微球與抗體的連接方式有共價(jià)結(jié)合和吸附結(jié)合兩種方式。 共價(jià)結(jié)合：

20、共價(jià)結(jié)合：依靠磁珠表面的活性基團(tuán)如-CHO、-COOH等與 抗體Fab段上的-NH2共價(jià)反應(yīng)和結(jié)合 吸附結(jié)合：吸附結(jié)合：依靠磁珠巨大的比表面與抗體見(jiàn)得非特異性吸附 而結(jié)合。 共價(jià)結(jié)合的牢固度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸附結(jié)合牢固度。共價(jià)結(jié)合的牢固度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于吸附結(jié)合牢固度。 制備方法：制備方法：先制備磁性微球，然后將磁性微球分散于抗體配 機(jī)溶液中使磁珠與抗體充分吸附結(jié)合，然后分離免疫磁珠分 散于緩沖溶液中可以使用。 免疫磁珠免疫磁珠( immunomagnetic bead, IMB)分離技分離技 術(shù)：術(shù)：是一種以特異的抗原抗體反應(yīng)為基礎(chǔ)的免疫 學(xué)磁性微球檢測(cè)和分離技術(shù)。它是以抗體包被的 微球磁珠為載體，通過(guò)抗體

21、與反應(yīng)介質(zhì)中特異性 抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，此復(fù)合物在 外加磁場(chǎng)作用下發(fā)生定向移動(dòng)，從而達(dá)到分離抗 原的目的。 基本原理：磁性微球經(jīng)過(guò)一定處理后基本原理：磁性微球經(jīng)過(guò)一定處理后, ,將抗將抗 體結(jié)合到磁珠上體結(jié)合到磁珠上, ,形成免疫磁性微球（標(biāo)記形成免疫磁性微球（標(biāo)記 磁珠）磁珠）, ,標(biāo)記磁珠的抗體與特異性抗原結(jié)合標(biāo)記磁珠的抗體與特異性抗原結(jié)合 形成抗原形成抗原微球復(fù)合物微球復(fù)合物, ,該復(fù)合物在磁場(chǎng)中該復(fù)合物在磁場(chǎng)中 具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性具有與其它組分不同的磁響應(yīng)性, ,在磁力作在磁力作 用下用下, ,該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng)該復(fù)合物發(fā)生力學(xué)移動(dòng), ,從而達(dá)到分離從而達(dá)到分離

22、抗原的目的?？乖哪康?。 1 1 直接磁珠和直接標(biāo)記法直接磁珠和直接標(biāo)記法 通過(guò)物理吸附和共價(jià)鍵結(jié)合直接將特意性抗體與磁珠耦合，然后再與相應(yīng)通過(guò)物理吸附和共價(jià)鍵結(jié)合直接將特意性抗體與磁珠耦合，然后再與相應(yīng) 細(xì)胞結(jié)合，形成細(xì)胞細(xì)胞結(jié)合，形成細(xì)胞- -抗原抗原- -抗體抗體- -磁珠復(fù)合物，在外磁場(chǎng)下直接分離目的磁珠復(fù)合物，在外磁場(chǎng)下直接分離目的 細(xì)胞?？焖?、簡(jiǎn)單、特異性和細(xì)胞得率高，靈敏度低，需制備相應(yīng)的偶細(xì)胞?？焖佟⒑?jiǎn)單、特異性和細(xì)胞得率高，靈敏度低，需制備相應(yīng)的偶 聯(lián)抗體磁珠。聯(lián)抗體磁珠。 2 2 簡(jiǎn)介磁珠和間接標(biāo)記法簡(jiǎn)介磁珠和間接標(biāo)記法 使用使用anti-lganti-lg等與磁珠偶聯(lián)，通

23、過(guò)等與磁珠偶聯(lián)，通過(guò)Anti-lgAnti-lg再使磁珠與二抗體偶聯(lián)，分離細(xì)胞時(shí)，再使磁珠與二抗體偶聯(lián)，分離細(xì)胞時(shí)， 先使細(xì)胞與一抗特異性結(jié)合，然后在與一抗標(biāo)記磁珠結(jié)合，形成細(xì)胞先使細(xì)胞與一抗特異性結(jié)合，然后在與一抗標(biāo)記磁珠結(jié)合，形成細(xì)胞-1 -1 抗抗-2 -2抗抗-anti-lg-anti-lg-磁珠復(fù)合體，在外磁場(chǎng)下分離目的細(xì)胞的方法。該法增加磁珠復(fù)合體，在外磁場(chǎng)下分離目的細(xì)胞的方法。該法增加 了細(xì)胞的洗滌步驟，特異性也會(huì)降低。該法一般用于沒(méi)有直標(biāo)磁珠抗了細(xì)胞的洗滌步驟，特異性也會(huì)降低。該法一般用于沒(méi)有直標(biāo)磁珠抗 體需用幾種抗體去除多種細(xì)胞目的細(xì)胞上特異性抗原分子表達(dá)水平體需用幾種抗體去

24、除多種細(xì)胞目的細(xì)胞上特異性抗原分子表達(dá)水平 低。低。 直標(biāo)微珠直標(biāo)微珠 多選微珠多選微珠 間標(biāo)微珠間標(biāo)微珠 陽(yáng)性分選：陽(yáng)性分選：運(yùn)用特異性抗體偶聯(lián)磁珠直接從細(xì)胞混合物中分離目的細(xì)胞的 分選方法稱為positive selection. 陽(yáng)性分選中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞即為目的細(xì)胞。 該法簡(jiǎn)單、快速、細(xì)胞得率和純度較高。如采用anti-CD14磁珠分選CD14+ 巨噬細(xì)胞。 陰性分選：陰性分選：用抗體偶聯(lián)磁珠去除無(wú)關(guān)細(xì)胞，使目的細(xì)胞得以純化和分離的 分選方法稱為negative selection.陰性分選中磁珠標(biāo)記的細(xì)胞為非目的細(xì)胞。 如分離CD4+T細(xì)胞時(shí)，由于沒(méi)有專用的CD4+T細(xì)胞分選磁珠，可通

25、過(guò)anti- CD8、 anti-B220、 anti-CD49b、 anti-CD11b、 anti-Ter119標(biāo)記磁珠去除 CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等，最終而 獲得較純的CD4+T細(xì)胞。因此陰性分選法適用于：從細(xì)胞混合物中去除 某種類型細(xì)胞。如腫瘤細(xì)胞。缺乏針對(duì)目的細(xì)胞篩選的特異性抗體磁珠 時(shí)。抗體和目的細(xì)胞結(jié)合可能誘導(dǎo)細(xì)胞活化，影響后續(xù)細(xì)胞功能分析時(shí)。 復(fù)合分選：復(fù)合分選：將陰性分選和陽(yáng)性分選相結(jié)合的分選方法。當(dāng)目的細(xì)胞含量特 別低，無(wú)法直接進(jìn)行陽(yáng)性分選時(shí)，可采用陰性分選發(fā)先出去其他雜細(xì)胞， 當(dāng)目的細(xì)胞富集到一定程度時(shí)在采用陽(yáng)性分選發(fā)篩選目的細(xì)胞。

26、1 1 過(guò)夜培養(yǎng)法：過(guò)夜培養(yǎng)法：常用方法。將結(jié)合磁珠細(xì)常用方法。將結(jié)合磁珠細(xì) 胞置于胞置于10%10%胎牛血清培養(yǎng)基中胎牛血清培養(yǎng)基中 375%CO375%CO2 2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24h16-24h， 磁珠可從細(xì)胞上脫落，再通過(guò)磁場(chǎng)除去磁珠可從細(xì)胞上脫落，再通過(guò)磁場(chǎng)除去 游離磁珠，即可獲得裸細(xì)胞。游離磁珠，即可獲得裸細(xì)胞。 2 anti-Fab2 anti-Fab抗體法：抗體法：用用anti-Fabanti-Fab抗體與磁珠抗體與磁珠 偶聯(lián)抗體競(jìng)爭(zhēng)目的細(xì)胞，是磁珠與目的偶聯(lián)抗體競(jìng)爭(zhēng)目的細(xì)胞，是磁珠與目的 細(xì)胞解離，用磁場(chǎng)除去游離磁珠，即可細(xì)胞解離，用磁場(chǎng)除去游離磁珠，即

27、可 獲得非標(biāo)記細(xì)胞。獲得非標(biāo)記細(xì)胞。 3 3 酶解法：酶解法：通過(guò)木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶通過(guò)木瓜蛋白酶和唾液蛋白酶 使磁珠與細(xì)胞解離，再通過(guò)磁場(chǎng)除去游使磁珠與細(xì)胞解離，再通過(guò)磁場(chǎng)除去游 離磁珠，獲得裸細(xì)胞。離磁珠，獲得裸細(xì)胞。 免疫磁珠分離裝置由超強(qiáng)磁鐵分離器和分免疫磁珠分離裝置由超強(qiáng)磁鐵分離器和分 離柱組成。磁鐵和分離柱的型號(hào)多樣，配合離柱組成。磁鐵和分離柱的型號(hào)多樣，配合 0.5ml0.5ml、1.5ml1.5ml微量離心管，微量離心管，15ml15ml及及50ml50ml離心離心 管或試管，和管或試管，和9696孔或孔或384384孔培養(yǎng)板中樣品的孔培養(yǎng)板中樣品的 分離分離 ，以滿足不同

28、試驗(yàn)要求。，以滿足不同試驗(yàn)要求。 分離抗原抗體分離抗原抗體 分離蛋白和多肽分離蛋白和多肽 分離多糖物質(zhì)分離多糖物質(zhì) 分離分離DNA和和RNA 分離細(xì)胞和病毒分離細(xì)胞和病毒 靶向釋藥系統(tǒng)的載運(yùn)靶向釋藥系統(tǒng)的載運(yùn) 食品有害微生物分析與檢測(cè)食品有害微生物分析與檢測(cè) 磁珠法分離抗體、抗磁珠法分離抗體、抗 原、蛋白、多肽、多原、蛋白、多肽、多 糖、糖、DNA、RNA操作操作 過(guò)程示意圖過(guò)程示意圖 MACS Vitalvirus HivMACS Vitalvirus Hiv分離試劑盒分離標(biāo)記造分離試劑盒分離標(biāo)記造 血細(xì)胞表面的血細(xì)胞表面的Hiv-1Hiv-1病毒病毒CD44HCD44H異型細(xì)胞異型細(xì)胞 免

29、疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞示意圖免疫磁珠標(biāo)記細(xì)胞示意圖 免疫磁珠分離細(xì)胞及病毒示意圖免疫磁珠分離細(xì)胞及病毒示意圖 十二十二 免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用免疫磁珠在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用 免疫磁珠對(duì)病毒細(xì)胞具有特異選擇性，因此能免疫磁珠對(duì)病毒細(xì)胞具有特異選擇性，因此能 用于食品有害微生物的檢測(cè)。用于食品有害微生物的檢測(cè)。 免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有檢測(cè)迅免疫磁珠技術(shù)與常規(guī)檢驗(yàn)方法相比具有檢測(cè)迅 速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景速、有選擇性分離目的微生物，有效減少背景 干擾，提高了精準(zhǔn)性。同時(shí)還能捕獲受損傷靶干擾，提高了精準(zhǔn)性。同時(shí)還能捕獲受損傷靶 細(xì)菌。目前，免疫磁珠技術(shù)已廣泛用于食品樣細(xì)菌

30、。目前，免疫磁珠技術(shù)已廣泛用于食品樣 品中致病微生物的檢測(cè)。品中致病微生物的檢測(cè)。 傳統(tǒng)分離傳統(tǒng)分離E.coli O157H7E.coli O157H7所采用的直接分離法存在著鑒別力差、所采用的直接分離法存在著鑒別力差、 抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。抑制雜菌能力弱、耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大等缺點(diǎn)。 采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集采用免疫磁珠技術(shù)，能夠快速地從各種食品樣品中分離富集E.coli E.coli O157H7O157H7，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。，滿足流行病學(xué)的研究要求和提高控制力度。 現(xiàn)在這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國(guó)公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定現(xiàn)在

31、這種免疫磁珠的方法已經(jīng)被英國(guó)公共健康服務(wù)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)定 為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國(guó)也已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌為標(biāo)準(zhǔn)的分離方法，我國(guó)也已將免疫磁珠法對(duì)大腸桿菌O157O157的檢的檢 測(cè)納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（測(cè)納入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 4789.36-2022GB/T 4789.36-2022）和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)）和出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn)(SN/T 1059.5-2022)(SN/T 1059.5-2022)。已有市售的專用免疫磁珠銷售。已有市售的專用免疫磁珠銷售。 檢樣檢樣 25g(mL)+225mL改良改良EC肉湯（肉湯（mEC+n），均質(zhì)），均質(zhì)225mL 免疫磁珠捕獲免疫磁珠捕獲 涂布涂布CT-S

32、MAC平板和改良平板和改良CHROMagar O157弧菌顯色瓊脂平板弧菌顯色瓊脂平板 挑取可疑菌落挑取可疑菌落5個(gè)個(gè)10個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種個(gè)，氧化酶陰性，革蘭氏陰性桿菌接種TSI MUG-LST 陽(yáng)性陽(yáng)性 GB/T 4789.36-2022 GB/T 4789.36-2022 免疫磁珠捕獲法檢測(cè)免疫磁珠捕獲法檢測(cè)O157H7O157H7程序程序 陰性陰性 血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn) 非非O157細(xì)菌細(xì)菌 生化試驗(yàn)生化試驗(yàn) 報(bào)告報(bào)告 36 1oC18h24h 36 1oC 36 1oC18h24h 18h24h 1 1增菌增菌 2 2免疫磁珠捕獲與分離免疫磁珠捕獲與分離 1. 1.將

33、將EppendorffEppendorff管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用管按樣品和質(zhì)控菌株進(jìn)行編號(hào)，每個(gè)樣品使用1 1 支支EppendorffEppendorff管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕管，然后插人到磁板架上。在漩渦混合器上輕輕 振蕩振蕩E. coli O157E. coli O157免疫磁珠溶液后，用開(kāi)蓋器打開(kāi)每支免疫磁珠溶液后，用開(kāi)蓋器打開(kāi)每支Eppendo Eppendo - rff- rff管的蓋子，每管加人管的蓋子，每管加人20 L E. coli 015720 L E. coli 0157免疫磁珠懸液。免疫磁珠懸液。 2. 2.取取mEC+nmEC+n

34、肉湯增菌培養(yǎng)物肉湯增菌培養(yǎng)物1 mL1 mL，加人到，加人到EppendorffEppendorff管中，蓋管中，蓋 上蓋子，然后輕微振蕩上蓋子，然后輕微振蕩10 s10 s。每個(gè)樣品更換。每個(gè)樣品更換1 1支加樣吸頭，質(zhì)支加樣吸頭，質(zhì) 控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行，避免交叉污染控菌株必須與樣品分開(kāi)進(jìn)行，避免交叉污染。 具體操作具體操作 3. 3.結(jié)合結(jié)合: : 在在18183030環(huán)境中，將上述環(huán)境中，將上述EppendorffEppendorff管連同磁板架放在管連同磁板架放在Dynal Dynal MXlMXl樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)樣品混合器上轉(zhuǎn)動(dòng)或用手輕微轉(zhuǎn)10 min10 min，

35、使，使E. coli O157E. coli O157與免疫磁珠充與免疫磁珠充 分接觸。分接觸。 4. 4.捕獲捕獲: :將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在將磁板插人到磁板架中濃縮磁珠。在3 min3 min內(nèi)不斷地傾斜磁板架，內(nèi)不斷地傾斜磁板架， 確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來(lái)，此時(shí)，在確保懸液中與蓋子上的免疫磁珠全部被收集起來(lái)，此時(shí)，在EppendorffEppendorff 管壁中間明顯可見(jiàn)圓形或橢圓形棕色聚集物。管壁中間明顯可見(jiàn)圓形或橢圓形棕色聚集物。 5. 5.吸取上清液吸取上清液: :取取1 1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集物對(duì)側(cè)深人液面，輕支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管，從免疫磁珠聚集

36、物對(duì)側(cè)深人液面，輕 輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過(guò)免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確輕吸走上清液。當(dāng)吸到液面通過(guò)免疫磁珠聚集物時(shí)，應(yīng)放慢速度，以確 保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液內(nèi)含有磁珠，則應(yīng)將其放回到 EppendorffEppendorff管中，并重復(fù)管中，并重復(fù)4 4步驟。每個(gè)樣品換用步驟。每個(gè)樣品換用1 1支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管。支無(wú)菌加長(zhǎng)吸管。 6. 6.洗滌洗滌: :洗滌免疫磁珠混合物，重復(fù)上述步驟洗滌免疫磁珠混合物，重復(fù)上述步驟 4 6 4 6 和和4 5 4 5 。 7. 7.免疫磁珠懸浮免疫磁珠懸浮: :將免疫磁珠重新懸

37、浮在將免疫磁珠重新懸浮在100 L PBS-Tween 20100 L PBS-Tween 20洗洗 液中。液中。 8. 8.涂布平板涂布平板: :用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取用漩渦混合器將免疫磁珠混勻，用加樣器各取50 L50 L 免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至免疫磁珠懸液分別轉(zhuǎn)移至CT-SMACCT-SMAC平板和改良平板和改良CHROMagar CHROMagar O157O157弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，再用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂弧菌顯色瓊脂平板一側(cè)，再用無(wú)菌涂布棒將免疫磁珠涂 布平板的一半，用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表布平板的一半，用接種環(huán)劃線接種平板的另一半。待瓊脂表 面

38、水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于面水分完全吸收后，翻轉(zhuǎn)平板，于3636士士1 01 0培養(yǎng)培養(yǎng)18 -24 h 18 -24 h 。 菌落識(shí)別菌落識(shí)別 在在CT-SMACCT-SMAC平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無(wú)平板上，典型菌落為不發(fā)酵山梨醇的圓形、光滑、較小的無(wú) 色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色色菌落，中心呈現(xiàn)較暗的灰褐色; ;發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色發(fā)酵山梨醇的菌落為紅色; ;在改在改 CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫弧菌顯色瓊脂平板上為圓形、較小的菌落，中心呈淡紫 色一紫紅色，邊緣無(wú)色或淺灰色。色一紫紅色，

39、邊緣無(wú)色或淺灰色。 初步生化試驗(yàn)初步生化試驗(yàn): : 在在CT-SMACCT-SMAC和改良和改良CHROMagarO157CHROMagarO157弧菌顯色瓊脂平板上挑取弧菌顯色瓊脂平板上挑取5 5個(gè)個(gè)1010個(gè)個(gè) 典型或可疑菌落，分別接種典型或可疑菌落，分別接種TSITSI瓊脂，同時(shí)接種瓊脂，同時(shí)接種MUG-LSTMUG-LST肉湯，于肉湯，于3636士士 11培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在。必要時(shí)進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)和革蘭氏染色。在TSITSI瓊脂中，瓊脂中， 典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化典型菌株為斜面與底層均呈陽(yáng)性反應(yīng)

40、呈黃色，產(chǎn)氣或不產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化 氫氫(H2S)(H2S)。置。置MUG-LSTMUG-LST肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，無(wú)熒光產(chǎn)生者為陽(yáng)性肉湯管于長(zhǎng)波紫外燈下觀察，無(wú)熒光產(chǎn)生者為陽(yáng)性 結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果結(jié)果，有熒光產(chǎn)生者為陰性結(jié)果; ;對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊對(duì)分解乳糖且無(wú)熒光的菌株，在營(yíng)養(yǎng)瓊 脂平板上分純，于脂平板上分純，于3636士士11培養(yǎng)培養(yǎng)18h24h18h24h，并進(jìn)行鑒定。，并進(jìn)行鑒定。 FratamicoFratamico等將兔抗等將兔抗E.coli O157H7E.coli O157H7多克隆抗體連接到羊抗兔多克隆抗體連接到羊抗兔 IgGIgG包被的磁珠上

41、，從食物增菌培養(yǎng)液中分離包被的磁珠上，從食物增菌培養(yǎng)液中分離O157H7O157H7菌株，菌株， 再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的再將帶菌的磁珠接種到培養(yǎng)基上，加入熒光素標(biāo)記的 O157H7O157H7抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為抗血清，在熒光顯微鏡下觀察，此法敏感性為 10cfu/mL10cfu/mL增菌培養(yǎng)液。增菌培養(yǎng)液。 DecoryDecory等建立了免疫磁珠等建立了免疫磁珠- -免疫脂質(zhì)體（免疫脂質(zhì)體（IMB/ILIMB/IL）熒光試驗(yàn)方）熒光試驗(yàn)方 法，可在法，可在8h8h內(nèi)快速檢測(cè)出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、蘋果內(nèi)快速檢測(cè)出多種液態(tài)樣品（水樣、蘋果汁、

42、蘋果 酒）中低至酒）中低至1cfu/mL1cfu/mL的的E. coli O157H7E. coli O157H7，而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法，而傳統(tǒng)微生物學(xué)方法 不能從陰性樣本中區(qū)分出不能從陰性樣本中區(qū)分出E. coli O157H7E. coli O157H7感染樣本。感染樣本。 傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約傳統(tǒng)的單增李斯特菌檢測(cè)方法檢測(cè)周期長(zhǎng)，約514d，步驟，步驟 繁瑣且靈敏度低，而繁瑣且靈敏度低，而IMB技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于在較低的菌液濃度 時(shí)也可以通過(guò)免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí)時(shí)也可以通過(guò)免疫磁珠的富集作用進(jìn)行檢測(cè)，縮短了檢測(cè)時(shí) 間并進(jìn)一步

43、降低了單增李斯特菌的檢測(cè)限。間并進(jìn)一步降低了單增李斯特菌的檢測(cè)限。 2022年，我國(guó)將免疫磁珠檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法年，我國(guó)將免疫磁珠檢測(cè)單核細(xì)胞增生李斯特菌的方法 納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中納入了出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中(SN/T 0184.3-2022)。 檢樣檢樣25g(mL) 對(duì)對(duì)225mLFB1増菌液（増菌液（3030 士士1 ，24h24h士士1h1h） 1mL轉(zhuǎn)種轉(zhuǎn)種10mL FB2増菌液（増菌液（ 35 35 ，24h24h士士1h1h） 通過(guò)免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌通過(guò)免疫磁珠捕獲李斯特菌，然后再用滅菌緩沖液洗滌 用用0.1mL的滅菌緩沖液重新

44、制成懸液的滅菌緩沖液重新制成懸液 吸取吸取50uL免疫磁珠懸液劃線于免疫磁珠懸液劃線于CHROMagar 顯色培養(yǎng)基，顯色培養(yǎng)基， OXA/PALCAM瓊脂平板（瓊脂平板（35 +1 ,24h28h) 各挑選各挑選5個(gè)典型菌落個(gè)典型菌落 接種于接種于TSA-YE瓊脂平板，純培養(yǎng)瓊脂平板，純培養(yǎng) 鑒定和確認(rèn)試驗(yàn)鑒定和確認(rèn)試驗(yàn) 單增李斯特菌的檢測(cè)程序與方法單增李斯特菌的檢測(cè)程序與方法 1 1樣品制備樣品制備 2 2增菌增菌 3 3免疫磁珠分離免疫磁珠分離(IMS(IMS） 1) 1)免疫捕獲免疫捕獲 混增菌培養(yǎng)液混增菌培養(yǎng)液. .沉淀所有的粗糙食物殘?jiān)恋硭械拇植谑澄餁堅(jiān)? .從增菌培養(yǎng)液中移取

45、從增菌培養(yǎng)液中移取1mL1mL上層液體上層液體 ( (要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒要盡可能避免移取到食物顆粒和脂肪顆粒) )加人加人EppendorfEppendorf管中管中. .加加20L20L準(zhǔn)備準(zhǔn)備 好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液好的免疫磁珠。在旋渦混合器上混合該懸液。 2 2）分離）分離 將將EppendorfEppendorf管固定在磁架的管孔中。管固定在磁架的管孔中。1801800 0輕緩擺動(dòng)磁架輕緩擺動(dòng)磁架5 5次次-6-6次次, ,使免疫磁使免疫磁 珠聚集到磁極。小心地打開(kāi)磁架上的珠聚集到磁極。小心地打開(kāi)磁架上的EppendorfEppendorf管管蓋管管蓋

46、, ,從磁極對(duì)面一側(cè)慢從磁極對(duì)面一側(cè)慢 慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭慢吸出液體，注意不要接觸管壁上的磁珠。每一個(gè)樣品換一次槍頭; ;加加1mI1mI 滅菌的滅菌的PBSPBS，并重新蓋好蓋子，并重新蓋好蓋子. .將磁極從支架上移走，將磁極從支架上移走，1801800 0輕緩擺動(dòng)磁架輕緩擺動(dòng)磁架5 5次次 一一6 6次次, ,使管內(nèi)各成分混合使管內(nèi)各成分混合, ,后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾后重新將磁極放回到支架上。重復(fù)該清洗步驟幾 次。將離心管從磁性分離器上移開(kāi)次。將離心管從磁性分離器上移開(kāi). .并加并加100L100L滅菌的滅菌的PBSPBS到管中

47、，重懸磁到管中，重懸磁 珠。如實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有磁性分離器，可以用手搖代替珠。如實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有磁性分離器，可以用手搖代替. . 4. 4.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng) 1 1）分離培養(yǎng)）分離培養(yǎng) 吸取吸取50L50L免疫磁珠懸液免疫磁珠懸液. .加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基加到顯色培養(yǎng)基及任一選擇性培養(yǎng)基OXAOXA、 PALCAMPALCAM瓊脂平板上瓊脂平板上. .用無(wú)菌接種環(huán)劃線用無(wú)菌接種環(huán)劃線.35.35士士11培養(yǎng)培養(yǎng)22h-48h22h-48h。 2 2）篩選）篩選 李斯特氏菌在李斯特氏菌在CHROMagarCHROMagar顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色顯色培養(yǎng)基上菌落為藍(lán)色. .且在其周圍形成一且在其周圍

48、形成一 個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在個(gè)暈環(huán)。李斯特氏菌在OXAOXA瓊脂平板上生長(zhǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)22h22h后菌落呈現(xiàn)黑色后菌落呈現(xiàn)黑色. .直徑為直徑為 1mm.1mm.在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)。培養(yǎng)在其周圍形成一個(gè)黑色環(huán)。培養(yǎng)48h48h，菌落仍呈黑色，菌落仍呈黑色. .直徑直徑2mm-2mm- 3mm.3mm.除在菌落周圍有一環(huán)外除在菌落周圍有一環(huán)外. .在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特在菌落中心部位的深層也形成黑點(diǎn)。李斯特 氏菌在氏菌在PALCAMPALCAM瓊脂平板上與在瓊脂平板上與在()XA()XA瓊脂平板上菌落相似。在瓊脂平板上菌落相似。在 CHROMagarCHROMagar顯色培

49、養(yǎng)基及顯色培養(yǎng)基及OXAOXA或或PALCAMPALCAM瓊脂平板上挑取瓊脂平板上挑取5 5個(gè)或更多可個(gè)或更多可 疑菌落疑菌落. .接種于接種于TSA-YETSA-YE瓊脂平板上瓊脂平板上. .純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。純培養(yǎng)后進(jìn)鑒定。 5. 5.鑒定和確認(rèn)鑒定和確認(rèn) SkjerveSkjerve等通過(guò)包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分等通過(guò)包被單克隆抗體的磁珠從不同食物樣品中分 離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn)離李斯特菌，采用將磁珠接種到瓊脂平板培養(yǎng)的方法進(jìn) 行菌株鑒定，此法的敏感性為行菌株鑒定，此法的敏感性為102102104cfu/mL104cfu/mL樣品。樣品。 Hudso

50、nHudson等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)與等研究表明，將免疫磁珠技術(shù)與PCRPCR結(jié)合，結(jié)合，24h24h內(nèi)內(nèi) 即可檢出火腿中的單增李斯特菌。即可檢出火腿中的單增李斯特菌。 Notzon等用等用IMB-熒光熒光PCR檢測(cè)肉類中的沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括檢測(cè)肉類中的沙門氏菌，實(shí)驗(yàn)包括 非選擇性增菌、免疫磁珠分離、非選擇性增菌、免疫磁珠分離、DNA提取及提取及PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增，12 13h即可完成檢測(cè)過(guò)程，即可完成檢測(cè)過(guò)程，IMB-熒光熒光PCR在檢測(cè)自然感染肉類和在檢測(cè)自然感染肉類和 人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。人工感染肉類都具有較高的敏感性和特異性。 Blackburn 等將用生物素標(biāo)記

51、的抗沙門菌多價(jià)多克隆抗體連等將用生物素標(biāo)記的抗沙門菌多價(jià)多克隆抗體連 接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測(cè)從不同食物中提接到鏈霉親和素包被的磁珠上，以此試劑檢測(cè)從不同食物中提 取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)取的活沙門菌。此法的敏感性可達(dá)105cfu/g 食物，總的檢測(cè)食物，總的檢測(cè) 時(shí)間從時(shí)間從5d減少至減少至12d。 適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測(cè)，能快速有適用于各類食品基質(zhì)中的沙門氏菌的快速檢測(cè)，能快速有 效富集食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原菌，且有良好的靈敏度和特效富集食品基質(zhì)中的目標(biāo)病原菌，且有良好的靈敏度和特 異性，檢測(cè)限可達(dá)到異性，檢測(cè)限可達(dá)到110cfu/25g; 在檢測(cè)時(shí)間

52、方面可將常規(guī)檢測(cè)方法中的在檢測(cè)時(shí)間方面可將常規(guī)檢測(cè)方法中的72小時(shí)檢測(cè)周期縮小時(shí)檢測(cè)周期縮 短至短至40小時(shí)，而且能有效減輕過(guò)程交叉污染小時(shí)，而且能有效減輕過(guò)程交叉污染; 篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以篩選結(jié)果既可以與常規(guī)的細(xì)菌生化和血清學(xué)聯(lián)用，也可以 和顯色培養(yǎng)基、熒光和顯色培養(yǎng)基、熒光PCR以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方以及微生物全自動(dòng)鑒定儀器等方 法聯(lián)用，為食源性致病菌檢測(cè)和鑒定提供有效快速篩選技法聯(lián)用，為食源性致病菌檢測(cè)和鑒定提供有效快速篩選技 術(shù)。術(shù)。 陳伶俐等將人陳伶俐等將人IgG結(jié)合到磁珠上，用該磁珠對(duì)樣品中的金結(jié)合到磁珠上，用該磁珠對(duì)樣品中的金 黃色葡萄球菌進(jìn)

53、行快速分離檢驗(yàn)。取適量免疫磁珠，加入黃色葡萄球菌進(jìn)行快速分離檢驗(yàn)。取適量免疫磁珠，加入 金黃葡萄球菌菌液中，磁場(chǎng)下分離磁珠，將分離前后的菌金黃葡萄球菌菌液中，磁場(chǎng)下分離磁珠，將分離前后的菌 液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對(duì)照。液及磁珠涂平板，并用大腸桿菌、白葡萄球菌等作對(duì)照。 結(jié)果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的結(jié)果用此磁珠分離后，只有金黃葡萄球菌的濃度有明顯的 降低。對(duì)磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為金黃葡萄降低。對(duì)磁珠所涂平板的菌落進(jìn)行鑒定，證明為金黃葡萄 球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速度快，靈敏度高，球菌。應(yīng)用此法分離檢驗(yàn)此菌，富集速度快，靈敏度高， 效

54、果好。效果好。 劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來(lái)檢測(cè)食品中金黃色劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來(lái)檢測(cè)食品中金黃色 葡萄球菌，該法能夠在葡萄球菌，該法能夠在30min內(nèi)富集檢測(cè)金黃色葡萄球菌內(nèi)富集檢測(cè)金黃色葡萄球菌 且檢測(cè)低限可達(dá)且檢測(cè)低限可達(dá)100 CFU，同時(shí)磁珠可保持活性達(dá)，同時(shí)磁珠可保持活性達(dá)3周以周以 上。上。 Hara-Kudo等利用等利用IMS和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)和顯色培養(yǎng)基分離貝類中產(chǎn)TDH的的 副溶血性弧菌副溶血性弧菌O3:K6。 Datta等利用副溶血性弧菌等利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對(duì)極鞭毛的制備針對(duì)極鞭毛的 單克隆抗體單克隆抗體,這將有益于快速檢測(cè)從

55、環(huán)境來(lái)源的副溶血性弧這將有益于快速檢測(cè)從環(huán)境來(lái)源的副溶血性弧 菌。菌。 張凡非等利用張凡非等利用IMS分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生分離環(huán)境及食品中產(chǎn)生TDH副溶血性弧副溶血性弧 菌，分別從菌，分別從1份海水、份海水、1份海泥和份海泥和3份蛤肉中檢出了神奈川份蛤肉中檢出了神奈川 現(xiàn)象陽(yáng)性現(xiàn)象陽(yáng)性,并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌并產(chǎn)生耐熱溶血毒素的副溶血性弧菌,血清型為血清型為 03:K6。 該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比該方法與一般的細(xì)菌培養(yǎng)分離法相比,極大地提高了環(huán)境極大地提高了環(huán)境 樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用樣品及食品中病原性副溶血性弧菌的檢出率。利用IMB 可有效地吸附、濃縮

56、大量樣品中的少量病原微生物可有效地吸附、濃縮大量樣品中的少量病原微生物, IMB 為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問(wèn)題為難于從環(huán)境及食品中分離病原性副溶血性弧菌的問(wèn)題 提供一種有效手段。提供一種有效手段。 志賀氏菌志賀氏菌 例：例：Islam等應(yīng)用等應(yīng)用O抗原特異性單克隆抗體包被抗原特異性單克隆抗體包被 免疫磁珠，快速檢測(cè)糞便中的疾痢志賀菌和福免疫磁珠，快速檢測(cè)糞便中的疾痢志賀菌和福 氏志賀菌。分離出的志賀菌株用氏志賀菌。分離出的志賀菌株用PCR擴(kuò)增方法擴(kuò)增方法 進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與進(jìn)行鑒定。此種免疫磁珠分離與PCR聯(lián)合法檢聯(lián)合法檢 測(cè)志賀菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速測(cè)志賀

57、菌，較傳統(tǒng)的培養(yǎng)法敏感、快速(7 h)。 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 例：例：Kapperud等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌等用抗小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌 血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離，血清抗體包被磁性微球，從食物和水樣中分離， 并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森并能將小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌與假結(jié)核耶爾森 氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。氏菌和非致病性耶爾森氏菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。 免疫磁珠與免疫磁珠與PCRPCR的聯(lián)用的聯(lián)用 由于由于PCR PCR 技術(shù)靈敏度較低，將免疫磁珠技術(shù)和技術(shù)靈敏度較低，將免疫磁珠技術(shù)和PCR PCR 技術(shù)技術(shù) 相結(jié)合，建立了新的檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，建立了

58、新的檢測(cè)系統(tǒng) 磁免疫磁免疫PCRPCR技術(shù)。例如：技術(shù)。例如： 它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將菌它以李斯特氏菌單抗包被磁珠，對(duì)樣品進(jìn)行前處理，將菌 進(jìn)行富集裂解，再以進(jìn)行富集裂解，再以iap iap 基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物進(jìn)行 PCRPCR，結(jié)果顯示該方法具有良好特異性，而且十分靈敏。，結(jié)果顯示該方法具有良好特異性，而且十分靈敏。 免疫磁珠與免疫磁珠與ELISAELISA的聯(lián)用的聯(lián)用 利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白利用磁性微球，并以兔抗甘草蛋白IgGIgG抗體致敏，制備特異性抗體致敏，制備特異性 捕獲甘草特征蛋白的免疫磁性微球。以生物素標(biāo)記抗體為示捕獲甘草特征蛋