食品生物化學(xué)實驗指導(dǎo)

1、08食品科學(xué)食品生物化學(xué)實驗要求1. 學(xué)生做實驗前必須寫好實驗預(yù)習(xí)報告，做好實驗預(yù)習(xí)，無實驗預(yù)習(xí)報告者不許進入實驗室。每大組實驗人數(shù)20-24人，4人一小組。2. 實驗試劑的配制，現(xiàn)場由教師指導(dǎo)，學(xué)生操作完成。具體過程如下：（1）每大組只配制自己大組所用試劑，不得多配、浪費；（2）每小組派一人，一大組共選出5-6人來共同完成試劑配制工作。其他學(xué)生在自己組的臺面準(zhǔn)備其他試驗工作，如領(lǐng)用器皿，滴定管的與準(zhǔn)備等工作；（3）各小組成員輪換派人配制試劑，即做一次實驗換一次人，保證每個學(xué)生都經(jīng)歷了配制試劑的過程。（4）學(xué)生在試劑配制過程中，掌握試劑配置的基本步驟，基本方法和注意事項。3. 實驗室所有設(shè)備都

2、必須按說明書使用，器皿要小心使用，按規(guī)范要求操作，如有損壞，照價賠償。4. 衛(wèi)生要求：每次試驗完畢小組成員務(wù)必將本試驗臺及地面收拾整潔，器皿擺放整齊有序，如哪組成員發(fā)現(xiàn)沒有搞好自己組的環(huán)境衛(wèi)生，這次試驗的所有組員的實驗報告都會扣分。08食品科學(xué)食品生物化學(xué)實驗項目表1.淀粉的顯色和水解（3學(xué)時）2.雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量（3學(xué)時）3.牛奶中酪蛋白等電點測定（3學(xué)時）4.酶的性質(zhì)實驗（4學(xué)時）5.氨基酸的分離鑒定（3學(xué)時）6.或蛋白質(zhì)的顏色反應(yīng)（3學(xué)時）實驗總課時：16學(xué)時實驗一 淀粉的顯色和水解一、實驗?zāi)康暮鸵?、進一步了解淀粉的性質(zhì)及淀粉水解的原理和方法。2、如何驗證淀粉是否水解及其水解的

3、條件和產(chǎn)物。二、實驗原理1、淀粉與碘的反應(yīng) 直鏈淀粉遇碘呈藍色，支鏈淀粉遇碘呈紫紅色，糊精遇碘呈藍紫、紫、橙等顏色。這些顯色反應(yīng)的靈敏度很高，可以用作鑒別淀粉的定量和定性的方法，也可以用它來分析碘的含量。紡織工業(yè)上用它來衡量布匹退漿的完全度，它還可以用來測定水果果實（如蘋果等）的淀粉含量。近年來用先進的分析技術(shù)（如x射線、紅外光譜等）研究碘跟淀粉生成的藍色物，證明碘和淀粉的顯色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的緣故。直鏈淀粉是由-葡萄糖分子縮合而成螺旋狀的長長的螺旋體，每個葡萄糖單元都仍有羥基暴露在螺旋外。碘分子跟這些羥基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋體的軸心部位。碘跟淀粉的這種作用叫做包合作用

4、，生成物叫做包合物。在淀粉跟碘生成的包合物中，每個碘分子跟6個葡萄糖單元配合，淀粉鏈以直徑0.13 pm繞成螺旋狀，碘分子處在螺旋的軸心部位。淀粉跟碘生成的包合物的顏色，跟淀粉的聚合度或相對分子質(zhì)量有關(guān)。在一定的聚合度或相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)，隨聚合度或相對分子質(zhì)量的增加，包合物的顏色的變化由無色、橙色、淡紅、紫色到藍色。例如，直鏈淀粉的聚合度是200980或相對分子質(zhì)量范圍是32 000160 000時，包合物的顏色是藍色。分支很多的支鏈淀粉，在支鏈上的直鏈平均聚合度2028，這樣形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，顯棕紅色、紅色、淡紅色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的顏色。表 2-

5、1淀粉的聚合度和生成碘包合物的顏色葡萄糖單位的聚合度3.87.412.918.320.229.334.7以上包合物的顏色無色淡紅紅棕紅紫色藍紫色藍色淀粉跟碘生成的包合物在ph=4時最穩(wěn)定，所以它的顯色反應(yīng)在微酸性溶液里最明顯。2、淀粉的水解 淀粉是一種重要的多糖，是一種相對分子量很大的天然高分子化合物。雖屬糖類，但本身沒有甜味，是一種白色粉末，不溶于冷水。在熱水里淀粉顆粒會膨脹，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分懸浮在水里，形成膠狀淀粉糊。淀粉進入人體后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，發(fā)生水解反應(yīng)，生成麥芽糖；余下的淀粉在小腸里胰臟分泌出的淀粉酶的作用下，繼續(xù)進行水解，生成麥芽糖。麥芽糖

6、在腸液中麥芽糖酶的催化下，水解為人體可吸收的葡萄糖，供人體組織的營養(yǎng)需要。反應(yīng)過程為：（c6h12o5）m(c6h10o5)nc12h22o11c6h12o6淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖 葡萄糖是淀粉最重要的下游產(chǎn)品之一，工業(yè)生產(chǎn)中常常使用玉米淀粉水解來加工結(jié)晶葡萄糖。三、試劑和器材1、器材：試管夾、量筒、燒杯各一只、白瓷板一塊、試管一支、水浴鍋。2、試劑：淀粉及0.1溶液 、10naoh溶液、20h2so4溶液、10na2so4溶液、稀碘液、乙醇、2%cuso4溶液。四、操作步驟1、淀粉與碘的反應(yīng)取少量淀粉于白瓷板空內(nèi)，加碘液兩滴，觀察顏色。取試管一支，加入0.1的淀粉6ml，碘兩滴，搖勻，觀

7、察顏色變化。另取試管兩支，將此淀粉均分為三等份并編號做如下實驗：1號管在酒精燈上加熱，觀察顏色變化。然后冷卻，又觀察顏色變化。2號管加入10naoh溶液幾滴，觀察顏色變化3號管加入乙醇幾滴，觀察顏色變化。記載上述實驗過程和結(jié)果，并解釋現(xiàn)象。2、淀粉水解實驗設(shè)計設(shè)計實驗方案，試驗淀粉能不能水解，水解的條件和產(chǎn)物是什么？怎樣判斷淀粉是否水解了？(1) 在試管1中加入0.5g淀粉和4ml水，在試管2中加入0.5g淀粉和4ml 20%的硫酸溶液。分別加熱試管34min。 (2) 把試管2中的一部分溶液倒入試管3中，留作下一步實驗用。 (3) 向試管1和試管2中加入幾滴碘溶液，觀察現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)試管1的溶液

8、呈藍色（淀粉遇碘變成藍色），試管2無明顯現(xiàn)象。不同現(xiàn)象的原因是：淀粉在酸性條件并加熱的條件下發(fā)生了水解反應(yīng)。 (4) 向試管3中滴入10%的堿液，中和溶液中的硫酸，把溶液調(diào)呈弱堿性，使溶液的ph值約為910。 (5) 另取一只試管4加入3ml氫氧化鈉溶液，并向其中滴入4滴2%的硫酸銅溶液，立即有藍色的氫氧紅銅沉淀生成。再取試管3中的水解液1ml滴入，振蕩混合均勻后，用酒精燈加熱煮沸，溶液顏色常有藍色黃色綠色（黃藍兩色混合）紅色等一系列變化。最終有紅色沉淀生成。原因是氫氧化銅被還原生成紅色難溶于水的氧化亞銅。實驗結(jié)論：淀粉在酸的催化作用下，能發(fā)生水解；淀粉的水解過程：先生成分子量較小的糊精（淀粉

9、不完全水解的產(chǎn)物），糊精繼續(xù)水解生成麥芽糖，最終水解產(chǎn)物是葡萄糖。注意事項：淀粉水解的中間產(chǎn)物糊精（有分子量較大的紅糊精和分子量較小的白糊精），對碘反應(yīng)的顏色變化是：紫色棕色黃色，若淀粉水解不徹底，也會有不同的顏色出現(xiàn)。問題思考：1、試管1為什么變成了藍色？試管2為什么無明顯現(xiàn)象？為什么？（試管1中的淀粉未水解，淀粉遇碘變成藍色；試管2中淀粉在酸的催化作用下水解了，所以無明顯現(xiàn)象；不同現(xiàn)象的原因是：淀粉在酸性條件并加熱的條件下發(fā)生了水解反應(yīng)。） 2、如何驗證淀粉沒有還原性？（提示：不能發(fā)生銀鏡反應(yīng)或者不能還原氫氧化銅） 3、實驗延伸設(shè)計：如何驗證唾液酶對淀粉水解的催化作用？（注意事項：用唾液作

10、催化劑水解淀粉時，溫度不得超過45攝氏度，因為溫度過高，唾液酶易失去活性，最適宜的溫度是3740攝氏度。）實驗二：雙縮脲法測定蛋白質(zhì)含量一 實驗原理:凡具有兩個以上肽鍵（-co-nh-）的物質(zhì)，在堿性溶液中與硫酸銅作用，形成紫紅色的絡(luò)合物，此紫紅色化合物在540nm處有最大吸收峰，這個反應(yīng)稱雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)是由許多氨基酸通過肽鍵連接起來的，因而一切蛋白質(zhì)均可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反應(yīng)，且顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，與同樣操作的已知濃度蛋白質(zhì)溶液相比較可求得其含量。雙縮脲試劑也可與csnh2, c(nh)nh2或ch2nh2等基團反應(yīng)。但在生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)外不存在其它能與此試劑顯色的物質(zhì)。本法

11、的測定蛋白質(zhì)濃度的范圍是0.510mg/ml，最好在15mg/ml范圍。本法操作簡單、顯色穩(wěn)定，對大部分蛋白質(zhì)顯色程度相同，特別是各種血清蛋白顯色程度一致。在2040范圍內(nèi)，反應(yīng)后30分鐘的顯色程度基本相同，從30分鐘到4小時顏色深度不變。如室溫過低，可置37水浴中20分鐘后測定光密度。銨鹽對測定有干擾，硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)粗品必須先行脫鹽。含血脂多的血清，可用乙醚抽提一次后再行測定。二、實驗材料：1.標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：紫外分光光度法對大多數(shù)蛋白質(zhì)的顯色程度一致，故僅需用一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白，常用牛血清白蛋白（bsa）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。準(zhǔn)確稱取干燥之bsa 100mg，用生理鹽水溶解定容至10ml，其蛋白濃度為

12、10mg/ml。2.雙縮脲試劑：取硫酸銅1.5g，酒石酸鉀鈉6g，分放兩燒杯中，各加水200ml，使之溶解后，將兩溶液全部轉(zhuǎn)移至1000ml容量瓶中?；旌虾蠹尤?0% naoh 300ml，定容至刻度，混勻。置于暗處保存，有紅色沉淀時不能用。三、操作步驟：1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備： 取7個試管按下表配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白液。 試管號 1 2 3 4 5 6 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（10mg/ml） 0 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 生理鹽水（ml） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 雙縮脲試劑(ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白濃度(mg/ml） 0 0.00

13、1 0.003 0.005 0.007 0.009 混勻后，于37水浴中保溫15分鐘，在520nm波長下比色，以第一管調(diào)零，測得各標(biāo)準(zhǔn)管的光密度。以各管的光密度值為縱坐標(biāo)，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2 樣品測定取待測蛋白樣品0.1ml，加生理鹽水 0.9ml，再加雙縮脲試劑4.0ml，于37水浴中保溫15分鐘，測其光密度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得出樣品中的蛋白質(zhì)含量。 標(biāo)準(zhǔn)蛋白光密度值蛋白質(zhì)含量(g%)= 標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度 樣品光密度值實驗三 牛奶中酪蛋白等電點測定一、實驗?zāi)康暮鸵?、初步學(xué)會測定蛋白質(zhì)等電點的基本方法。2、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)。二、實驗原理蛋白質(zhì)分子中有一定數(shù)量的自由氨基

14、和自由羧基存在(以及一些其他酸性和堿性基團)，是兩性電解質(zhì)。作為帶電顆粒它可以在電場中移動，移動方向取決于蛋白質(zhì)分子所帶的電荷。蛋白質(zhì)顆粒在溶液中所帶的電荷，既取決于其分子組成中堿性和酸性氨基酸的含量，又受所處溶液的ph影響。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一ph時，蛋白質(zhì)游離成正、負(fù)離子的趨勢相等，即成為兼性離子(zwitterion,凈電荷為o)，此時溶液的ph值稱為蛋白質(zhì)的等電點(isoelectric point,簡寫pi)。處于等電點的蛋白質(zhì)顆粒，在電場中并不移動。蛋白質(zhì)溶液的ph大于等電點，該蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，反之則帶正電荷。不同蛋白質(zhì)，等電點不同。在等電點時，蛋白質(zhì)溶解度最小，容易沉淀析出。

15、因此，可以借助在不同ph溶液中的某蛋白質(zhì)的溶解度來測定該蛋白質(zhì)的等電點。牛奶中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸鈣-磷酸鈣復(fù)合體膠粒存在。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白會沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。通過本實驗可以測定酪蛋白的等電點，為提取酪蛋白打下基礎(chǔ)。三、試劑和器材1.器材：試管及試管架；吸管與滴管；100ml容量瓶和25ml錐形瓶；水浴鍋和溫度計。2.試劑：(1)1.00mol/l醋酸；(2)0.1mol/l醋酸；(3)1mol/l醋酸；(4)蒸餾水；(5)牛奶四、操作步驟1、取五支同種規(guī)格的試管，編號，按表41順序精確加入各種試劑，然后逐一振蕩試管，并使試

16、管混合均勻。表41 蛋白質(zhì)的等電點測定表試管號蒸餾水1.00mol/l醋酸/ml1.00mol/l醋酸/ml1.00mol/l醋酸/ml牛奶/ml溶液ph渾濁度18.40.61.05.928.70.31.05.338.01.01.04.749.01.04.157.41.61.03.52、將上述試管靜置于試管架上約15分鐘后，仔細觀察，比較各管的渾濁度，將觀察的結(jié)果記載于表內(nèi)，并指出酪蛋白的等電點。注：本實驗各種試劑的濃度及用量均要求很準(zhǔn)確。 渾濁度可用、等符號表示。五、思考題：什么叫等電點？在等電點時，蛋白質(zhì)為什么容易被沉淀析出？實驗四 酶的性質(zhì)實驗一、實驗?zāi)康暮鸵?加深對酶的性質(zhì)的認(rèn)識2學(xué)

17、會觀察酶的專一性以及溫度、酸度（ph）等因素對酶活性的重要影響。二、實驗原理酶具有高度的專一性。淀粉和蔗糖無還原性，唾液淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，但不能催化蔗糖的水解。蔗糖酶能催化蔗糖水解產(chǎn)生還原性葡萄糖和果糖，但不能催化淀粉的水解?？捎冒嗍希╞enedict）試劑檢查糖的還原性。酶的活性受溫度的影響，在最適溫度下，酶的催化反應(yīng)速度最高，大多數(shù)動物酶的最適溫度在37-40，植物酶的最適溫度為50-60。偏離此最適環(huán)境時，酶的活性減弱。酶的活力受環(huán)境ph的影響極為顯著。不同酶的最適ph值不同。本實驗觀察ph對唾液淀粉酶活性的影響，唾液淀粉酶的最適ph為6.8。三、試劑和器材：1試劑（1

18、）2%蔗糖溶液（至少要分析純）。（2）溶于0.3%氯化鈉的1%淀粉溶液（需新鮮配制）。（3）稀釋200倍數(shù)的新鮮唾液。（4）蔗糖酶溶液：將啤酒廠的鮮酵母用水洗滌2-3次（離心法），然后放在濾紙上自然干燥。取干酵母100g置于乳缽內(nèi)，添加適量蒸餾水及少量細沙，用力研磨，提取約1小時，再加蒸餾水，使總體積約為原體積的10倍。離心，將上清液保存于冰箱中備用。（5）班氏（benedict）試劑：無水硫酸銅1.74g溶于100ml熱水中，冷卻后稀釋至150ml，取檸檬酸鈉173g，無水碳酸鈉100g和600ml水共熱，溶解后冷卻并加水至850ml。再將冷卻的150ml硫酸銅溶液注入。本試劑可長久保存。（

19、6）0.2%淀粉的0.3%氯化鈉溶液（需新鮮配制）（7）碘化鉀-碘溶液：將碘化鉀20g及碘10g溶于100ml水中。使用前稀釋10倍。（8）新配制的溶于0.3%氯化鈉的0.5%淀粉溶液（9）0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液（10）0.1mol/l檸檬酸溶液（11）ph試紙：ph=5、ph=5.8、ph=6.8、 ph=82器材恒溫水浴、試管及試管架、錐形瓶、吸管、滴管、白瓷板等四、操作步驟：1酶的專一性（1）淀粉酶的專一性按下表操作：管號1234561%淀粉溶液(滴)2%蔗糖溶液（滴）稀釋唾液(ml)煮沸過的稀釋唾液(ml)蒸餾水(ml)4-1-4-14-1-41-4-1-4-1-37恒溫水浴1

20、5分鐘benedict試劑(ml)111111沸水浴23分鐘現(xiàn)象2溫度對酶活力的影響淀粉和可溶性淀粉遇碘呈藍色。糊精按其分子的大小，遇碘可呈藍色、紫色、暗褐色或紅色，最小的糊精和麥芽糖遇碘不呈色。在不同的溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度，可由其遇碘呈現(xiàn)的顏色來判斷。取3支試管，編號后按下表加入試劑：管號123淀粉溶液(ml)稀釋唾液(ml)煮沸過的稀釋唾液(ml)1.51-1.51-1.5-1搖勻后，將1號、3號兩試管放入37水浴中，2號試管放入冰水中。10分鐘后取出，（將2號管內(nèi)液體分為兩半），用碘化鉀-碘溶液來檢驗1、2、3管內(nèi)淀粉被唾液淀粉酶水解的程度。記錄并解釋結(jié)果，將2號管剩下的一

21、半溶液放入37水浴中繼續(xù)保溫10分鐘后，再用碘液試驗，判斷結(jié)果。3ph對酶活力的影響取4個標(biāo)有號碼的50ml錐形瓶。用吸管按下表添加0.2mol/l磷酸氫二鈉溶液和0.1mol/l檸檬酸溶液以制備ph5.0-8.0的四種緩沖液。錐形瓶 號0.2mol/l磷酸氫二鈉（ml）0.1mol/l檸檬酸（ml）ph12345.156.057.729.724.853.952.280.285.05.86.88.0從4個錐形瓶中各取緩沖液3ml，分別注入4支編好號的試管中，隨后于每個試管中添加0.5%淀粉溶液2ml和稀釋200倍的唾液2ml。向各試管中加入稀釋唾液的時間間隔各為1分鐘。將各試管內(nèi)容物混勻，并依

22、次置于37恒溫水浴中保溫。在第4管中加入唾液2分鐘后，每隔1分鐘由第4管取出1滴混合液，置于白瓷板上，加1小滴碘化鉀-碘溶液，檢驗淀粉的水解程度。待混合液變?yōu)榻埸S色時，向所有試管依次添加1-2滴碘化鉀-碘溶液。添加碘化鉀-碘溶液的時間間隔，從第一管起，亦均為1分鐘。觀察各試管內(nèi)容物呈現(xiàn)的顏色，分析ph對唾液淀粉酶活性的影響。五、思考題1試解釋酶為什么具有很高的催化效率？2什么是酶的專一性？試從你所做實驗及其結(jié)果解釋酶具有這種性質(zhì)。實驗五：氨基酸的分離鑒定紙層析法一、目的通過氨基酸的分離，學(xué)習(xí)紙層析法的基本原理及操作方法。二、原理 紙層析法是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機溶劑和

23、水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置是用rf值(比移)來表示的：rf = 原點到層析中心的距離 / 原點到容劑前沿的距離在一定的條件下某種物質(zhì)的rf值是常數(shù)。rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。本實驗利用紙層析法分離氨基酸。三、器材1、層析缸 2、毛細管 3、噴霧器 4、培養(yǎng)皿 5、層析濾紙(新華一號)四、試劑1、擴展劑 650ml是4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20 ml正丁醇和5 ml冰醋酸放人分液漏斗中，與15ml水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層。取漏斗內(nèi)的擴展劑約5ml置于小燒杯中做平衡溶劑，其余的倒人培養(yǎng)皿中備用。2、

24、氨基酸溶液 05的賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它們的混合液(各組份濃度均為05)。各5ml 3、顯色劑 50looml01水合茚三酮正丁醇溶液。五、操作1、將盛有平衡溶劑的小燒杯置于密閉的層析缸中。2、取層析濾紙(長22 cm、寬14 cm)一張。在紙的一端距邊緣23 cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm作一記號。3、點樣用毛細管將各氨基酸樣品分別點在這6個位置上，干后再點一次。每點在紙上擴散的直徑，最大不超過3 mm。4、擴展 用線將濾紙縫成筒狀，紙的兩邊不能接觸。將盛有約20 ml擴展劑的培養(yǎng)皿迅速置于密閉的層析缸中，并將濾紙直立于培養(yǎng)皿中(點樣的一端在下，擴展劑的液面需低于點樣線1 cm)。待溶劑上升1520 cm時即取出濾紙，鉛筆描出溶劑前沿界線，自然干燥或用吹風(fēng)機熱風(fēng)吹干。5、顯色 用噴霧器均勻噴上0。1茚三酮正丁醇溶液，然后置烘箱中烘烤5分鐘(100)或用熱風(fēng)吹干即可顯出各層析斑點。6、計算各種氨基酸的rf值。思 考題1、何謂紙層析法?2、何謂及f值?影響只f值的主要因素是什么?3、怎樣制備擴展劑?4、層析缸中平衡溶劑的作用