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文檔簡(jiǎn)介
1、高效液相色譜法在魚藥殘留測(cè)定中的應(yīng)用 【摘 要】為了防范和治療疾病,在養(yǎng)殖過程中對(duì)魚用藥是不可避免的,但魚體內(nèi)的藥物殘留問題也受到大家的重視。人們建立了許多測(cè)定魚藥殘留的方法,高效液相色譜法就是其中之一。本文結(jié)合具體試驗(yàn),介紹了高效液相色譜法在魚藥殘留測(cè)定中的應(yīng)用。結(jié)果表明:該方法具有靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn),適用于魚藥殘留的檢測(cè)。 【關(guān)鍵詞】藥物殘留;測(cè)定;磺胺類藥物;高效液相色譜法 近年來,我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速,其集約化的程度提高的很快,可是隨著該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,水質(zhì)漸趨惡化,疾病的預(yù)防與治療問題變得頗為緊迫,因此,越來越多地對(duì)于魚進(jìn)行用藥,但魚產(chǎn)品中的藥物殘留狀況不樂觀。為了讓消費(fèi)者用
2、上放心的魚產(chǎn)品,就必須加強(qiáng)魚藥殘留的測(cè)定工作。目前,動(dòng)物性食品中獸藥殘留量的測(cè)定主要有分光光度法、示波極譜法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜法等。下面,就結(jié)合具體試驗(yàn),介紹高效液相色譜法在魚藥殘留測(cè)定中的應(yīng)用。 1.試驗(yàn)部分 1.1儀器與試劑 waters 2695高效液相色譜儀,配2487紫外檢測(cè)器;allegratm 21r高速冷凍離心機(jī);buchir-205 advance旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀。喹酸、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、萘啶酸、呋喃唑酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.0100g,用乙腈(1+1)溶液溶解后定容至100ml,配成1
3、00mgl-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。用時(shí)用乙腈稀釋配成所需濃度。乙腈、甲醇、乙酸均為色譜純;其余試劑為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。 1.2色譜條件 waters symmetry c18色譜柱(250mm4.6mm,5m),柱溫35,流量1.0mlmin-1,檢測(cè)波長265nm,進(jìn)樣量20l。流動(dòng)相a為乙腈,b為0.08moll-1乙酸溶液,梯度洗脫程序:010min,a由10%升至60%,保持10min;2020.05min,a由60%降至10%,保持9.95min。 1.3試驗(yàn)方法 1.3.1樣品提取 稱取魚肉試樣5.000g于50ml離心管中,加入乙腈20ml及經(jīng)650烘干的無水硫酸鈉10g,渦旋
4、振蕩2min,以10000rmin-1轉(zhuǎn)速離心10min,上清液轉(zhuǎn)移至125ml分液漏斗中。殘?jiān)屑尤胍译?0ml,按上述方法再提取一次,上清液合并于分液漏斗中。 1.3.2脫脂 加正己烷30ml于分液漏斗中,加塞劇烈振蕩5min,充分靜置分液,收集乙腈層(下層)于250ml旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,加入正丙醇5ml,于40水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。 1.3.3凈化 1)中性氧化鋁柱凈化:中性氧化鋁柱使用前用乙腈-水(95+5)溶液10ml預(yù)洗并活化。測(cè)定磺胺類和呋喃唑酮藥物時(shí),將第1.3.2節(jié)中的殘?jiān)靡译?水(95+5)溶液5ml溶解,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)試樣稀釋液過柱,收集稀釋液至另一旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中,并于4
5、0水浴條件下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。往旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中加入乙腈-水(4+6)溶液1ml溶解殘?jiān)?0000rmin-1轉(zhuǎn)速離心10min,上清液經(jīng)0.45m微孔濾膜過膜,濾液在色譜條件下進(jìn)行分析。 2)c18柱凈化:測(cè)定喹酸和萘啶酸藥物時(shí),取1.3.2節(jié)中的殘?jiān)?.05moll-1磷酸二氫鈉溶液5ml溶解,c18固相萃取柱先后用10ml甲醇和0.05moll-1磷酸二氫鈉溶液10ml預(yù)洗并活化。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶內(nèi)試樣稀釋液過柱,再用0.05moll-1磷酸二氫鈉溶液10ml清洗c18柱,棄掉流出液。 2.結(jié)果與討論 2.1色譜柱的選擇 磺胺類、喹諾酮類和呋喃唑酮的分離通常采用c18反相柱,試驗(yàn)對(duì)agile
6、nt sb c18柱、agilent tc c18柱、sunfire c18柱和symmetry c18柱的分離效果進(jìn)行了考察。結(jié)果表明:除agilent tc c18柱的分離過程中有小的雜質(zhì)峰出現(xiàn)外,其它3種色譜柱均可實(shí)現(xiàn)基質(zhì)和藥物的較好分離;比較基線的水平性和色譜峰的響應(yīng)值,symmetry c18柱的分離效果較好,試驗(yàn)選擇symmetry c18柱為色譜分離柱。 2.2流動(dòng)相組成及洗脫程序的選擇 磺胺類藥物含有氨基、苯磺酰胺結(jié)構(gòu),具有弱堿性;喹諾酮類藥物是兩性化合物;呋喃唑酮結(jié)構(gòu)中也含有兩性基團(tuán),因此調(diào)節(jié)流動(dòng)相的ph值可抑制弱堿的離解,從而改變色譜峰的保留時(shí)間。結(jié)果表明:酸度過高,磺胺類
7、藥物較難完全分離,且對(duì)色譜柱有所損傷;酸度過低,色譜峰會(huì)出現(xiàn)明顯拖尾現(xiàn)象,試驗(yàn)選擇0.08moll-1乙酸溶液控制流動(dòng)相酸度。 乙腈與乙酸溶液以不同體積比組成的混合溶液影響保留時(shí)間和峰形。由于萘啶酸極性較小,c18色譜柱對(duì)其吸附較強(qiáng),以乙腈-0.08moll-1乙酸(15+85)混合溶液為流動(dòng)相等度洗脫,萘啶酸在73.3min時(shí)出峰,大大延長分析時(shí)間,且由于藥物在流動(dòng)相中的擴(kuò)散作用,峰形也較差。以乙腈-0.08moll-1乙酸(30+70)混合溶液為流動(dòng)相等度洗脫,雖能縮短分析時(shí)間,但磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺二甲基嘧啶的分離度不夠理想,各峰的峰形較寬,且磺胺嘧啶出峰時(shí)間過早,與雜質(zhì)峰較難完
8、全分離。 為了保證各目標(biāo)物具有較好的分離效果和色譜峰形,試驗(yàn)采用乙腈和0.08moll-1乙酸溶液作為流動(dòng)相,采取合適的梯度淋洗條件,不但較好地實(shí)現(xiàn)了7種藥物的分離,而且各峰分離度較大,峰形尖銳,對(duì)稱性好。7種獸藥的色譜圖見圖1。 圖1 7種獸藥的色譜圖 2.3提取液的選擇 所測(cè)定的目標(biāo)物大部分屬于酸堿兩性化合物,含有氨基、羧基等極性基團(tuán),因此目前用于提取這些藥物的試劑主要有乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇以及按照一定比例組成的混合溶液,試驗(yàn)結(jié)果表明:二氯甲烷和乙酸乙酯的溶解性較強(qiáng),會(huì)提取出類脂物,濃縮后不容易脫脂;乙腈對(duì)動(dòng)物蛋白具有良好的變性作用,在能夠有效提取出目標(biāo)藥物的同時(shí),與其它有機(jī)溶劑
9、相比,對(duì)脂類的溶解度也較小,且在沉淀樣品中蛋白質(zhì)方面要優(yōu)于甲醇和丙酮,因此,試驗(yàn)選用乙腈作為提取劑。由于水產(chǎn)動(dòng)物中水分含量較高,加入無水硫酸鈉能夠有效防止組織中水分及水溶性蛋白質(zhì)進(jìn)入乙腈相,同時(shí)硫酸鈉的存在可促使蛋白質(zhì)變性分散,以及防止樣品形成塊狀影響提取。 2.4凈化的選擇 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在低濃度藥物檢測(cè)時(shí),有些基質(zhì)的存在干擾了對(duì)目標(biāo)藥物峰的定性定量分析、降低了檢測(cè)靈敏度。僅僅通過正己烷脫脂凈化是不夠的,只是去除大部分的非極性雜質(zhì)成分,許多極性物質(zhì)如磷脂、糖蛋白等仍然存在于提取溶劑中,需采用固相萃取柱進(jìn)行凈化。試驗(yàn)通過不同類型、不同種類填料和不同填料量的固相萃取柱對(duì)7種目標(biāo)化合物凈化效果的比較,得
10、出了針對(duì)不同目標(biāo)化合物采取不同的固相萃取柱凈化方法。中性氧化鋁柱適合對(duì)磺胺類和呋喃唑酮藥物的凈化。因?yàn)橹行匝趸X柱(ph 7.5)是強(qiáng)極性吸附劑,表面呈中性,容易保留雜環(huán)類,芳香烴和有機(jī)胺等富電化合物,如食品中色素等雜質(zhì)的去除多用此機(jī)制。試驗(yàn)還選用了c18固相萃取柱對(duì)喹酸和萘啶酸進(jìn)行凈化。 2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限 分別移取一定量的1.0mgl-1標(biāo)準(zhǔn)中間液,用乙腈稀釋成0.05,0.1,0.2,0.5,1.0mgl-1混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各化合物的峰面積a對(duì)其質(zhì)量濃度(mgl-1)進(jìn)行線性回歸,線性范圍均為0.051.0mgl-1,所得線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。以3倍信噪比(s/n)對(duì)應(yīng)的濃度計(jì)算方法的檢出限,結(jié)果見表1。 2.6 方法的回收率和精密度 取6份羅非魚、鳙魚及對(duì)蝦空白樣品,添加不同濃度水平的7種化合物進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),結(jié)果見表2。 3.結(jié)束語 試驗(yàn)結(jié)果表明:魚藥的質(zhì)量濃度與其峰面積均在0.051.0mgl-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限(3s/n)為0.010.04mgkg-1。采用高效液相色譜法的回收率在68.2%97.3%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)在1.6%14%之間
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