醫(yī)學(xué)中傳感器運用進展

1、醫(yī)學(xué)中傳感器運用進展 本文作者：劉傳銀 胡繼明 單位：襄樊學(xué)院化學(xué)工程與食品科學(xué)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點實驗室 生物傳感器是由生物活性單元(如酶、抗體、蛋白質(zhì)、核酸和細(xì)胞等)和信號轉(zhuǎn)換器組成并利用生物識別原理來進行檢測的一種裝置1。它是一種由生物、化學(xué)、物理、醫(yī)學(xué)和電子技術(shù)等多種學(xué)科互相滲透成長起來的高新技術(shù)，具有選擇性好、靈敏度高、分析速度快、成本低、在復(fù)雜的體系中進行在線連續(xù)監(jiān)測，及其易于自動化、微型化與集成化的特點。特別是近年來分子生物學(xué)、微電子學(xué)、光電子學(xué)、微細(xì)加工技術(shù)及納米技術(shù)等新學(xué)科和新技術(shù)的進展，使生物傳感器的研究蓬勃發(fā)展，成為新興的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。根據(jù)分子識別

2、元件與待測物結(jié)合的性質(zhì)可將生物傳感器分為生物催化型(代謝型)和生物親和型(受體型)。生物親和型傳感器是利用分子間特異的親和性，即生物活性物質(zhì)對底物的親和或鍵合作用而建立起來的，如免疫傳感器、受體傳感器和dna傳感器等。根據(jù)生物反應(yīng)產(chǎn)生信息的物理或化學(xué)性質(zhì)，可采用電化學(xué)、光譜、熱、壓電和表面聲波等技術(shù)進行檢測1。本文按照傳感信號方式的不同，對近年來親和型生物傳感器在生物醫(yī)學(xué)上的進展予以綜述。 1免疫傳感器 癌癥是人類健康的殺手，是否能較早診斷出癌癥的前期征兆是影響癌癥患者恢復(fù)的關(guān)鍵因素。眾所周知，在腫瘤發(fā)展的過程中，腫瘤組織或細(xì)胞會釋放出一些特異性的蛋白質(zhì)進入循環(huán)體系，而這些特異性蛋白在血液中的

3、含量水平標(biāo)志著腫瘤發(fā)展的階段，所以在生物醫(yī)學(xué)上常將這些特異性蛋白稱為腫瘤標(biāo)記物。臨床醫(yī)學(xué)上常將這些腫瘤標(biāo)記物的檢測作為臨床檢驗和診斷的重要依據(jù)1。生物化學(xué)、酶聯(lián)免疫和分子生物學(xué)等多種方法已用于腫瘤標(biāo)記物的檢測，雖然這些方法具有較高的選擇性、準(zhǔn)確度，但是存在輻射威脅、耗時和費用較高等缺點。由于免疫傳感器結(jié)合了免疫反應(yīng)的特異性分子識別和便利的檢測技術(shù)而得到研究者的普遍關(guān)注，故開發(fā)快速而準(zhǔn)確的腫瘤標(biāo)記物的免疫傳感器成為生物醫(yī)學(xué)檢測的研究熱點。腫瘤標(biāo)記物一般分為以下幾類:酶、糖蛋白、粘糖蛋白、激素、免疫分子和癌基因等。臨床醫(yī)學(xué)實踐表明，甲胎蛋白(afp)、降血鈣素(ct)、癌胚抗原(cea)、人絨毛膜

4、促性腺素(hcg)、前列腺特異抗原(psa)、鱗狀上皮細(xì)胞抗原(scca)、神經(jīng)元特異性烯醇酶(nse)和ca(carcinomaantigen)等均是典型的腫瘤標(biāo)記物1。如腸癌的腫瘤標(biāo)記物為cea、ca19-9和ca24-2;前列腺癌的腫瘤標(biāo)記物為f-psa、psa和pap。按照免疫傳感器檢測信號的不同，可分為電化學(xué)型、光學(xué)型和質(zhì)量敏感型等。 11電化學(xué)免疫傳感器 電化學(xué)免疫傳感器可再分為電位型、電容型和電流型。電位型傳感器在免疫傳感中應(yīng)用不多。梁茹萍等2利用戊二醛交聯(lián)ca15-3抗體的電位型免疫傳感器用于乳腺癌ca15-3的檢測，獲得了良好的檢出限(5u/ml)和穩(wěn)定性(30d)。fu等3

5、制備了40nm的氧化鐵納米柱修飾碳糊電極，用于固定cea建立了測定cea的電位型免疫傳感器。其線性范圍為1.580μg/l，檢出限為0.9μg/l。對臨床血液樣本的檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫法相符合。zhou等4將納米金吸附在溶于pvc的鄰苯二胺的氨基上，制備了一種增塑的pvc膜的電位傳感器用于α-afp的檢測。該傳感器的響應(yīng)時間短(4min)、檢出限低(1.6μg/l)。但電位型免疫傳感器的不足之處在于:信噪比較低，線性范圍窄，非特異性抗體-抗原作用及背景信號較高。電容型免疫傳感器是一種高靈敏非標(biāo)記型免疫傳感技術(shù)。在電容型免疫傳感器的制作中，傳感界面的構(gòu)建和生物識別層的

6、固定是影響其性能的重要因素?？刹捎冒雽?dǎo)體氧化物膜、自組裝單分子膜、電聚合膜、溶膠凝膠膜和等離子體聚合膜等來構(gòu)建電容型免疫傳感器。fernandez-sanchez等5研制了可以用于檢測psa的免疫傳感器。他們將對ph敏感的聚合物附著在電化學(xué)傳感器的表面，用于快速而靈敏地檢測親和反應(yīng)過程中的電容及阻抗變化，實現(xiàn)了對psa的靈敏檢測。quershi等6在納米晶鉆(ncd)-interdigitatedgold(gid)電極表面固載抗體，進而通過電容法測定心血管標(biāo)記物crp。結(jié)果表明，電容器的靈敏度表現(xiàn)在兩個方面，一是當(dāng)抗體與抗原結(jié)合后，極化常數(shù)和弛豫時間常數(shù)明顯增大，二是傳感器的靈敏度與抗體濃度及

7、施加頻率緊密相關(guān)。袁若等7報道了一種在玻碳電極表面修飾金納米粒子，進而吸附cea抗體，用鐵探針離子的阻抗特性來檢測cea，獲得了良好的檢出限和靈敏度。 rajesh等8在ito修飾電極上利用自組裝膜固定α-crp，利用電化學(xué)阻抗法檢測α-crp抗體與抗原的親和作用，其檢出限達到3.5μg/l。由于電容法和阻抗法可以獲取直接、非標(biāo)記的親和信號，所以在臨床診斷上具有良好的發(fā)展前景。但電容法存在的問題在于響應(yīng)電容易受到非特異性吸附的影響，其重現(xiàn)性不如法拉第阻抗法與伏安法。所以如何優(yōu)化傳感界面，改善響應(yīng)電容的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性仍是電容型免疫傳感器發(fā)展中的關(guān)鍵問題。電流型免疫傳

8、感器備受研究者的關(guān)注。由于大多數(shù)待測物不能直接參與電化學(xué)反應(yīng)，常采用加入電子媒介體和標(biāo)記酶來催化底物轉(zhuǎn)化為電活性物質(zhì)來制備傳感器。雖然加入電子媒介體會降低檢出限，但其分離和洗滌步驟限制了它在生物醫(yī)學(xué)上的廣泛應(yīng)用。而基于標(biāo)記酶的直接電子傳遞的免疫傳感器則簡化了分離和洗滌步驟，在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用更有吸引力。鞠幌先研究組曾對腫瘤標(biāo)記物的電流型傳感器進行了深入的研究9-12。如將硫堇和hrp標(biāo)記的cea抗體通過戊二醛交聯(lián)在電極表面，制成了一種具有良好穩(wěn)定性的傳感器。該傳感器減少了加入電子媒介體的麻煩，并且不需乳化和洗滌，線性范圍為0.53.0和3.0167μg/l，檢出限為0.1μg/l，

9、重現(xiàn)性良好10。他們還研究了基于hrp的直接電子傳遞的免疫cea傳感器，對cea的檢出限為0.3μg/l，并將實際樣品的檢測結(jié)果與臨床檢測方法相比照，獲得了滿意的結(jié)果12。除此之外，研究人員還結(jié)合納米粒子的電子傳導(dǎo)、絲網(wǎng)印刷技術(shù)、微流控裝置、毛細(xì)管電泳和流動注射等技術(shù)對腫瘤標(biāo)記物的檢測進行了研究。 jin等13結(jié)合毛細(xì)管電泳和電化學(xué)檢測技術(shù)，對腫瘤標(biāo)記物ca125進行了檢測。kojima等14設(shè)計了一種包含36個pt微電極的陣列，運用不同的抗體來捕獲腫瘤標(biāo)記抗原，采用電化學(xué)免疫檢測技術(shù)實現(xiàn)了多標(biāo)記物的同時檢測。wilson等15采用雙電極的免疫傳感器同時采用安培法測定了cea和afp，獲

10、得了1μg/l的低檢出限，并有效抑制了交叉干擾。研究表明，這些新技術(shù)在免疫傳感器中的引入，不僅降低了待測物的檢出限，而且可以有效降低共存物質(zhì)的干擾，并可實現(xiàn)多通道同時檢測多種腫瘤標(biāo)記物。由于納米材料的獨特性質(zhì)，使其在實時、靈敏檢測標(biāo)記物方面具有廣泛的應(yīng)用前景。如zheng等16利用抗體功能化的二氧化硅納米線制備了一種新型傳感器，用于在血漿中的癌癥標(biāo)記物的非標(biāo)記實時監(jiān)測。ramanathan等17和willner等18曾報道利用聚合物納米線和碳納米管進行相關(guān)生物親和體系內(nèi)標(biāo)記物的檢測。wu等19將cea/納米金通過殼聚糖固定在絲網(wǎng)印刷電極上，結(jié)合流動注射法建立了一種快速而方便的cea電化學(xué)

11、免疫傳感器，cea檢測的線性范圍為0.5025μg/l，檢出限為0.22μg/l。該傳感器通過流動注射hrp-anti-cea，故可以控制乳化時間，并易于自動化。wang等20將聚鳥嘌呤功能化的二氧化硅納米粒子標(biāo)記壞疽抗體的夾心型傳感器用于壞疽因子的電化學(xué)測定，可直接用于生物樣品中壞疽因子的檢測，檢出限為2.0pmol/l。chen等21在玻碳電極表面氣相沉積納米金/硅溶膠，將hrp功能化的hcg抗體固定于其上，建立了一種無試劑的電化學(xué)免疫傳感器用于hcg的靈敏檢測，其檢出限為0.3miu/ml。wang等1對近年來功能化碳納米管在腫瘤標(biāo)記物上的應(yīng)用進行了綜述。#p#分頁標(biāo)題#e#

12、 12光學(xué)免疫傳感器 由于光學(xué)免疫傳感器具有非破壞性操作、快速獲取信號及使用可見光輻射等優(yōu)勢，故在腫瘤標(biāo)記物的檢測中占有重要地位。根據(jù)其檢測原理，光學(xué)免疫傳感器可分為熒光、化學(xué)發(fā)光和表面等離子體共振等類型。近年來，熒光檢測在臨床診斷和檢測中獲得了很大的進展。nakamura等35結(jié)合流動注射系統(tǒng)和陽離子交換樹脂毛細(xì)管柱制備了hcg免疫傳感器。利用離子交換柱來分離fitc-igg和fitc-igg抗體，然后利用熒光檢測hcg，其線性范圍為251500miu/ml。yan等36將免疫親和反應(yīng)柱與流動注射體系相連接，然后通過時間分辨熒光免疫檢測法進行cea的測定(如圖1所示)。納米材料特別是量子點的

13、引入，使熒光型生物傳感器的發(fā)展尤為引人矚目，zhong37對近年來基于熒光生物傳感中納米材料的應(yīng)用進行了綜述。hong等38對納米金、溶劑對熒光團的熒光效應(yīng)進行了比較研究，發(fā)現(xiàn)納米金試劑的熒光增強效應(yīng)可以使腫瘤標(biāo)記物的檢出限降低10倍，并且對心血管標(biāo)記物crp的檢出限可低至數(shù)10pmol?；瘜W(xué)發(fā)光免疫傳感器多采用直接化學(xué)發(fā)光、化學(xué)發(fā)光基底標(biāo)記和酶標(biāo)記等3種技術(shù)。但大多數(shù)化學(xué)發(fā)光免疫傳感器是利用酶增大檢測信號，并與流動注射系統(tǒng)相結(jié)合來提高其檢測自動化性能。ju等39對化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的自動化進行了較多研究，并對近年來電化學(xué)發(fā)光傳感器在腫瘤標(biāo)記物方面的應(yīng)用進行了綜述。 jie等40首次以gold

14、/silica/cdse-cds雜交納米結(jié)構(gòu)制備了靈敏的電化學(xué)發(fā)光生物傳感器，用于測定cea，獲得了良好的效果。雖然化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的靈敏度高，選擇性好，但是改善腫瘤標(biāo)記物的固定化技術(shù)和傳感器的微型化、集成化仍是化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的發(fā)展方向。表面等離子體共振(spr)是利用金屬膜/液面界面光的全反射來分析生物分子相互作用的一項新興技術(shù)，生物傳感芯片是spr傳感器的核心部分。它對免疫特異識別、蛋白質(zhì)折疊機理、生物特異相互作用的結(jié)合位點及濃度分析上具有獨特的優(yōu)勢，并且可以獲得很低的檢出限(1013109mol/l)。可實時監(jiān)測生物大分子之間的相互作用及其影響因素的作用環(huán)節(jié)，成為疾病診斷和機理研究

15、的有效工具。chou等41將抗人鐵蛋白單克隆抗體固定在spr敏感的金表面，建立了人鐵蛋白的spr免疫傳感器，可以測定非特異性腫瘤標(biāo)記物人鐵蛋白。yu等42基于表面等離子體的衍射建立了hcg的免疫傳感器。corso等43將抗體通過自組裝膜固定在金表面，建立了一種實時靈敏監(jiān)測胰腺癌的腫瘤標(biāo)記物間皮蛋白的聲波免疫傳感器，可以檢測納克級的間皮蛋白(mesothelin)。近年來，諸多研究集中在如何克服spr傳感器檢測小分子靈敏度低的問題，相信隨著spr傳感器在腫瘤標(biāo)記物研究上的深入，其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用將更為廣泛。 13質(zhì)量型免疫傳感器 石英晶體微天平(qcm)型免疫傳感器由于其非標(biāo)記和實時監(jiān)測的特

16、點使其在腫瘤標(biāo)記物的檢測中也有較多應(yīng)用。zhang等44制備了一種2x5模式的多通道壓電qcm用于檢測血液和尿液中的hcg，其檢測效率高，比單通道檢測的速度快8倍以上。kim等45在微芯片上制備了檢測心血管標(biāo)記物crp的qcm免疫傳感器，對crp的檢測線性范圍寬，達到0.1325016μg/l，檢出限為0.13μg/l。 14免疫傳感器在多分析物同時檢測中的應(yīng)用 在醫(yī)學(xué)臨床診斷中，某一種非特異性腫瘤標(biāo)記物的值升高并不能確診癌癥，常需要進行多個腫瘤標(biāo)記物的同時檢測，才能獲得準(zhǔn)確的診斷結(jié)果1。matsumoto等46報道了一種利用時間分辨熒光免疫傳感器同時測定α-afp和c

17、ea，他們采用eu標(biāo)記的抗afp抗體及sm-標(biāo)記的親和素來測定α-afp和cea，獲得了較低的檢出限，它們的檢出限分別為0.07和0.3μg/l，并在實際樣品的測定中獲得了良好的準(zhǔn)確度。song等47用微分析系統(tǒng)熒光免疫傳感器同時測定了cea、afp、β-hcg、ca125、ca19-9和ca15-3，均獲得了較寬的線性范圍，對于cea、afp、β-hcg為0640μg/l，對于ca125、ca19-9和ca15-3為01280μg/l。kojima等14將捕獲抗體固定在雙層硅氧烷層中，制備了微蛋白質(zhì)芯片用于afp和β2-微球蛋白的電

18、化學(xué)免疫檢測，由于采用了夾心型的結(jié)構(gòu)，有效降低了酶催化產(chǎn)物的擴散而獲得較高的靈敏度。wu等48用醋酸纖維素共固定硫堇和2種抗原于絲網(wǎng)印刷芯片的碳電極上，用于ca19-9和ca125的電化學(xué)免疫測定，其檢出限分別為0.2和0.4u/ml。fu等49采用雙通道體系化學(xué)發(fā)光免疫同時檢測α-afp和cea，對α-afp和cea的檢出限分別達到1.5和0.25μg/l。wilson等50-52將微芯片技術(shù)與電化學(xué)免疫結(jié)合，分別進行了cea、afp，4種不同的蛋白質(zhì)及7種腫瘤標(biāo)記物的同時檢測。他們采用多個irox傳感器來降低酶催化產(chǎn)物的擴散，進而在電極上獲得良好的電化學(xué)響應(yīng)，

19、并獲得了較低的檢出限。qureshi等53利用gid電極電容法同時檢測抗crp、α-tnf和il6，其檢測范圍為25pg/ml25ng/ml，為心血管患者提供了良好的前期診斷。能同時檢測多個腫瘤標(biāo)記物的免疫傳感器及微流控芯片系統(tǒng)的應(yīng)用，在癌癥的預(yù)期診斷方面是現(xiàn)今重點發(fā)展的方向。 2適體生物傳感器 核酸適體是一種能夠與蛋白質(zhì)、小分子、離子、核酸、甚至整個細(xì)胞等目標(biāo)分子結(jié)合，通過指數(shù)富集的配位系統(tǒng)進化技術(shù)(selex)經(jīng)體外篩選的人工合成寡聚核苷酸或肽分子。適配體還具有分子量小、易體外合成和修飾、化學(xué)穩(wěn)定性好等優(yōu)點，常被稱為化學(xué)抗體，故一經(jīng)出現(xiàn)便成為化學(xué)工作者用于分子識別和靶標(biāo)物檢測研

20、究的得力工具，為生物分析方法和傳感器的設(shè)計開辟了新的思路54。核酸適體可形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾、假結(jié)、凸環(huán)和g-四鏈體等結(jié)構(gòu)。分子識別時，在目標(biāo)分析物誘導(dǎo)下單鏈核酸適體會折疊成特殊的二級結(jié)構(gòu)。常見的適體與靶體之間的作用有單位點結(jié)合和雙位點結(jié)合(夾心型)2種。研究表明，適配體的結(jié)構(gòu)稍有差異，則靶分子與其結(jié)合就受到阻礙54。顯然，適體的這些特點對于發(fā)展高靈敏、高選擇性和快速高通量的靶標(biāo)分子分析檢測十分重要，并日漸成為分析化學(xué)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用熱點。研究人員已經(jīng)成功地創(chuàng)建了大量基于核酸適體的分析新方法，包括電化學(xué)法、熒光、比色法、壓電和spr等55-57。 21電化學(xué)適體傳感器 電化學(xué)適體

21、傳感器集合了核酸適體和電化學(xué)傳感器的優(yōu)勢，成為近年來的一個研究熱點。在阻抗型電化學(xué)適體傳感器中，適體的固定化程序至關(guān)重要。通常有混合自組裝膜和在自組裝膜上共價固定等幾種方法。wang等58首次報道了識別誘導(dǎo)表面電荷轉(zhuǎn)換的fis適體傳感器。結(jié)果表明，如果體系ph低于目標(biāo)蛋白pi，則蛋白質(zhì)的識別將扭轉(zhuǎn)表面電荷狀態(tài)，促進電子轉(zhuǎn)移，因而會降低電荷轉(zhuǎn)移阻抗。liao等59將適體固定在硅電極表面，用于檢測神經(jīng)炎細(xì)胞因子pdgf，建立了一種無試劑的阻抗生物傳感器，其檢出限達到40nmol/l。kwon等60以抗血管內(nèi)皮生長因子(vegf)適體與羧基聚吡咯納米管構(gòu)建了場效應(yīng)晶體管用以測定vegf，其檢出限為4

22、00fmol/l，可用于實時檢測vegf。當(dāng)核酸適體與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合時，有典型的構(gòu)型變換，而抗體則沒有這樣的性質(zhì)，利用這個性質(zhì)可以設(shè)計構(gòu)型變換型適體傳感器。通常，將適體信標(biāo)的一端修飾官能團用于電極表面的固定化，另一端修飾電活性標(biāo)記物來產(chǎn)生電信號。電信號的大小是由活性標(biāo)記物與電極表面之間的距離決定的。xiao等61將亞甲藍標(biāo)記的抗凝血酶適體固定在電極表面，制備了一種基于電化學(xué)開關(guān)效應(yīng)測定凝血酶的生物傳感器(如圖3a所示)，但該種傳感器在靶分子與適體結(jié)合后信號減小。為了克服這個問題，radi等62-63設(shè)計了另一種開關(guān)裝置用于凝血酶的測定(圖3b)。由于四鏈體的形成，二茂鐵與電極之間的距離大大減

23、小而顯示出電化學(xué)信號。#p#分頁標(biāo)題#e# 由于適體的剛性較差，所以存在較大的背景信號，降低了信噪比和檢出限。zuo等64將二茂鐵功能化的抗atp適體固定在電極表面，在atp存在下，互補序列解離而與atp結(jié)合成三維的剛性結(jié)構(gòu)，進而二茂鐵與電極表面發(fā)生電子傳遞，顯示出開關(guān)的作用，atp的檢測范圍較寬(10nmol/l1mmol/l)并具有高的靈敏度(圖3c)。fan等65將3-端連有羧基二茂鐵的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)dna探針通過5-巰基固定在金電極上，根據(jù)標(biāo)記物雜交前后與電極表面距離的變化進行電化學(xué)檢測，對目標(biāo)dna的檢出限達到1.0x1011mol/l。他們將該方法應(yīng)用于pcr擴增產(chǎn)物的研究，該方法具有

24、pcr擴增產(chǎn)物無需后續(xù)純化、快速檢測的優(yōu)點。chu等66提出了基于免疫-rca的適體電化學(xué)傳感器用于pdgf-bb的超靈敏檢測。在電極表面形成抗體-pdgf-bb-適體-引物復(fù)合體這樣的三明治結(jié)構(gòu)后，引入一種與引物結(jié)合的c型掛鎖探針。該方法結(jié)合了滾環(huán)擴增和酶催化兩步放大，實現(xiàn)了pdgf的超靈敏檢測，下限可達10fmol/l。huang等67采用類似原理將pdgf-bb采用抗體和適體-引物捕獲到電極表面，通過嵌入mb產(chǎn)生電化學(xué)響應(yīng)，其檢測限為18pg/ml。這種基于靶分子的結(jié)合而引起構(gòu)型變換的電化學(xué)傳感器，提供了一種無試劑、再生和靈敏的方法用于復(fù)雜樣品中目標(biāo)分析物的檢測。一些平面分子如亞甲藍、r

25、u(nh3)3+6、功能化二茂鐵等也可以插入雙鏈dna中并經(jīng)dna堿基對π堆積實現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移而被氧化，進而利用特異性序列與蛋白質(zhì)的作用進行電化學(xué)檢測。jin等68利用5-sh的發(fā)卡式結(jié)構(gòu)探針固定于金電極表面，用亞甲基蘭為雜交指示劑檢測p53基因，并對不同位置的單堿基錯配序列進行了研究。該方法無需對發(fā)卡式dna探針進行標(biāo)記，實驗證明發(fā)卡式dna探針有很高的雜交特異性，可以識別單堿基錯配序列，并且錯配堿基位于環(huán)中央時對雜交效率影響最大。 zhang等69在金電極陣列上分別自組裝巰基發(fā)卡式dna探針，采用亞甲藍為雜交指示劑，方波伏安法檢測了人體免疫缺陷蛋白hiv-1和hiv-2，對二者的檢出限均

26、達到了0.1nmol/l。mir等70對凝血酶的不同適體生物傳感器的制備方式對測定結(jié)果的影響進行了詳細(xì)的比較研究。適體在與靶標(biāo)分子特異性結(jié)合后，其三級結(jié)構(gòu)將發(fā)生改變，隨之發(fā)生變化的有適體的電荷密度、吸附性質(zhì)和空間位阻等一系列因素。采用納米材料不僅可以將上述這些變化因素轉(zhuǎn)化為可檢測的光學(xué)、電化學(xué)信號，而且還可以提高分析檢測的靈敏度。numunuam等71首次以cds量子點標(biāo)記二級適體，建立了夾心型電位法測定蛋白質(zhì)的電位傳感器，凝血酶的檢出限為0.14nmol/l。hansen等72利用cds量子點修飾適體建立了7種不同蛋白質(zhì)的同時電化學(xué)檢測，其檢出限為0.5pmol/l，而且具有良好的選擇性。該

27、方法為超痕量的生物標(biāo)記物的檢測及腫瘤的早期診斷提供了可能。polsky等73利用pt納米粒子功能化的適配體進行了凝血酶的電化學(xué)檢測。由于納米粒子對過氧化氫的催化還原，放大了電信號而使凝血酶的檢測限降低到納摩爾的水平。he等74將含有聚腺嘌呤序列的抗凝血酶適配體對納米金予以功能化，然后基于凝血酶與抗體的特異性作用固定在電極表面，然后腺嘌呤核糖酶降解釋放而直接在熱解石墨電極上檢測。由于納米粒子可以載帶較多的適配體，所以檢測靈敏度可以降低至0.1μg/l。li等75在金電極上預(yù)先修飾2種分別含有腺苷酸和凝血酶的適體，捕獲探針預(yù)先用納米金及硫化物納米粒子固定的dna鏈雜交，構(gòu)成了一種夾心型的傳感

28、器用于腺苷酸和凝血酶的陽極溶出伏安測定，其檢出限分別為6.6x1012和1.0x1012mol/l。velasco-garcia等76和hianik等77對適體電化學(xué)生物傳感器的研究進展進行了評述，并對其發(fā)展前景進行了展望?？偟膩碚f，雖然報道的多種構(gòu)建電化學(xué)適體傳感器的方法獲得了較為滿意的分析性能，但對電化學(xué)適體傳感器的分析性能和各項參數(shù)的研究和評價還不充分，在實際體系中的應(yīng)用也還需要拓展。 22光學(xué)適體傳感器 隨著能與蛋白質(zhì)等生物大分子特異結(jié)合的適體的篩選和發(fā)現(xiàn)，基于納米材料的比色技術(shù)日漸成為生物大分子識別和檢測的有力工具。由于適體-納米粒子的比色檢測靈敏度高、操作簡單，因而對蛋白質(zhì)分析和癌

29、癥的診斷具有重要意義。圖4為比色法測定蛋白質(zhì)的基本原理。mao等78利用分子信標(biāo)的特異性識別特性和金納米粒子的光學(xué)特性，建立了快速、靈敏而價廉的檢測dna的方法。liu等79報道了一種納米粒子-適體的生物傳感器可直接用于血液中癌細(xì)胞拉莫斯細(xì)胞的比色法檢測，為循環(huán)系統(tǒng)的癌細(xì)胞提供了一種快捷靈敏的檢測方法，對癌癥的診斷和治療具有較大的作用。lee等80利用spr適體生物傳感器檢測視黃醇結(jié)合蛋白4(rbp4)用于二型糖尿病的診斷。該種方法避免了傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測的測定干擾，可直接用于血液中rbp4的檢測。huang等81采用適體-納米金實現(xiàn)了對乳腺癌標(biāo)志物pdgf-aa、pdgf-ab、pdgf-bb的

30、檢測，其檢出限均能達到納摩爾水平。medley等82以適體修飾的金納米粒子實現(xiàn)了急性淋巴細(xì)胞白血病ccrf-cem細(xì)胞的檢測，并使用伯基特淋巴瘤ramos細(xì)胞做對比檢測，探針對靶標(biāo)細(xì)胞有特異識別，其檢出限為90個癌細(xì)胞。該納米比色探針的選擇性和靈敏度令人滿意。與傳統(tǒng)方法相比，比色法用于蛋白質(zhì)分子檢測有明顯優(yōu)勢，如所需藥品及材料均較廉價，避免了生物分析中的復(fù)雜修飾和分離，不僅保證了適體與靶分子的高度親和性，還極大地簡化了分析檢測步驟，能很好的滿足對現(xiàn)場快速檢測的需求。相信這種方法將以其高靈敏、低成本和較簡便等優(yōu)勢在生物分析和醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。與比色法相比，熒光法由于靈敏度高、特征參數(shù)多

31、、動態(tài)范圍寬和適體與納米粒子作用方式靈活多樣等優(yōu)點，而更具發(fā)展?jié)摿ΑＷ畛Ｒ姷墓鈱W(xué)分子信標(biāo)就是發(fā)卡式分子信標(biāo)，即適體序列的兩端分別標(biāo)記一個熒光團和淬滅團，當(dāng)靶分子與特異序列結(jié)合后，原本相近的熒光團和淬滅團分開，進而顯示出熒光信號。 另一種是在一個已知dna序列上分別配合帶有熒光團和淬滅團的dna序列，當(dāng)靶分子與適體進行特異結(jié)合后，淬滅團序列離開，而顯示出熒光，并用于檢測靶分子83。huang等84將與dna具有親和性的dmdap加入到pdgf適體修飾的納米金溶膠中發(fā)生熒光淬滅，靶分子pdgf的加入使dmdap釋放到溶液中，進而熒光恢復(fù)，實現(xiàn)了對pdgf的熒光檢測，其檢出限可達8pmol/l。量子

32、點與適體的結(jié)合則大大提高了其在細(xì)胞研究中的功能，為癌細(xì)胞的影像診斷技術(shù)及細(xì)胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運提供了可能。bagalkot等85發(fā)展了由阿霉素、適體和cdse/zns量子點組成的雙熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，并將其成功應(yīng)用于體外前列腺癌細(xì)胞的影像、治療和藥物運輸。由于熒光檢測法固有的高度靈敏性和多種納米材料技術(shù)的使用，熒光生物傳感在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究將有更大的發(fā)展和應(yīng)用空間。zhang等86將釕聯(lián)吡啶衍生物作為標(biāo)記物，連接到發(fā)卡式dna上制成電化學(xué)發(fā)光探針，將其自組裝到金電極上構(gòu)成新型電化學(xué)發(fā)光傳感器，根據(jù)雜交前后電化學(xué)發(fā)光信號強度的不同進行目標(biāo)序列的檢測。實驗結(jié)果表明，該發(fā)卡式dna電化學(xué)發(fā)光傳感器有較

33、高的雜交特異性，能夠識別單堿基和多堿基錯配序列，檢出限為9x1011mol/l。該傳感器具有較高的檢測靈敏度，且無需對目標(biāo)分子進行標(biāo)記，有望應(yīng)用于疾病檢測等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。huang等87將含有15個堿基的巰基適體固定在金電極表面，用以結(jié)合凝血酶;另以29個堿基的生物素修飾的適體與凝血酶雜交形成夾心型結(jié)構(gòu)。用親和素修飾的量子點對生物素-親和素的作用進行檢測，制備了一種新穎的化學(xué)發(fā)光適體傳感器。該傳感器對凝血酶的檢測線性范圍為020mug/ml。pollet等88首次將光纖spr傳感器與dna適體相結(jié)合制備了一種可重復(fù)使用、經(jīng)濟而非標(biāo)記的適體傳感器用于研究dna雜交及dna-蛋白質(zhì)之間的相互作用。該傳感