藥用植物代謝組學(xué)發(fā)展

1、藥用植物代謝組學(xué)發(fā)展 【摘要】從技術(shù)步驟、分析方法以及實際應(yīng)用三個方面對當(dāng)前藥用植物代謝組學(xué)研究領(lǐng)域的一些理論問題和實踐中面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行綜述?！娟P(guān)鍵詞】藥用植物；代謝組學(xué)；功能基因組學(xué)代謝組學(xué)是對生物體內(nèi)代謝物進(jìn)行大規(guī)模分析的一項技術(shù)1，它是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分（如圖1所示），藥用植物代謝組學(xué)主要研究外界因素變化對植物所造成的影響，如氣候變化、營養(yǎng)脅迫、生物脅迫，以及基因的突變和重組等引起的微小變化，是物種表型分析最強有力的工具之一。在現(xiàn)代中藥研究中，代謝組學(xué)在藥物有效性和安全性、中藥資源和質(zhì)量控制研究等方面具有重要理論意義和應(yīng)用價值。另外，在對模式植物突變體文庫或轉(zhuǎn)基因文庫進(jìn)行分析之前，

2、代謝組學(xué)往往是首先考慮采用的研究方法之一。目前，國外已有成功利用代謝組學(xué)技術(shù)對擬南芥突變株進(jìn)行大規(guī)?；蚝Y選的例子，這為與重要性狀相關(guān)基因功能的闡明和選育可供商業(yè)化利用的轉(zhuǎn)基因作物奠定了基礎(chǔ)。圖1系統(tǒng)生物學(xué)研究的四個層次略目前，還有許多經(jīng)濟作物的全基因組測序計劃尚未完成，由于代謝組學(xué)研究并不要求對基因組信息的了解，所以在與這些作物有關(guān)的研究領(lǐng)域具有更大的利用價值，這也是其與轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)研究相比的優(yōu)勢之一。代謝組學(xué)研究涉及與生物技術(shù)、分析化學(xué)、有機化學(xué)、化學(xué)計量學(xué)和信息學(xué)相關(guān)的大量知識，fiehn2對代謝組學(xué)有關(guān)的研究方向進(jìn)行了分類（見表1）。1代謝組學(xué)研究的技術(shù)步驟代謝組學(xué)研究涉及的技術(shù)

3、步驟主要包括植物栽培、樣本制備、衍生化、分離純化和數(shù)據(jù)分析5個方面（見圖2）。1.1植物栽培對研究對象進(jìn)行培育的目的是為了對樣本的穩(wěn)定性進(jìn)行控制，相對于微生物和動物而言，植物的人工栽培需要考表1代謝組學(xué)的分類及定義略慮更多的問題，如中藥材在不同年齡、不同發(fā)育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環(huán)境因素的微小差異都可引起生理狀態(tài)的變化，而這些非可控及可控雙重因素的影響很難進(jìn)行精確的控制，從而影響藥用植物代謝組研究的重復(fù)性。為了解決以上問題，推薦使用大容量的培養(yǎng)箱3，定時更換培養(yǎng)箱中栽培對象的位置，以及使用無土栽培技術(shù)等，fukusakie4利用無土栽培系統(tǒng)將水和養(yǎng)分直接引入植物根部，并且對供給量

4、進(jìn)行精確地控制，大大提高了實驗的重復(fù)性。1.2樣本制備為了獲得穩(wěn)定的實驗結(jié)果，樣本制備需要考慮樣本的生長、取樣的時間和地點、取樣量以及樣本的處理方法等問題，并根據(jù)分析對象的分子結(jié)構(gòu)、溶解性、極性等理化性質(zhì)及其相對含量大小對提取和分離的方法進(jìn)行選擇，逐一優(yōu)化試驗方案。maharjanrp等5用6種方法分別對大腸桿菌中代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)用40甲醇進(jìn)行提取的效果最好?，F(xiàn)階段代謝組學(xué)的分析對象主要集中在親水性小分子，尤其是初級代謝產(chǎn)物，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(gcms)和毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（cems）聯(lián)用都是分析親水小分子的重要技術(shù)。fiehno等6使用gcms對擬南芥葉片中的親水小分子進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)酒石

5、酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種植物代謝物。1.3衍生化處理對目標(biāo)代謝產(chǎn)物的衍生化處理取決于所使用的分析設(shè)備，gcms系統(tǒng)只適合對揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，高效液相色譜法（hplc）一般則使用紫外或熒光標(biāo)記的方法對樣本進(jìn)行衍生處理，blauk7對酯化、?；?、烷基化、硅烷化、硼烷化、環(huán)化和離子化等衍生方法進(jìn)行了詳細(xì)的說明。然而離子化抑制常使得質(zhì)譜分析過程中目標(biāo)代謝產(chǎn)物的離子化效率降低，這主要是由于分離過程中污染物與目標(biāo)代謝物難以完全分離開所引起的，優(yōu)化色譜分離時間可有效緩解離子化抑制，然而在實際操作中不可能對上百種代謝產(chǎn)物的分離時間進(jìn)行優(yōu)化，利用非放射性同位素稀釋法進(jìn)行相對定量可以很好的解

6、決該問題。handk等8應(yīng)用同位素編碼的親和標(biāo)記（icat），根據(jù)經(jīng)誘導(dǎo)分化的微粒蛋白及其同位素標(biāo)記物的峰面積比，對該蛋白的相對含量進(jìn)行分析。zhangr等9發(fā)現(xiàn)同位素標(biāo)記技術(shù)也可用于代謝組學(xué)的研究，但是卻存在許多困難?；铙w的同位素標(biāo)記方法對于同位素的洗脫是一種非常有潛力的技術(shù)，目前關(guān)于使用34s的研究已有報道10。圖2代謝組學(xué)研究技術(shù)步驟略1.4分離和定量分離是代謝組學(xué)研究中的重要步驟，與質(zhì)譜聯(lián)用的色譜和電泳分析技術(shù)都是使用紫外或電化學(xué)檢測的方法進(jìn)行定量，其對代謝組數(shù)據(jù)的分辨率與定量能力都有一定的影響。tomitam等11總結(jié)了各種色譜分離法中經(jīng)常遇到的技術(shù)問題，認(rèn)為毛細(xì)管電泳和氣相色譜法由

7、于具有較高的分辨率，已成為代謝組學(xué)研究的常規(guī)技術(shù)手段之一，液相色譜因其適用范圍廣，應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。tanakan等12用高效液相色譜對樣品進(jìn)行分離，認(rèn)為使用硅膠基質(zhì)填充毛細(xì)管整體柱的高效液相色譜系統(tǒng)具有用量少、靈敏性高、低壓降高速分離等優(yōu)勢；同時，tolstikovv等13也使用硅膠填充的毛細(xì)管液相色譜方法對聚戊烯醇類異構(gòu)體進(jìn)行了有效分離，獲得了很好的分辨率。tanakan等14發(fā)現(xiàn)二維毛細(xì)管液相色譜法的分辨率比傳統(tǒng)的高效液相法高10倍。相對于其他色譜方法而言，超臨界流體色譜（sfc）是分離疏水代謝物最具潛力的技術(shù)之一，特別適用于分離那些傳統(tǒng)hplc難以分析的疏水聚合物，bambat等15通過

8、sfc對聚戊烯醇進(jìn)行分析，證明其具有較好的分離能力。針對質(zhì)譜中存在的共洗脫現(xiàn)象，halketjm等16發(fā)明了一種適用于gcms的反褶積系統(tǒng)，對共洗脫的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離與識別。aharonia等17使用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（fticrms）對非目標(biāo)代謝物進(jìn)行分析，快速掃描植物突變樣品，獲得了一定量的代謝成分。與分離一樣，定量能力也是代謝組學(xué)研究中的重要因素，其取決于各分析系統(tǒng)的線性范圍。傅立葉轉(zhuǎn)換核磁共振（ftnmr)、傅立葉紅外光譜（ftir）以及近場紅外光譜法（nir）等技術(shù)由于敏感性低，重復(fù)性受共洗脫現(xiàn)象影響較小也被用于檢測中。近年來，ftnmr技術(shù)常被用于植物代謝組的指紋圖譜研究1

9、8，但由于nmr分析需要樣品量較大，分析結(jié)果易受污染，griffinjl19發(fā)現(xiàn)將統(tǒng)計模式識別與ftnmr相結(jié)合可以對代謝物進(jìn)行全面分析。除ftnmr之外，ftir通過對有機成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行常規(guī)光譜測定，也可適用于代謝組學(xué)的研究，特別是應(yīng)用于構(gòu)建代謝組學(xué)的指紋圖譜。盡管它不能對代謝物進(jìn)行全面分析，但對具有特定功能的組分卻有很好的定量效果，對從工業(yè)及食品原材料中分離的代謝混合物也可以進(jìn)行全面分析，目前，已有學(xué)者將其成功地應(yīng)用于擬南芥20和番茄21代謝產(chǎn)物指紋圖譜的研究中。1.5數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為闡明代謝物復(fù)雜的線性或非線性關(guān)系，需要進(jìn)行多變量分析，將原始的色譜圖數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為數(shù)字化的矩陣數(shù)據(jù)，通過對色譜峰鑒定

10、和整合從而進(jìn)行多變量分析。由于環(huán)境等因素的干擾，光譜數(shù)據(jù)需要通過適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)加工方法進(jìn)行校正，包括：降低噪聲；校正基線；提高分辨率；數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化。jonssonp等22報道了一種關(guān)于gcms色譜圖數(shù)據(jù)處理的方法，可以對大量代謝產(chǎn)物樣品進(jìn)行有效的識別。2代謝組學(xué)中的數(shù)據(jù)分析方法2.1主成分分析法（pca）主成分分析法，將實測的多個指標(biāo)用少數(shù)幾個潛在的相互獨立的主成分指標(biāo)線性組合來表示，反映原始測量指標(biāo)的主要信息。使得分析與評價指標(biāo)變量時能夠找出主導(dǎo)因素，切斷其他相關(guān)因素的干擾，作出更為準(zhǔn)確的估量與評價。pca數(shù)據(jù)矩陣通常來自于gcms，lcms或cems，因此將目標(biāo)代謝產(chǎn)物作為自變量，而相應(yīng)的代謝產(chǎn)

11、物含量作為因變量，定義與最大特征值方向一致的特征向量為第一主成分，依此類推，pca便能通過對幾個主要成分的分析，從代謝組中識別出有效信息。主成分分析有助于簡化分析和多維數(shù)據(jù)的可視化，但是該方法可能導(dǎo)致一部分有用信息的丟失。2.2層次聚類分析法（hca）層次聚類分析法也常用于代謝組學(xué)的研究中，它是將n個樣品分類，計算兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計算新類與當(dāng)前各類的距離。再合并、計算，直至只有一類為止。進(jìn)行層次聚類前首先要計算相似度（similarity），然后使用最短距離法（nearestneighbor）、最長距離法（furthestneighbor）、類間平均鏈

12、鎖法（betweengroupslinkage）或類內(nèi)平均鏈鎖法（withingroupslinkage）四種方法計算類與類之間的距離。該方法雖然精確，但計算機數(shù)據(jù)密集，對大量數(shù)據(jù)點進(jìn)行分析時，更適合選用k均值聚類法(kmc)或批次自組織映射圖法(blsom)，而hca適合將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為主成分后使用。2.3自組織映射圖法(som)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中鄰近的各個神經(jīng)元通過側(cè)向交互作用相互競爭，發(fā)展成檢測不同信號的特殊檢測器，這就是自組織特征映射的含義。其基本原理是將多維數(shù)據(jù)輸入為幾何學(xué)節(jié)點，相似的數(shù)據(jù)模式聚成節(jié)點，相隔較近的節(jié)點組成相鄰的類，從而使多維的數(shù)據(jù)模式聚成二維節(jié)點的自組織映射圖。除pca和hca外

13、，som同樣也可應(yīng)用于包括基因組和轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)研究中23。最初som計算時間長，依靠數(shù)據(jù)輸入順序決定聚類結(jié)果，近年來som逐漸發(fā)展成為不受數(shù)據(jù)錄入順序影響的批次自組織映射圖法(blsom)。由于blsom可以對類進(jìn)行調(diào)整，且有明確的分類標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)化次序優(yōu)于其他聚類法，已在基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析中得到廣泛的應(yīng)用。2.4其他數(shù)據(jù)采礦方法除pca、hca和som外，很多變量分析方法都可用于植物代謝組學(xué)的分析。軟獨立建模分類法(simca)是利用主成分模型對未知樣品進(jìn)行分類和預(yù)測，適合對大量樣本進(jìn)行分析；近鄰分類法(knn)和k平均值聚類分析法(kmn)也可用于樣品分類；主成分回歸法(pcr)或偏最

14、小二乘回歸法(pls)在某些情況下也可使用。然而到目前為止由于還沒有建立一個標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)分析方法，代謝組學(xué)仍然是一門有待完善的學(xué)科。3代謝組學(xué)在藥用植物中的實踐植物藥材來源于藥用植物體，而藥用植物體的形態(tài)建成是其體內(nèi)一系列生理、生化代謝活動的結(jié)果。植物代謝活動分為初生代謝和次生代謝，初生代謝在植物生命過程中始終都在發(fā)生，其通過光合作用、檸檬酸循環(huán)等途徑，為次生代謝的發(fā)生提供能量和一些小分子化合物原料。次生代謝往往發(fā)生在植物生命過程中的某一階段，其主要生物合成途徑有莽草酸途徑、多酮途徑和甲瓦龍酸途徑等。植物藥材含有的生物堿、胺類、萜類、黃酮類、醌類、皂苷、強心苷等活性物質(zhì)的絕大多數(shù)屬于次生代謝產(chǎn)物

15、，因此探討次生代謝產(chǎn)物在藥用植物體內(nèi)的合成積累機制及其影響因素，對于提高活性物質(zhì)含量、保證藥材質(zhì)量、穩(wěn)定臨床療效等具有重要意義。孫視等24通過對銀杏葉中黃酮類成分積累規(guī)律的研究，提出了選擇具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境解決藥用植物栽培中生長和次生產(chǎn)物積累的矛盾。王昆等25以人參葉組織為材料,總結(jié)了構(gòu)建人參葉cdna文庫過程中存在的一些關(guān)鍵問題和應(yīng)采取的對策,為今后關(guān)于人參有效成分如人參皂苷的生物合成途徑及其調(diào)控的基礎(chǔ)研究提供技術(shù)參考和理論指導(dǎo)。最近，美國加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的keasling等26采用一系列的轉(zhuǎn)基因調(diào)控方法，通過基因工程酵母合成了青蒿素的前體物質(zhì)青蒿酸，其產(chǎn)量超過100m

16、g/l，為有效降低抗瘧藥物的成本提供了機遇。經(jīng)過長期的研究積累，人們對代謝途徑的主干部分（為次生代謝提供底物的初生代謝途徑）已經(jīng)基本了解，例如酚類的莽草酸途徑，萜類的異戊二烯二磷酸(ipp)途徑等。被子植物中一些相對保守的次生代謝途徑也得到了很好的研究，如黃酮類、木質(zhì)素的生物合成與調(diào)控。然而，對次生代謝最豐富最神奇的部分特定產(chǎn)物合成與積累的過程，還所知甚少27。4展望近年來，代謝組學(xué)正日益成為研究的熱點，越來越多的人已加入到代謝組學(xué)的研究中。隨著代謝組學(xué)積累的數(shù)據(jù)和信息量的增大，其在藥用植物學(xué)各個領(lǐng)域的應(yīng)用價值也與日俱增。它將不僅能對單個代謝物進(jìn)行全方面的分析，更能尋找其代謝過程中的關(guān)鍵基因、

17、通過代謝指紋分析對藥用植物進(jìn)行快速分類、進(jìn)一步研究藥用植物有效成分代謝途徑以及環(huán)境因子對植物代謝和品質(zhì)的影響與調(diào)控機制。然而依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的指導(dǎo)思想，目前急待解決的是中藥種質(zhì)資源的代謝組學(xué)研究和中藥體內(nèi)作用的代謝組學(xué)研究。同時，代謝組學(xué)在分析平臺技術(shù)、方法學(xué)手段和應(yīng)用策略等方面相對于其他組學(xué)技術(shù)還需要進(jìn)一步發(fā)展和完善，還需要其他學(xué)科的配合和介入。相信隨著更有力的成分分析設(shè)備的使用及代謝組數(shù)據(jù)庫的建立，藥用植物代謝組學(xué)將對中醫(yī)藥學(xué)產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1weckwerthw.metabolomicsinsystemsbiologyj.annurevplantbiol，2003

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