誘導多能干細胞（ipscs）研究現(xiàn)狀與前景展望

1、誘導多能干細胞（ipscs）研究現(xiàn)狀與前景展望劉興夏* 肖羽恒* 張峰偉*（*桂林醫(yī)學院12級臨床3班）聯(lián)系方式導多能干細胞（ipscs）研究現(xiàn)狀與前景展望劉興夏* 肖羽恒* 張峰偉*（*桂林醫(yī)學院12級臨床3班）【摘 要】本文介紹了干細胞基礎研究領域的最新成果和研究趨勢, 對人類可誘導的多能干（induced pluripotent stem, ips）細胞的基礎研究和臨床應用研究進行綜述；運用文獻計量學方法對近年誘導多能干細胞研究的相關文獻進行分析,比較國內(nèi)外誘導多能干細胞研究水平的差距.【關鍵字】誘導多能干細胞(ipscs); escs;重編程;文獻計量學;研究

2、現(xiàn)狀2006年, 日本京都大學yamanaka (山中伸彌)教授所率領的研究小組篩選出了4個在胚胎干細胞或腫瘤細胞中高表達的基因轉錄因子(oct4/sox2/klf4/c-myc, oskm), 并利用逆轉錄病毒載體將這些因子轉染到小鼠成纖維細胞中1。通過這些因子在受體細胞內(nèi)過量表達, 誘導成纖維細胞去分化, 使成體細胞重編程為多能干細胞, 并將其定義為誘導多能干細胞 (induced pluripotent stem cells, ipscs)。ips細胞的主要特征表現(xiàn)為：能夠形成esc細胞樣的集落, 胞核較大核質比高, 堿性磷酸酶(ap)染色呈陽性, 表達內(nèi)源性oct4、sox2和nano

3、g, 端粒酶活性提高, 能在裸鼠體內(nèi)形成畸胎瘤等2。經(jīng)基因芯片分析, ips細胞的基因表達圖譜與胚胎干細胞(escs)相類似, 而與誘導之前的受體細胞明顯不同3。ipscs技術的誕生是跨時代的成果, shinya yamanaka因為這項開創(chuàng)性的實驗榮獲2012年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。1 ipscs技術的發(fā)現(xiàn)有研究者4認為, 是三股研究潮流的融合, 導致了ipscs 技術的誕生。第一股潮流是對核移植的重編程研究。1962年, john gurdon報道了他堪稱經(jīng)典的實驗室研究成果: 將未受精的卵轉入成年蛙的小腸細胞核可以發(fā)育成蝌蚪5。三十多年后, ian wilmut及其同事報告了多莉羊的誕生

4、, 這是通過哺乳類上皮細胞的體細胞克隆產(chǎn)生的首個哺乳類動物6。這些體細胞克隆的成功證明了: 即使已經(jīng)分化的細胞也含有整個生物體發(fā)育所需要的全部遺傳信息, 卵母細胞含有可以重編程體細胞核的因子。第二股研究潮流是發(fā)現(xiàn)“ 主控的” 轉錄因子。1987年, 科學家證明哺乳動物轉錄因子myod能將成纖維細胞轉換為肌細胞7。這些結果形成了“主控的調節(jié)因子”概念, 該轉錄因子決定并誘導細胞譜系的命運。第三股研究潮流涉及escs, 具有以上同樣的重要性。自1981年第一代小鼠escs8建系之后, aus-tin smith 等確立了能夠長期維持干細胞多能性的體外培養(yǎng)條件9。結合前兩個研究潮流, 我們提出這樣一

5、種假設: 卵母細胞或escs中存在一種多個因子的組合, 這種組合可以將體細胞重編程回到胚胎狀態(tài), 于是有人110設計實驗來確定這種組合。2 ipscs技術的成熟和理解2006年8月, 日本科學家takahashi和yamanaka率先在cell上發(fā)表研究成果, 其小組利用oct4、sox2、c-myc和klf4 這4種基因將小鼠成纖維細胞誘導為ips細胞1.2007年11月, yamanaka小組又利用oct4、sox2、c-myc和klf4 4種基因將人皮膚成纖維細胞重編程為ips細胞11.2.1重編程概述ips 細胞和es細胞功能類似, 且具有超越es細胞的優(yōu)勢, ips 細胞可以由體細胞

6、生成, 從而繞開了es細胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙。但科研人員長期受困于ips細胞誘導效率低下、速度慢、組成復雜等障礙。對于體細胞重編程過程的具體細節(jié)至今仍知之甚少。細胞核重編程是指, 成熟的細胞由分化的狀態(tài)被逆轉到一種未分狀態(tài)的過程12.細胞核的重編程現(xiàn)象最早是在核移植實驗中被發(fā)現(xiàn)的13.然而, 體細胞核移植實驗也具有很大的局限性: 克隆的效率極低; 產(chǎn)生的許多后代在各個階段都體現(xiàn)出嚴重的發(fā)育異常; 由于需要使用卵母細胞, 人的核移植實驗受到強烈的倫理學質疑.這些不足, 都制約了核移植技術的進一步發(fā)展和應用.其次, 將成熟的體細胞與多潛能的細胞 (es細胞、胚胎癌細胞(ec細胞)

7、等) 融合1417, 或者用胚胎干細胞提取物來處理體細胞1819, 也可以在一定程度上使體細胞發(fā)生重編程.利用這兩種方法, 可以實現(xiàn)某些多能性標志分子的重新表達和多種分化潛能的獲得.但是這兩種方法也有明顯的弊端. 體細胞與多能性細胞的融合效率比較低, 融合之后的細胞具有兩套染色體, 并且在移植后會發(fā)生排斥現(xiàn)象20.通過外源導入與多能性相關的轉錄因子來誘導體細胞核發(fā)生重編程, 從而使體細胞轉變成多能性干細胞, 是一種具有很強創(chuàng)新性的研究方法, 這種新方法與上述幾種方法相比, 相對簡單, 擺脫了材料來源和倫理學的諸多限制, 重編程的效率和程度都十分可觀, 因而該研究成果引起了生命科學領域一次巨大的

8、轟動.2.2 “初始化”之謎體細胞在外源轉錄因子的誘導下的重編程之后會被“初始化”到一種具有多種分化潛能的狀態(tài).由于何種因子啟動了細胞重編程的程序, 隨著研究的進展有多種不同的說法。yamanaka1率先發(fā)現(xiàn)ipscs時, takahashi和yamanaka從已報道的24個與多能性維持相關的候選基因中篩選出4個關鍵基因。在當時的條件下, 他們檢測了4 種基因的不同組合方式能否產(chǎn)生ips 細胞, 結果表明, 這4個基因中的任意2個或3個組合, 都無法形成具有es細胞特性的ips 細胞, 說明這4個基因缺一不可21. 這就是這4個關鍵基因( oct4 , sox2, c- myc 和 klf4)

9、 的發(fā)現(xiàn)過程. 在2009年以前, 除了thomson 等人22利用自己的方法篩選出了另外一套基因組合之外, 幾乎其他所有關于ips 細胞的研究都采用yamanaka 和takahashi所采用的這4種基因21. 在誘導細胞的4個基因中, c-myc是明確的癌基因, klf4也被證實與腫瘤發(fā)生相關.通過改變篩選的基因, 獲得了更接近escs的細胞。同時發(fā)現(xiàn)20%的轉染細胞后代出現(xiàn)腫瘤, 以及逆轉錄病毒的不安全23。因此, yamanaka 等24通過去除轉染及藥物篩選, 證實其他3個基因便可以使野生型小鼠及人細胞誘導成為ips細胞, 從而避開了c-myc過表達導致腫瘤的可能. 隨后, huan

10、gfu等25發(fā)現(xiàn)oct4 和 sox2 兩個基因就可以誘導人成纖維細胞產(chǎn)生 ips 細胞, 更進一步避開了 klf4 導致腫瘤的可能性。kim等2627證實, 單一向成年小鼠神經(jīng)干細胞中導入oct4 與 sox2 兩個基因, 甚至 oct4 一個基因即可將其轉化成 ips 細胞. 目前比較一致的觀點就是 c-myc 啟動了再編程的過程, 但在細胞向干細胞轉變的過程中, 則是 oct3/4、sox2 和 klf4 這3個基因的作用, 因此, c-myc 在 ips 的過程中并非必需的因子28。除了使用整合的逆轉錄病毒和慢病毒轉染, 還有報道許多方法能夠產(chǎn)生非整合的ipscs 。這些方法包括質粒2

11、930、仙臺病毒31、腺病毒32、合成rna33和蛋白質34。此外, 也已經(jīng)嘗試由小分子誘導重編程。麻省總醫(yī)院、哈佛干細胞研究所組成的一個國際研究小組, 在新研究中繪制出了體細胞重編程為ips 細胞的分子線路圖35.研究人員證實誘導多能性過程引起了兩次轉錄波, 第一波是由c-myc/klf4 驅動, 第二波是由oct4/sox2/klf4驅動。難以發(fā)生重編程的細胞激活了第一波, 但卻無法啟動第二轉錄波, 提高4個因子的表達則可以解決這一問題。此外, 研究人員發(fā)現(xiàn), 在第一波后逐漸形成了一些雙價基因(bivalent genes), 而在第二波后細胞獲得穩(wěn)定的多能性之時細胞才發(fā)生dna甲基化改變

12、。研究人員還確定了在重編程過程中充當路障的基因, 以及細胞進一步富集從而使之更易于形成ips 細胞的表面標記物.這些認識對于提高重編程的效率及其未來的治療應用具有非常重要的意義.2.3 ipscs的巨大優(yōu)勢2.3.1免疫原性有限ipsc來自患者自身的體細胞, 因此與escs相比較, 移植回患者體內(nèi)可一定程度的避免機體的免疫排斥反應。為了廣泛應用, 有必要提前建立一個儲備庫, 挑選來自健康志愿者或臍帶血庫的質量合格的ipscs 克隆。hla純合子捐助者產(chǎn)生的ipscs 能顯著降低免疫排斥35最近的研究來自日本的科學家, 他們利用小鼠ips 細胞生成了皮膚和骨髓, 并將它們移植到基因相同的小鼠體內(nèi)

13、, 證實不會引發(fā)強烈的免疫反應36.研究結果發(fā)表在nature雜志上,應該可以消除人們對ips 細胞的一些疑慮.有報道整理說37, 日本國立放射學研究所的masumi abe研究小組用將ips 細胞或es細胞與小鼠胚胎相融合, 隨后小鼠胚胎發(fā)育形成了包含各種細胞類型的嵌合子小鼠。然后, 他們將來自這些動物的皮膚移植到基因相同的小鼠身上。來自兩組的移植物在2 個月后仍然如前, 表明ips 細胞和es細胞一樣, 觸發(fā)的免疫反應極其微小。骨髓移植物顯示出同樣的情形。不論是來自ips 細胞是es細胞, 它們同樣能很好地存活, 讓遭受致命輻射的小鼠的骨髓獲得重建。實驗中沒有觀察到對ips 細胞或es細胞

14、衍生的組織的免疫反應, 包括t細胞浸潤、退化皮膚和畸胎瘤的組織中免疫原性引起的zg16和hormad1 基因也沒有增加。研究結果表明, ips 細胞與es細胞分化的移植細胞的免疫原性有限。但有限的免疫原性, 不代表沒有. 有報道說非轉基因的ipscs 具有弱免疫反應, 這個問題是否重要38目前尚不清楚, 因為最突出的研究報道了被檢查的未分化ipscs 具有免疫原性39, 當然這種細胞絕不會被用于細胞移植治療。我們必須了解所有這些結果, 并綜合考慮全面認識ipscs。2.3.2避開倫理爭議胚胎干細胞有以下幾個來源:從發(fā)育良好的囊胚中分離內(nèi)細胞群細胞。從5 9周的胚胎生殖腺中分離胚胎干細胞。利用克

15、隆技術( 治療性克隆) 獲得。即將體細胞核移植到去核卵母細胞中, 使之發(fā)育成囊胚, 再分離其內(nèi)細胞群細胞40。無論是何種來源, 都必須破壞胚胎的完整性, 等于說是殺死了一個“有潛力的生命”, 因此escs的研究引發(fā)了宗教界和保守人士的強烈質疑。ipscs的制造不需要利用胚胎,并且它擁有與escs功能很相近的多向分化能力。盡管它們的起源和生成方法不同, 人造細胞和天然存在的細胞之間存在如此相似性, 絕無僅有。如神經(jīng)細胞和心肌細胞這些體細胞已經(jīng)可從escs/ipscs 產(chǎn)生, 或直接從成纖維細胞產(chǎn)生。ipscs技術一經(jīng)問世, 就被很多科學家和媒體評價其未來將在生命科學和醫(yī)學研究領域里發(fā)揮escs所

16、不能達到的效果。3誘導多能性的安全性盡管現(xiàn)在的技術已經(jīng)可以剔除誘導因子中的癌基因,并使用安全性較好的載體, 但ipscs依然被認為有潛在異常。有些報告認為, 除了基因表達變異、dna甲基化和多能性的潛力外, ipscs還有其他的潛在異常, 包括體細胞突變、拷貝數(shù)變異和免疫原性。在這些報告中, 在yamanaka看來10, ipscs的負面影響被夸大了。yamanaka認為媒體的反應過度, 隨之而來的科學評論標題也聳人聽聞, 如“黑暗的一面”、“受到攻擊”、“漏洞”、“麻煩”和“成長中的煩惱”等。然而, 盡管有這些負面新聞, 隨后的分析表明, 許多ipscs 內(nèi)發(fā)現(xiàn)的遺傳差異似乎早已存在于原始的

17、體細胞中, 因此, 與重編程過程本身無關10。另一項研究顯示, 一組能夠產(chǎn)生all-ipscs 小鼠的ipscs 克隆, 相對于它們的親本細胞來說其遺傳改變極小41。沒有轉myc基因的ipscs 所產(chǎn)生的嵌合體小鼠及其后代顯示生理正常, 表明這些ipscs 不含有對功能有負面影響的有害遺傳改變42-43。每種誘導方法會產(chǎn)生多個質量不同的ipscs 克隆。因此, 臨床應用時必須優(yōu)選克隆。我們必須確認其體外分化傾向、基因組及表觀基因組的完整性。4 ipscs技術應用研究進展4.1 ipscs技術出現(xiàn)新的技術潮流科學的發(fā)展潮流永無止息?？茖W家們使用ipscs 在再生醫(yī)學領域中已取得不斷的進展。ips

18、cs技術可以將患有某種特定疾病的病人的成體細胞重編程為人類干細胞, 從而使ips細胞中包含一套完整的導致該疾病的基因, 這相當于構建了研究該病并測試新藥物和療法的良好人類模型。將來, 在培養(yǎng)皿中即可利用ips細胞為各個病人進行藥物安全性和有效性測試。george daley44( 建立特定疾病的ipscs) 和kevin eggan45(als病人來源的ipscs 能夠分化成運動神經(jīng)元) 領導的團隊在建立特定疾病ipscs 的開創(chuàng)性研究之后, 過去三年中已經(jīng)發(fā)表了100 多份使用特定疾病的ipscs 報告。 使用特定病人的ipscs 既可重演單基因遺傳性疾病表型也可重演遲發(fā)性多基因遺傳性疾病的

19、表型, 如帕金森氏病46、阿爾茨海默癥47-49和精神分裂癥50。用這些細胞來分析疾病機制和研究潛在的新治療方法, 環(huán)繞這些方面的潛在應用, 已經(jīng)成為研究的興奮點。來自ipscs 的體細胞, 特別是心肌細胞和肝細胞, 可以替代現(xiàn)有的方法用于毒理學試驗51。除了這些醫(yī)療應用, ipscs可用于動物生物技術。其中最引人注目的ipscs 應用來自nakauchi 及其同事們的報道, 他們將大鼠的ipscs 通過顯微注射, 移植到因缺乏一個重要基因而胰腺不能發(fā)育的小鼠囊胚后, 小鼠胚胎發(fā)育后產(chǎn)生了大鼠胰腺52。將來, 使用類似的策略可能實現(xiàn)生產(chǎn)器官來供給人體移植。ipscs 技術出現(xiàn)另一種研究潮流是將

20、一種體細胞“直接重編程”為另一種細胞。正如上面提到的, 對于大多數(shù)體細胞, 還沒能找出一個單一“主控的”轉錄因子。然而, 根據(jù)ipscs 重編程的成功經(jīng)驗, 科學家們轉而尋找因子的組合。melton及其同事報道了使用含有3種轉錄因子的組合將小鼠胰腺內(nèi)分泌細胞轉化為外分泌細胞53。在他們開創(chuàng)性的工作之后, 有許多報道是將成纖維細胞在體外轉換為各種其他體細胞的例子10, 如神經(jīng)細胞、肝細胞、心肌細胞和造血祖細胞。直接重編程簡單、快速。剩下的障礙是如何獲得足夠量的靶細胞用于下游的應用。這種新技術的最佳用法可能是原位直接重編程54。直接重編程具有許多的優(yōu)勢, 能夠將成體細胞直接重編程為其他類型的細胞而

21、無需先將成體細胞恢復至多能狀態(tài)。4.2 ipscs技術臨床應用研究進展4.2.1鐮刀形紅細胞貧血癥2007年, hanna 等人55開創(chuàng)性地在小鼠中用ips 細胞治療了鐮刀形紅細胞貧血癥(sickle cell anemia).隨后有大量的ips細胞應用于臨床治療的研究被報道。4.2.2 帕金森氏病/阿爾茲海默癥帕金森病作為一種中、老年人的疾患, 其發(fā)病率隨年齡而上升.其主要病理改變是中腦黑質多巴胺能神經(jīng)元漸進性變性壞死. 2002年首次報道胚胎干細胞分化產(chǎn)生的多巴胺神經(jīng)元向紋狀體移植治療帕金森病大鼠模型獲得成功5657.wernig 等人58通過體外培養(yǎng)將 ips 細胞分化為神經(jīng)前體細胞(n

22、eural precursor cells), 并形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞. 將ips 細胞衍生的神經(jīng)細胞移植入胎鼠腦中, 這些細胞可整合進受體鼠的腦中, 形成神經(jīng)膠質細胞和神經(jīng)元細胞 .該實驗證明了用ips 細胞進行細胞替代療法治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的可行性.2011年, kriks等人59報道利用ips細胞治療帕金森氏病取得了進展。利用帕金森癥患者的皮膚細胞培育出了ips細胞，并能將其分化為多巴胺神經(jīng)元細胞，這是帕金森癥患者大腦中所缺少的一種重要細胞。4.2.3心血管疾病2008年和2009年, narazaki等人60和zhang 等人61分別將小鼠和人的ips細胞分化為多種心血管細胞, 例如

23、, 血管內(nèi)皮細胞、淋巴內(nèi)皮細胞和心肌細胞, 證明了ips細胞治療心血管疾病的應用價值.2013年, cell stem cell報道了日本利用ips 細胞開發(fā)出低成本大量制作心肌細胞的方法62.使用該制作方法得到的心肌細胞中幾乎不存在具有癌化風險的ips細胞或es細胞.實驗證明,將心肌細胞移植到猴子的心臟中也不會發(fā)生癌化.福田教授說,“該方法不需要利用昂貴的設備進行細胞篩選即可獲得純度高達99% 的心肌細胞.”4.2.4癌癥日本科學家的最新研究結果表明, ips 細胞可用來大量培育具有抗癌功能的免疫細胞, 將來有望在此基礎上開發(fā)出治療癌癥的新型免疫療法.研究結果發(fā)表在近期的cell stem

24、cell上6263.現(xiàn)有的免疫療法常是單純刺激患者的t淋巴細胞以使其增殖, 但是由于難以大量增加, 效果很有限. 此次開發(fā)的方法能夠大量培養(yǎng)t淋巴細胞, 所以有望解決這個問題.5 ipscs研究現(xiàn)狀的文獻計量學分析查閱反映期刊的影響力大小的sci影響因子(journal citation reports) , 2009年cell stem cell(干細胞研究領域的權威雜志)影響因子達到了23.563, 繼2008年這一刊物影響因子達到16.826之后再次飛躍。2011年（2012年的結果將在今年6月公布）其影響因子繼續(xù)保持高位, 達到25.421。cell stem cell創(chuàng)刊不到6年,

25、影響因子從0一沖至16.826,又達到了25.421, 這主要得益于近幾年來干細胞領域發(fā)展迅速, 潛力巨大。另外一個生命科學領域刊物影響因子發(fā)展迅猛的是國內(nèi)的cell research：其2009年的影響因子從4.535升至8.151, 在國際細胞生物學領域發(fā)表原創(chuàng)論文的147種核心期刊中排名第14位, 首次進入前10%, 并連續(xù)5年在中國科技期刊中排名第一。2011年該刊物影響因子為8.19。5.1 ipscs研究年度發(fā)展趨勢對20002013年ipscs領域的文獻進行檢索, 檢索到相關文獻6429篇(數(shù)據(jù)庫更新日期為2013年4月13日, 由于數(shù)據(jù)庫收錄的滯后性, 2013年的數(shù)據(jù)未完全收

26、錄, 僅供參考),文獻數(shù)量呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。自ipscs于2006年誘導成功后, 相關研究得到了世界各國的廣泛關注, 許多科研機構和研究人員投入到ipscs的研究中。對該領域研究的重視程度也體現(xiàn)在文獻的數(shù)量上, 在短短的4年時間內(nèi), ipscs相關文獻的數(shù)量已經(jīng)達到近千篇。5.2 ipscs研究國家(地區(qū))分布分析對ipscs研究文獻的國家(地區(qū))分布分析發(fā)現(xiàn)64, 美國以顯著的文獻數(shù)量優(yōu)勢位居首位, 其發(fā)文量占總文獻量的近半數(shù)。中國雖然位居第4位, 但是文獻量僅有71篇, 與美國、日本等發(fā)達國家仍然存在較大的差距。被引頻次能夠在一定程度上反映文獻的質量, 一個國家發(fā)表文獻的篇均被引頻次則能

27、夠從一個側面反映該國的研究水平。此外, 利用各國的篇均被引頻次與其相對比, 從中可以看出各國的科研實力在國際上的相對水平。從這兩個指標來看, 日本的科研水平相對較高, 而美國盡管在文獻數(shù)量上超過日本, 但文章的平均質量不及日本。我國在ipscs領域中的科研實力與世界先進水平相比仍然存在一定的差距, 但近年來, 我國的科研工作者正在不斷努力, 并獲得了一系列具有國際影響力的科研成果, 使中國在ipscs領域的研究不斷向世界先進水平邁進。5.3 ipscs研究機構分布對從事ipscs研究的機構進行分析發(fā)現(xiàn)64, 文獻量前20位的機構中, 一多半來自美國。美國哈佛大學和日本京都大學分別排在前兩位,

28、這兩個機構也是ipscs研究的開創(chuàng)者。中國只有一個機構進入前10位的行列, 即中國科學院, 位列第5位, 但文獻數(shù)量與國際先進機構相比仍然具有較大差距。6總結和展望我們相信, ipscs技術對于許多應用（包括干細胞療法）已準備就緒。ips細胞技術在未來將在這三個方面有作用：1 再生醫(yī)學。ipscs技術所建立的體系能為當前人們很難解決的疾病提供可行的醫(yī)療方案。ips細胞由患者自身體細胞誘導產(chǎn)生，可以避免倫理、免疫排斥等問題. 因此，ips細胞有更廣闊的應用前景，在再生醫(yī)學領域有巨大的應用潛力和優(yōu)勢.2 藥物安全性試驗。許多的藥物所導致的健康問題是直到臨床試驗才發(fā)現(xiàn)的。利用ips技術，利用重編程人

29、類成體細胞形成心臟細胞，將之用于藥物研發(fā)過程的早期階段的毒性試驗，從而實現(xiàn)節(jié)省花費在昂貴的動物及人體試驗上的時間與成本。3 個體化醫(yī)學。由于每個病人獨特的遺傳組成，藥物在不同病人身上所產(chǎn)生的反應也不同。利用病人自身的細胞，研究者可以通過ips細胞來生成具有病人dna的大腦、心臟、肝臟等器官以及其他細胞。這些細胞然后可以被用于特定患者的藥物反應試驗，或者用于移植與再生。參考文獻1 takahashi k, yamanaka s. induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultur

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