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1、園藝學(xué)報(bào),(): 2014411224652473 http: / www. ahs. ac. cn acta horticulturae sinica e-mail: yuanyixuebao 收稿日期:20140711;修回日期:20140925 基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31370014,31000315);國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(cars-23) 的茶樹鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因cs-oat克隆與表達(dá)分析 王偉東,疏再發(fā),杜昱林,黎星輝,王玉花* (南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所,南京 210095) 摘 要:根據(jù)已知鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(-oat)的保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,并利用rt
2、-pcr和race技術(shù)從迎霜茶樹中克隆獲得鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因,命名為cs-oat,其genbank登錄號(hào)為kj641844。該基因cdna全長(zhǎng)為1 865 bp,編碼473個(gè)氨基酸,理論等電點(diǎn)為7.19,推測(cè)分子量為52.3 kd。序列比對(duì)分析結(jié)果表明,cs-oat主要功能域保守性較高,存在典型的plp結(jié)合位點(diǎn);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示,cs-oat的進(jìn)化符合傳統(tǒng)的生物學(xué)分類,與其他雙子葉植物具有同一起源。qrt-pcr分析結(jié)果表明,cs-oat基因的表達(dá)存在明顯的組織特異性,在花中表達(dá)最高,其次是葉片,而在其他組織器官中表達(dá)較低。此外,cs-oat基因受高鹽、低溫、干旱、aba和氧化脅迫處理的誘導(dǎo),
3、表明其參與了茶樹體內(nèi)各種非生物脅迫響應(yīng)的過(guò)程。 關(guān)鍵詞:茶樹;鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶;cs-oat;克隆;表達(dá)分析 中圖分類號(hào):s 571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:a 文章編號(hào):0513-353x(2014)12-2465-09 cloning and expression analysis of ornithine-aminotransferase gene cs-oat in camellia sinensis wang wei-dong,shu zai-fa,du yu-lin,li xing-hui,and wang yu-hua* (tea research institute,nanjing agr
4、icultural university,nanjing 210095,china) abstract:degenerate primers were designed according to the known conserved regions of ornithine- -aminotransferase gene(-oat),and the complete cdna sequence of -oat was firstly cloned from camellia sinensis using rt-pcr and race technologies. the cdna was t
5、ermed cs-oat(genbank accession kj641844)and its full-length was 1 865 bp encoding a protein of 473 amino acids. the molecular weight of cs-oat was 52.3 kd and theoretical isoelectric point was 7.19. the blast results showed that the functional domain of cs-oat is highly conserved with a typical plp
6、binding site. phylogenetic analysis of plant -oat reveals that the evolution of cs-oat corresponds with traditional biological classification. qrt-pcr analysis results showed that the expression of cs-oat has obvious tissue specificity,and it was higher in flower,followed by leaves,but lower in othe
7、r tissues. moreover,we found that the expression of cs-oat is induced by different abiotic stresses,including low- temperature,high salinity,aba,drought and oxidative stresses,implying that cs-oat is involved in * 通信作者 author for correspondence(e-mail:wangyuhua) 2466 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 responding to abioti
8、c stress in plants. key words:tea plant;ornithine-aminotransferase;cs-oat;cloning;expression analysis 茶樹camellia sinensis(l.)o. kuntze容易遭受干旱、低溫和土壤污染等引起的非生物脅迫,導(dǎo)致茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)降低,最終影響茶葉生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益(王新超和楊亞軍,2003)。因此,發(fā)掘茶樹的抗性基因,培育抗性品種具有重大意義。 脯氨酸參與植物對(duì)多種逆境脅迫的響應(yīng),在提高植物抗逆性中發(fā)揮重要作用(焦蓉 等,2011b;謝虹 等,2011)。高等植物中脯氨酸的合成代謝有谷氨酸(g
9、lu)和鳥氨酸(orn)兩條途徑,1吡咯啉5羧酸合成酶(p5cs)是谷氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶,而鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(-oat)是鳥氨酸合成途徑的關(guān)鍵酶(全先慶 等,2007;趙瑞雪 等,2008)。許多研究表明,-oat對(duì)逆境脅迫下脯氨酸的積累起著重要作用,roosens等(2002)將擬南芥的-oat過(guò)表達(dá)至煙草中,顯著增加了煙草脯氨酸的含量,其抗旱性得到顯著提高;wu等(2003)將擬南芥的-oat遺傳轉(zhuǎn)化至水稻中,顯著提高了水稻的耐鹽能力;roosens等(1998)的研究表明,-oat的表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。目前,-oat已從擬南芥(roosens et al.,1998)、甘蔗(張積森 等,
10、2009)、豌豆(strnsk et al.,2010)和煙草(焦蓉 等,2011a)等植物中克隆得到,但有關(guān)-oat功能的研究相對(duì)滯后,其參與植物逆境響應(yīng)的作用機(jī)制尚不清楚。 本研究中從茶樹中克隆得到了cs-oat基因的cdna全長(zhǎng)序列,利用生物信息學(xué)手段初步分析了該基因的結(jié)構(gòu)和功能,并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)分析了該基因在各種非生物脅迫中的表達(dá)模式,以探究cs-oat與茶樹抗逆性的關(guān)系,為茶樹抗逆基因工程提供候選基因資源,為茶樹分子遺傳育種提供理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 植物材料與處理 基因克隆以體外培養(yǎng)的迎霜茶樹花粉管為試驗(yàn)材料,花粉的收集和培養(yǎng)方法參考陳暄等(2011)所述。
11、脅迫處理試驗(yàn)于2013年8月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉研究所進(jìn)行,選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4年生迎霜茶樹苗為材料進(jìn)行水培培養(yǎng),培養(yǎng)液的配制參考wan等(2012)所述。將水培茶苗于光照培養(yǎng)箱中(晝夜溫度25 /22 ,光周期12 h/12 h,光照強(qiáng)度240 mol m-2 s-1,相對(duì)濕度75% 80%)預(yù)培養(yǎng)兩周后進(jìn)行不同的脅迫處理,包括低溫(4 )、nacl(600 mmol l-1)、aba(50 mol l-1)、peg 6000(20%)和h2o2(100 mmol l-1)。分別于0、1、2、4、8、12和24 h時(shí)取一芽?jī)扇~各0.1 g,并將所取材料置于液氮中速凍,70 冰箱保存?zhèn)溆谩?分別取迎
12、霜茶苗的根、莖、葉、芽、花和果各0.1 g,并將所取材料置于液氮中速凍,70 冰箱保存,用于基因的組織特異性表達(dá)分析。 1.2 總rna提取和cdna合成 用rnaiso plus(takara,日本)提取培養(yǎng)后的茶樹花粉管和其他組織材料的總rna,并用dnase去除基因組dna污染。用one droptm od-1000 + spectrophotometer(one drop,usa)檢測(cè)rna濃度和質(zhì)量,瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)rna的完整性和穩(wěn)定性。使用primescripttm 1st strand cdna sycshesis kit(takara,大連)進(jìn)行cdna第1鏈的合成。參照s
13、mart race cdna synthesis kit(clontech,美國(guó))的操作步驟合成race擴(kuò)增所用的cdna。 12期 王偉東等:茶樹鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因cs-oat的克隆與表達(dá)分析 2467 1.3 茶樹cs-oat的克隆 表1 引物序列 table 1 sequences of primers in this study 引物名稱 primer name 序列(53) sequence -oat f gtyaatcagggacaytgycayccwa -oat r agcatnacdtytttrtcdgcrag 3gsp1 atgaatactggtgccgaagg 3gsp2 g
14、tctcgtgttgtggctgctt 5gsp1 caacatctgggcgaact 5gsp2 atggaagcagccacaac cs-oat f aatctacaacttcatcgctcagcgccct cs-oat r ggtacccaacaaaattttattcacaat qcs-oat f gcggttaatcagggacat qcs-oat r acaccttcggcaccagta q-actin f gccatctttgattggaatgg q-actin r ggtgccacaaccttgatctt 利用dnaman軟件對(duì)genbank中已公布的葡萄、蓖麻、平邑甜茶、毛果楊
15、、煙草、白菜、甘藍(lán)型油菜、擬南芥和楊樹-oat酶的氨基酸序列進(jìn)行同源分析,然后根據(jù)-oat基因的保守區(qū)段,利用primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物-oat f和-oat r(表1),擴(kuò)增一段長(zhǎng)度為680 bp左右的中間片段。根據(jù)已獲得茶樹cs-oat基因的中間片段序列設(shè)計(jì)3、5-race引物3gsp1、3gsp2,5gsp1和5gsp2(表1),并結(jié)合通用引物分別擴(kuò)增出該基因的3和5端序列。將所得的兩端序列與中間片段序列拼接得到基因全長(zhǎng),設(shè)計(jì)一對(duì)全長(zhǎng)引物cs-oat f,cs-oat r(表1)高保真擴(kuò)增出基因的全長(zhǎng)。所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)
16、1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,將目的條帶按照gel extraction kit(omega)使用說(shuō)明進(jìn)行回收,連接到pmda18-t vector(takara),由南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。 1.4 cs-oat生物信息學(xué)分析 利用ncbi進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析;用protparam預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn);用smart(http:/smart. embl-heidelberg. de/)進(jìn)行保守域分析;用dnaman 6.0進(jìn)行多序列氨基酸同源性比較;用mega 6.0軟件中的鄰近相連法(nj,neighbor joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;用wol
17、f psort(http:/wolfpsort. org/)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè);用tmpred(http:/www. ch. embnet. org/software/tmpred_form. html)預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域;用netphos 2.0 serve(http:/www. cbs. dtu. dk/services/netphos/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn);用swiss-model(http:/swissmodel. expasy. org/workspace/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。 1.5 cs-oat熒光定量pcr分析 以茶樹-actin(孫美蓮 等,2010)作為內(nèi)參基因,參照s
18、ybr premix ex taqtm(takara,大連)的操作說(shuō)明書對(duì)cs-oat基因的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量pcr分析,pcr體系為:sybr premix ex taq 10 l,上、下游引物各1 l,cdna 5 l,rnase free ddh2o 加至20 l。在eppendorf熒光定量pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 預(yù)變性60 s;95 15 s,60 15 s,72 45 s,40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線,采用2-ct法分析結(jié)果(livak & schmittgen,2001),每個(gè)樣品3次重復(fù)。使用primer premier 5.0設(shè)計(jì)cs-oa
19、t熒光定量所需的引物qcs-oat f、qcs-oat r和q-actin f、q-actin r(表1)。 用excel 2010和spss 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。 2 結(jié)果與分析 2.1 cs-oat基因克隆與序列分析 用簡(jiǎn)并引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增,獲得1條680 bp的中間片段(圖1,a1),該片段經(jīng)ncbi比對(duì)與其他已知植物的-oat序列有較高同源性,由此判斷為茶樹-oat基因cdna的部分序列。根據(jù)獲 2468 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 得的中間片段序列設(shè)計(jì)race特異性引物進(jìn)行巢式pcr擴(kuò)增,5-race擴(kuò)增獲得1條長(zhǎng)度為761 bp的特異性片
20、段(圖1,b3、b4),3-race擴(kuò)增獲得1條長(zhǎng)度為1 201 bp的特異性片段(圖1,b1、b2)。序列拼接后設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物,經(jīng)高保真pcr擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為1 865 bp的全長(zhǎng)cdna序列(圖1,c1),包含1 422 bp的完整orf,編碼473個(gè)氨基酸,理論等電點(diǎn)為7.19,推測(cè)分子量為52.3 kd。經(jīng)blastp比對(duì)結(jié)果顯示,所得基因編碼的氨基酸與其他植物-oat的氨基酸序列具有很高的同源性,與獼猴桃ac-oat(actinidia chinensis,abr45720.1)同源性為89%,與可可tc-oat(theobroma cacao,xp_007025036.1)為85%,與
21、湖北海棠mh-oat(malus hupehensis,aeo51063.1)為82%,與煙草nt-oat(nicotiana tabacum,adm47437.1)為82%,與菊芋ht-oat(heliacshus tuberosus,ahj08571.1)為75%。表明新克隆的cdna序列為茶樹鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因,將該基因命名為cs-oat(camellia sinensis ornithine -aminotransferase),并將其登錄到genbank,登錄號(hào)為kj641844。 圖1 cs-oat的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果 m:2 000 bp dna marker;a1:中間片段擴(kuò)
22、增結(jié)果;b1、b2:3-race擴(kuò)增結(jié)果;b3、b4:5-race擴(kuò)增結(jié)果;c1:全長(zhǎng)擴(kuò)增結(jié)果。 fig. 1 electrophoresis results of pcr amplification of cs-oat m:2 000 bp dna marker;a1:product of segment;b1,b2:product of 3-race; b3,b4:product of 5-race;c1:product of full cdna. 2.2 cs-oat編碼蛋白的生物信息學(xué)分析 2.2.1 cs-oat的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 利用ncbi對(duì)cs-oat的結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點(diǎn)分析(圖2)表
23、明,cs-oat屬于乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族,該家族是依賴磷酸吡哆醛(plp)的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶超家族。催化轉(zhuǎn)氨作用的關(guān)鍵部位plp結(jié)合位點(diǎn)由8個(gè)氨基酸殘基(g138a139f173h174e228d261q264k290)構(gòu)成,其中290位的賴氨酸(k)是催化中心,plp的結(jié)合引起蛋白構(gòu)象變化而激活轉(zhuǎn)氨酶活性。抑制因子結(jié)合位點(diǎn)由11個(gè)氨基酸殘基(t137g138a139f173h174r176e228d261i263q264k290)構(gòu)成。 圖2 cs-oat編碼氨基酸的保守區(qū)域分析結(jié)構(gòu)圖 fig. 2 conserved domains analysis of cs-oat deduce
24、d amino acid 2.2.2 cs-oat的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 通過(guò)tmpred對(duì)cs-oat編碼的氨基酸序列進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)顯示,在164 185和285 305形成兩個(gè)可能的跨膜螺旋,加權(quán)總分達(dá)1 119分,遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于500(模型認(rèn)為大于500分即存在有意義的跨膜螺旋),表明跨膜預(yù)測(cè)真實(shí)有效,因此推測(cè)該基因編碼的酶為跨膜蛋白。 12期 王偉東等:茶樹鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因cs-oat的克隆與表達(dá)分析 2469 2.2.3 cs-oat的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) 用netphos 2.0 serve預(yù)測(cè)cs-oat蛋白的磷酸化位點(diǎn)(圖3),結(jié)果表明含有絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸共21個(gè)磷酸化位點(diǎn),其中以絲氨酸位點(diǎn)
25、最多,有11個(gè),蘇氨酸和酪氨酸位點(diǎn)分別有4個(gè)和6個(gè)。由此推測(cè)cs-oat蛋白的活性可能受到磷酸化作用的調(diào)控。 圖3 cs-oat蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè) fig. 3 phosphorylation site prediction of cs-oat protein 2.2.4 cs-oat的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用swiss-model對(duì)cs-oat蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),得到cs-oat蛋白的三維結(jié)構(gòu)。結(jié)果與strnsk等(2008)獲得的豌豆-oat蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)模型圖相似,均含有-oat典型的plp輔助因子結(jié)構(gòu),進(jìn)一步證實(shí)獲得的cs-oat基因編碼蛋白屬于依賴plp的鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶。 2.3 系統(tǒng)進(jìn)
26、化樹分析 選擇17個(gè)與茶樹cs-oat編碼蛋白同源性較高的-oat蛋白序列,利用mega 6.0軟件構(gòu)建nj系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖4所示,以0.02為結(jié)點(diǎn)可以將植物-oat分為兩個(gè)類群:第類為雙子葉植 圖4 cs-oat與其他植物-oat蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系 fig. 4 phylogenetic relatedness among cs-oat and other plants -oat proteins 2470 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 物的-oat進(jìn)化關(guān)系,其中茶樹cs-oat與獼猴桃ac-oat親緣關(guān)系最近,可能為直系同源蛋白,其次為湖北海棠和葡萄,而與煙草和菊芋親緣關(guān)系較遠(yuǎn),表明茶樹cs-o
27、at與雙子葉植物中的木本植物親緣關(guān)系較近,而與草本植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);第類主要為單子葉植物和裸子植物的-oat進(jìn)化關(guān)系,其中單子葉植物聚為一簇,表明其由同一祖先進(jìn)化而來(lái)??傊?,由系統(tǒng)進(jìn)化樹分析可以看出-oat的進(jìn)化關(guān)系與植物形態(tài)學(xué)上分類的進(jìn)化關(guān)系較一致,反映了cs-oat蛋白的進(jìn)化規(guī)律和物種的親緣關(guān)系規(guī)律。 2.4 cs-oat的熒光定量表達(dá)分析 2.4.1 cs-oat的脅迫處理表達(dá)分析 在nacl脅迫處理期間,茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)量從1 h開始逐漸增加,在12 h時(shí)達(dá)到最高,為對(duì)照的2.64倍,之后開始降低,呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢(shì)(圖5),表明高鹽脅迫可以顯著誘導(dǎo)茶樹葉片
28、中cs-oat基因的表達(dá)。 在aba誘導(dǎo)處理期間,茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)量在1 8 h表現(xiàn)出緩慢地增加,在12 h時(shí)迅速增加至對(duì)照的3.1倍,之后迅速降低到1.5倍水平(圖5),表明aba可以顯著誘導(dǎo)茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá),并表現(xiàn)出爆發(fā)性增加的特點(diǎn)。 圖5 cs-oat基因在不同脅迫處理下的表達(dá)量 fig. 5 relative expression of cs-oat under different stress treatments 12期 王偉東等:茶樹鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因cs-oat的克隆與表達(dá)分析 2471 在4 低溫脅迫處理期間,茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)量出
29、現(xiàn)兩次高峰,其中2 h的表達(dá)量為對(duì)照的2.2倍,12 h的表達(dá)量為對(duì)照的1.9倍,呈現(xiàn)出先上升后降低再上升再降低的變化趨勢(shì)(圖5)。 在干旱脅迫處理期間,茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)量從1 h開始迅速增加,并在2 12 h維持在較高水平,其表達(dá)量約為對(duì)照的2.2倍左右,之后其表達(dá)量開始降低,總體呈現(xiàn)出先上升后降低的變化趨勢(shì)(圖5)。 在h2o2脅迫處理期間,茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)量出現(xiàn)兩次高峰,分別為4 h和24 h,其表達(dá)量分別為對(duì)照的2.3倍和2.0倍,整體呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的變化趨勢(shì)(圖5),表明h2o2可以顯著誘導(dǎo)茶樹葉片中cs-oat基因的表達(dá)。 總之,熒光定量p
30、cr的分析結(jié)果表明茶樹cs-oat基因是一個(gè)受高鹽、aba、低溫、干旱和氧化脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的基因,該基因可能參與了多種逆境脅迫下茶樹葉片的滲透調(diào)節(jié)過(guò)程。 2.4.2 cs-oat的組織特異性表達(dá)分析 以茶樹根、莖、葉、芽、花和果實(shí)的cdna為模板進(jìn)行熒光定量pcr分析,結(jié)果表明cs-oat在花中的表達(dá)量最高,其次為葉片,而在其它組織中的表達(dá)量相當(dāng),且相對(duì)較低(圖6)。 圖6 cs-oat基因在茶樹不同組織中的表達(dá)量 fig. 6 relative expression of cs-oat in different tissues of tea plant 3 討論 植物為應(yīng)對(duì)逆境脅迫而積累可溶性
31、滲透物質(zhì),如脯氨酸、甜菜堿和糖醇等,作為小分子的滲透保護(hù)物質(zhì),其中脯氨酸是分布最為廣泛的滲透調(diào)節(jié)劑(mccue & hanson,1990)。-oat作為脯氨酸鳥氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶,與植物逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)(slama et al.,2006),但在茶樹上還沒(méi)有關(guān)于-oat的研究報(bào)道。本研究中通過(guò)race技術(shù)克隆獲得了茶樹的-oat基因,與其它植物的-oat具有較高的同源性,其編碼的氨基酸序列含有-oat典型的plp結(jié)合位點(diǎn)和抑制因子結(jié)合位點(diǎn),屬于乙酰鳥氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶家族,命名為cs-oat。對(duì)cs-oat蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)顯示該蛋白可能為跨膜蛋白,磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示cs-oat蛋白含有
32、多個(gè)磷酸化位點(diǎn),可能與cs-oat蛋白的活性調(diào)控有關(guān)。相關(guān)研究表明,磷酸化和去磷酸化是aba信號(hào)通路中關(guān)鍵性的過(guò)程,低溫、干旱和高鹽等逆境脅迫能夠促進(jìn)植物體內(nèi)aba含量的增加,進(jìn)而促進(jìn)下游功能蛋白的磷酸化,從而使蛋白活化并參與植物逆境脅迫的響應(yīng)(yamaguchi-shinozaki & shinozaki,2006),因此推測(cè)cs-oat蛋白的磷酸化位點(diǎn)可能與其逆境脅迫下蛋白活性有關(guān)。 已有的研究表明,-oat基因參與了植物對(duì)干旱、高鹽和低溫等非生物脅迫的響應(yīng)(armengaud et al.,2004)。焦蓉等(2011b)的研究表明煙草-oat基因受干旱、高鹽、低溫和aba脅迫誘導(dǎo) 24
33、72 園 藝 學(xué) 報(bào) 41卷 表達(dá);吳楊等(2009)的研究表明斑茅-oat基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。本研究的qrt-pcr結(jié)果亦表明茶樹-oat基因參與了茶樹葉片對(duì)各種非生物脅迫(如高鹽、干旱、低溫、aba和氧化脅迫)的響應(yīng)。其中,低溫和氧化脅迫均出現(xiàn)了兩次高峰,中間有略微降低,這可能與脅迫下脯氨酸積累的途徑有關(guān)。目前關(guān)于植物響應(yīng)脅迫時(shí)脯氨酸積累過(guò)程中兩條合成途徑誰(shuí)占主導(dǎo)地位的爭(zhēng)議還比較大。delauney等(1993)和sanchez等(2001)的研究表明,脅迫下脯氨酸的合成途徑與植物體內(nèi)的氮素水平密切相關(guān)。此外,趙福庚和劉友良(1999)的研究發(fā)現(xiàn),鹽脅迫前8 h脯氨酸的積累主要受谷氨酸
34、途徑的調(diào)控,隨后鳥氨酸途徑占主導(dǎo)地位。因此,對(duì)于低溫脅迫下cs-oat在茶樹葉片脯氨酸積累過(guò)程中的地位尚需做進(jìn)一步的研究。 本研究中,通過(guò)qrt-pcr對(duì)cs-oat基因在茶樹不同組織中表達(dá)差異分析表明,茶樹cs-oat基因在不同組織中的表達(dá)量存在明顯差異,在花中表達(dá)量最高,其次是葉片,而在其他組織中的表達(dá)量較低,這與張積森等(2009)報(bào)道的甘蔗-oat基因在幼苗各組織中表達(dá)量相似,以及armengaud等(2004)報(bào)道的苜蓿-oat基因在根和頂芽中表達(dá)量最大,而在葉片和生殖器官中表達(dá)量較低的結(jié)果有所不同,表明不同植物相同組織中-oat基因的表達(dá)存在差異。此外,鑒于茶樹cs-oat基因在花
35、器官中相對(duì)較高的表達(dá),以及前期研究所表明的脯氨酸參與了低溫抑制茶樹花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的生理過(guò)程(wang et al.,2012),推測(cè)cs-oat基因在茶樹花粉管低溫脅迫響應(yīng)中扮演重要角色,這有待進(jìn)一步研究。 references armengaud p,thiery l,buhot n,grenier-de m g,savour a. 2004. transcriptional regulation of proline biosynthesis in medicago truncatula reveals developmental and environmental specific
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