胃幽門螺桿菌染色質(zhì)量控制研究

1、胃幽門螺桿菌染色質(zhì)量控制研究 經(jīng)大量臨床病例證實，消化系統(tǒng)的胃黏膜病變、潰瘍、胃淋巴增生性病變、慢性胃炎甚至胃癌均與幽門螺桿菌(HP)感染有一定的關(guān)系。我國目前處于HP感染高發(fā)區(qū)，通常HP感染缺乏典型的臨床特征，故早期的臨床診斷及治療顯得尤為重要。病理診斷HP感染是臨床診斷的重要依據(jù)，但在常規(guī)病理HE切片中不易觀察到HP，難以明確病理診斷，因此只能用特殊染色法才能使HP更清晰的顯示出來。目前檢測HP的方法有10余種，哪些方法最好、如何進行HP染色的質(zhì)量控制、使染色結(jié)果穩(wěn)定可靠且準(zhǔn)確是目前工作中的關(guān)鍵。本文就這些染色法中的關(guān)鍵問題、注意事項以及HP實驗操作問題、染色液配制及染色結(jié)果觀察判斷等問題

2、進行探討。 1材料與方法 1.1材料。選取本院2018-0508間臨床診斷的活動性胃炎胃黏膜活檢標(biāo)本65例。1.2方法。將65例石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，制成4m厚的切片，每例取3張，分別進行硼酸亞甲藍染色、改良Giemsa染色和硝酸銀染色。1.2.1試劑配制硼酸亞甲藍染液配制:把1g亞甲藍和1g硼酸加入100ml蒸餾水中充分混合溶解。改良Giemsa染液配制:Giemsa染液:Giemsa染液0.75g加甲醇50ml于50度水浴箱中使其充分溶解，其間不斷攪拌，冷卻后加入50ml甘油;石炭酸復(fù)紅液:堿性品紅50mg溶于95%乙醇100ml，再加入4%苯酚250ml及蒸餾水650m，充分混合即可。硝酸銀

3、液配制:醋酸貯備液:雙蒸餾水加1%檸檬酸液，調(diào)節(jié)PH值為3.64.0之間;5%明膠液:明膠5g加醋酸貯備液100ml溶解;顯影液:3%對苯二酚1ml與5%明膠15ml充分混合，顯影前5min加入2%硝酸銀3ml混合。1.2.2染色步驟硼酸亞甲藍染色:切片脫蠟至水，硼酸亞甲藍染液染色5min，水洗，烘干切片，中性樹膠封固。改良Giemsa染色:組織切片脫臘至水，改良Giemsa染液染色20min后水洗，石炭酸復(fù)紅液染1min，不洗直接用無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。硝酸銀染色:切片脫蠟至水，醋酸貯備液洗切片，把切片置入1%硝酸銀于56水浴箱45min，切片取出不經(jīng)水洗，滴入顯影液56水

4、浴反應(yīng)2min，切片立即取出，自來水稍洗，無水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。1.3結(jié)果判定。切片高倍鏡下，陽性的幽門螺桿菌形態(tài)彎曲，短桿狀，分布在胃黏膜凹陷內(nèi)。硼酸亞甲藍染色法幽螺桿菌呈藍色;改良Giemsa染色法幽門螺桿菌呈紅色;硝酸銀染色法幽門螺桿菌呈棕黑色。 2結(jié)果 65例胃黏膜標(biāo)本中，經(jīng)硼酸亞甲藍檢出55例HP陽性，陽性率85%(圖1);經(jīng)Giemsa染色49例陽性，陽性率75%(圖2);經(jīng)硝酸銀染色檢出52例陽性，陽性率80%(圖3)。三項染色陽性的數(shù)據(jù)比較差別顯著(P0.05)。 3討論 本實驗顯示，3種染色方法胃幽門螺桿菌均有較高的陽性檢出率，三者陽性率相差不明顯。胃幽門螺

5、桿菌中含有蛋白和多糖物質(zhì)，在一定溫度的硝酸銀溶液作用下能夠吸附銀離子，再經(jīng)過還原的顯色劑使幽門螺桿菌顯示金屬銀，銀顆粒沉淀于細(xì)菌上，結(jié)果顯示幽門螺桿菌著棕黑色，胞質(zhì)與黏液著淺黃色，此法著色細(xì)菌與組織對比明顯，易鏡下觀察，但染色時間長、試劑價格昂貴、配制復(fù)雜、操作繁瑣。改良Giemsa染色法胃黏膜細(xì)胞核呈藍紫色，胞質(zhì)和黏液呈紅色，幽門螺桿菌呈紅色，此法操作簡單、價格低、耗時短，但組織易被染成紅色，較難區(qū)分組織內(nèi)的幽門螺桿菌。硼酸亞甲藍染色胃黏膜細(xì)胞核呈藍紫色，形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，亞甲藍為堿性染料，溶于水中電離成有色的陽離子，與帶陰離子的幽門螺桿菌相結(jié)合而著藍色，此液耗時短、操作簡單、價格低廉、試劑來源

6、方便、染液使用壽命長，可常溫保存23年。染色的操作質(zhì)量是保障切片染色對比清晰的關(guān)鍵，如何提高胃幽門螺桿菌染色的質(zhì)量，筆者在日常工作中總結(jié)出以下幾個要點:硝酸銀染色:A醋酸儲備液的配制最為關(guān)鍵，必須采用雙蒸餾水，因為自來水中含氯離子，氯離子與硝酸銀起反應(yīng)產(chǎn)生白色的沉淀;B酸化水的PH值調(diào)整到3.64.0之間，高于或低于3.64.0時配制出的染液無法使幽門螺桿菌著色;C除了醋酸儲備液及5%明膠可保存較長時間，顯影液必須現(xiàn)配現(xiàn)用，5%明膠可4保存于冰箱，臨用前取出水浴融化即可;D染色過程中的顯影液應(yīng)嚴(yán)格把握水浴溫度，最好控制在5658之間。顯影2min立即取出切片鏡下觀察，如顯影不足，幽門螺桿菌淺淡

7、;顯影過度，切片背景深黑，且易出現(xiàn)銀粒沉淀污染切片，不利于鏡下觀察;E顯影液必須染片前5min配制好再放入水浴，顯影液一旦配制好就會產(chǎn)生反應(yīng)，根據(jù)筆者經(jīng)驗，即使采用立式染色缸顯影1次后就應(yīng)該廢棄，如果繼續(xù)染片，切片背景不清晰、銀顆粒沉淀后污染嚴(yán)重，螺桿菌與污染的切片難以分辨;F終止顯色時最好用55左右的熱水將顯影液沖洗干凈，因為顯影液中含的明膠遇冷水后迅速凝結(jié)，導(dǎo)致未結(jié)合的顯色劑殘留在切片;G因日光會破壞分解硝酸銀液，因此配好的染液用棕色玻璃瓶保存，染液可保存半年;H染片可長期保存不易褪色。Giemsa染色:Giemsa在常溫下難于溶解，因此在55左右與甲醇液能達到完全溶解。改良后Giemsa省去很多復(fù)雜步驟，改良添加了堿性品紅，因Giemsa染液可使細(xì)菌初染呈紫色，堿性品紅不僅作為復(fù)染的襯托，且不易被乙醇脫色，使切片對比清晰。堿性品紅對革蘭陰性菌的菌壁有親和力，加強幽門螺桿菌著染，此類染色切片長期保存不易，易褪色。硼酸亞甲藍染色:硼酸亞甲藍染后不經(jīng)乙醇脫水，而直接烤干封固，是因為乙醇會褪去亞甲藍的染色，造成切片顏色不清晰。硼酸亞甲藍染液應(yīng)密閉、室溫、暗處保存，防止霉菌污染，定期過濾。染液能保存23年。此染色隨保存時間延長，切片易逐漸褪色。綜上所述，只要在以上操作流程中嚴(yán)格掌握和控制染色過程中的染色溫度、染色時間、PH值、試劑配制及保存等有關(guān)細(xì)節(jié)，就能保證幽