基因克隆的幾種常見方法

1、基因克隆的幾種常見方法基因(呼皿)是遺傳物質(zhì)的最基本單位,也是所有生命活動的基礎(chǔ)。不論要揭示 某個基因的功能，還是要改變某個基因的功能,都必須首先將所要研究的基因克隆 出來。特定基因的克隆是整個基因工程或分于生物學(xué)的起點(diǎn)。本文就基因克隆的 幾種常用方法介紹如下。1根據(jù)巳知序列克隆基因?qū)σ阎蛄械幕蚩寺∈腔蚩寺》椒ㄖ凶顬楹啽愕囊环N。獲取基因序列多 從文獻(xiàn)中査取，即將別人報(bào)道的基因序列直接作為自己克隆的依據(jù)?，F(xiàn)在國際上 公開發(fā)行的雜志一般都不登載整個基因序列,而要求作者在投稿之前將文章中所 涉及的基因序列在基因庫中注冊，擬發(fā)表的文章中僅提供該基因在基因庫中的注 冊號(accession num

2、ber),以便別人參誇和査詢。目前，世界上主要的基因庫有 1)EMBL,為設(shè)在歐洲分于生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的基因庫,其網(wǎng)上地址為 http:/www.cbi.ac.uk/cbi-homc.html; Gunbank,為設(shè)在美國國家衛(wèi)生研究院(NIH) 的基因庫,其網(wǎng)上地址為 http:/-.ncbi.nlm.nih.g()v/wcb/scarch/indcx.html;(3)Swisspc)rt 和 TREMBL,Swisspori是一蛋白質(zhì)序列庫淇所含序列的準(zhǔn)確度比較高，而TREMBL 只含有從EMBL庫中翻譯過來的序列。目前，以Gmbank的應(yīng)用最頻繁。這些基 因庫是相互聯(lián)系的，在Gcnbaiik

3、注冊的基因序列，也可能在Sssport注冊。要克隆 某個基因可首先通過Inicrnet査詢一下該基因或相關(guān)基因是否已經(jīng)在基因庫中注 存。査詢所有基因文庫都是免費(fèi)的,因而極易將所感興趣的基因從庫中拿岀來，根 據(jù)整個基因序列設(shè)計(jì)特異的引物，通過PCR從基因組中克隆該基因，也可以通過RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是，由于物種和分離株之間的差異，為了保證PCR 擴(kuò)增的準(zhǔn)確性，有必要釆用兩步擴(kuò)增法，即nested PCRo根據(jù)蛋白質(zhì)序列也可以將編碼該蛋白質(zhì)的基因擴(kuò)增出來。在基因文庫中注冊 的蛋白質(zhì)序列都可以找到相應(yīng)的PNA或ePNA序列。如蛋白質(zhì)序列是自己測定 的，那么需要設(shè)計(jì)至少1對簡并引物(d

4、egenerated primer),從eDNA文庫中克隆該基 因。以這種方法克隆的基因必須做序列測定才能鑒別所擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。另外，在基因克隆之后，如還要進(jìn)一步做表達(dá)研究，所使用的PCR酶最好不用 T叫DNA聚合酶，而采用其他有自我檢測(readingproof)功能的酶，如pFu。這樣可以 避免由于擴(kuò)增過程中出現(xiàn)的點(diǎn)突變或終止密碼于而導(dǎo)致整個研究結(jié)論的錯誤。2根據(jù)巳知探針克隆基因這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標(biāo)記, 再將其與用不同內(nèi)切酶處理的基因組DNA雜交，最后將所識別的片段從膠中切 下來，克隆到特定的載體(質(zhì)粒、噬菌體或病毒)中作序列測定或功能分析。這

5、種 方法不但可以將基因克隆出來，還能同時觀察該基因在基因組中的拷貝數(shù)。但在 探針雜交后,要注意高強(qiáng)度(high stringent)漂洗，以避免干擾信號，即保證克隆的特 異性，同時節(jié)省時間。3未知序列的基因打靶根據(jù)已知序列進(jìn)行基因克隆，多數(shù)是重復(fù)別人的工作，或者是在別人工作的基 礎(chǔ)上繼續(xù)自己的工作，因而不存在新基因的克隆過程。對未知序列的基因克隆才 是真正的創(chuàng)造性研究。3. 1隨機(jī)引物法克隆耒知序列基因1隨機(jī)引物PCRfarbitrarily primedPCR,AP-PCR)首先被用于基因組PNA或RNA的指紋圖譜(finger print)分析，后來 也有人將這種方法用于克隆與表型相關(guān)的基

6、因或mRNAo該方法的理論依據(jù)是: 表型受基因支配，在一個生物體發(fā)生了表型變化后，其基因組DNA很可能發(fā)生變 化或出現(xiàn)不同基因的激活或關(guān)閉等;另一方面，如在寄生蟲的發(fā)育過程中，不同發(fā) 育階段的蟲體所表達(dá)的基因很可能不同，如將不同發(fā)育階段的蟲體mRNA提取岀 來，用單一引物(隨機(jī)引物,其長度不超過16皿)對不同時期的蟲體mRNA進(jìn)行擴(kuò)增 比較，即可找出導(dǎo)致表型變異的遺傳學(xué)依據(jù)。這種方法是一種比較PC&它要求至 少有2種來自不同表型但又很類似的基因組DNA或mRNAo AP-PCR擴(kuò)増后的 產(chǎn)物必須99%是一致的，只有個別特異的產(chǎn)物出現(xiàn)在特異的表型個體中。該方法 對表型或種源關(guān)系相差甚遠(yuǎn)的生物個體

7、之間沒有比較意義.應(yīng)用AP-PCR法進(jìn)行2種或多種表型特征類似的個體間指紋圖譜分析或表型相 關(guān)基因克隆箭頭所指擴(kuò)增帶為特異于個體(II)的擴(kuò)增產(chǎn)物AP-PCR的操作一般采 用兩步法，即前10個循環(huán)多以較低的退火溫度(annealing tcmpcralurc)迸行擴(kuò)增， 后20個循環(huán)則采用較高的退火溫度擴(kuò)增。AP-PCR產(chǎn)物多較短，一般需高濃度的 瓊脂糖凝膠檢測，也可用聚丙烯酰胺凝膠檢測。如擴(kuò)增的模板為mRNA,通過比較 擴(kuò)增產(chǎn)物的強(qiáng)度，可以得知該基因在2種生物或同一生物不同發(fā)育階段的表達(dá)強(qiáng) 度。另外，在AP-PCR檢測到與某一表型相關(guān)的基因或基因產(chǎn)物(mRNA)以后，下一 步工作就是克隆出整

8、個基因或mRNAo主要操作程序?yàn)?）AP-PCR產(chǎn)物的提取、 克隆尺序列測定。首先將AP-PCR檢測到的特定片段從凝膠中切下，提取PNA克 隆到適宜的載體內(nèi)（如TA載體），再測定其核昔酸組成。根據(jù)其核昔酸組成設(shè)計(jì)2 個方向相反的引物（P-l,P-2,見圖2）。弓|物長度多在20m以上；退火溫度在60C 以上；將基因組ONA做適當(dāng)酶切，然后在其兩端連接上相同的接頭（這種接頭 可從生物制品公司購買）。根據(jù)接頭的序列擴(kuò)增。3.2 Differential display PCRQD-PCR） DP-PCR 是在 AP-PCR 基礎(chǔ)上發(fā)明的 一種RT- PCR方法，主要用于2種或多種類似生物個體在基因

9、表達(dá)上的差異分析。 其基本原理是:所有真核生物的成熟mRNA都含有不同長度的poly （A）尾部序列， 根據(jù)poly （A）內(nèi)部的2個核昔酸排列的不同，可以將所有的mRNA分于分為12類 （見圖3）。根據(jù)這12種mRNA序列可合成12種相應(yīng)的反轉(zhuǎn)錄引物，即M N TTTTTTTT，用其分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，即可將所有mRNA分類合成12種 eDNA（于12個試管內(nèi)），然后再用隨機(jī)引物，以這12種eDNA分別做模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（見圖1和圖4）,那么與表型相關(guān)的mRNA就很容易被發(fā)現(xiàn)并克隆岀來。但 不論AP-PCR還是DD-PQ&都適用于2種種源近似生物或不同發(fā)育階段的同一 個體之間的比較。因而，其

10、PCR的模板必須是來自2個生物或同一生物的不同發(fā) 育階段的mRNAo PD-PCR的優(yōu)點(diǎn) 是快速、方便，可以檢測表達(dá)量極低的mRNA, 但其技術(shù)條件要求較高，所擴(kuò)增的mRNA的質(zhì)量不能有差異，即mRNA不應(yīng)降解。 目前這一方法已廣泛應(yīng)用于生物表型相關(guān)基因的克隆及比較研究。3.3 Representative difference analysis PCR (RDA-PCR)” 這是一種差減雜交(subtractive hybridizario-n)與PCR相結(jié)合的技術(shù),其整個操作程序完全不同于 AP-PCR和DD-PCRo前2種方法是將 兩模板DNA或cDNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，最后通過擴(kuò)增

11、產(chǎn)物的差異，分離和克隆特異擴(kuò)增帶，其缺點(diǎn)是需要將特異擴(kuò)增 產(chǎn)物從膠中切下來，提取DNA,再擴(kuò)增后才能克隆。RDA-PCR只擴(kuò)增區(qū)別于某一 表型的特異基因，因而更便于擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與分析（見圖5）。其基本原理是： 用一個在種源上相近的基因組將靶基因組中所有共同的基因掩蓋起來，而只暴 露出特異的基因，在整個反應(yīng)中只有特異基因能被擴(kuò)增。其操作程序?yàn)?用同一 限制性內(nèi)切酶（一般用Bam HI,Bgl II或Hind 111）同時處理靶基因組和掩蓋基因組 PNA,其中掩蓋基因組DNA的量至少要2倍于靶基因組DNA的量；在經(jīng)酶 切的靶基因組片段的兩端加上連接頭，其序列與酶切產(chǎn)生的粘性末端的序列相 對應(yīng);將

12、2個基因組的DNA混合后，高溫變性，低溫退火。由于掩蓋基因組DNA 的量遠(yuǎn)大于靶基因組DNA量，那么與掩蓋基因組DNA相同的靶基因就會與掩蓋 基因形成雜合體，而只有特異的靶基因才能重新組合，不會受掩蓋基因的影響； 用T叫PNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)齊后,加入與連接于相對應(yīng)的引物，經(jīng)過30個左 右的PCR擴(kuò)增，就可以將靶基因組中與掩蓋基因不同的特異基因擴(kuò)增出來。這種 方法的起始操作程序較復(fù)雜，各反應(yīng)步驟要求準(zhǔn)確無誤，但其檢測的準(zhǔn)確度較高。 對于基因組內(nèi)的點(diǎn)突變、重排、插入序列等變化均可檢測出來。4用特異抗體克隆基因用抗體克隆基因的關(guān)鍵是抗體的特異性。一般以單克隆抗體最為理想。獲取特 異抗體的方法主要

13、有:制備識別功能抗原的單克隆抗體;（2）將SDS-PAGE分離的 蛋白質(zhì)特異帶切下免疫動物，其抗體只識別該特異蛋白質(zhì);用Wcstcrn-bloi法將 識別某一蛋白質(zhì)帶的抗體從膜上洗脫下來。在獲取理想的抗體后，便可以用這些 抗體篩選表達(dá)型基因組文庫或cDNA文庫，從文庫中將編碼某一特異蛋白質(zhì)的基 因克隆出來。5特異基因的功能克隆它是借助于基因產(chǎn)物即基因所編碼的蛋白質(zhì)的功能將該基因克隆出來的一種方 法。基因的功能克隆主要有2種:一是ph age display Z 6,7J,另一是peptide display o 后者的原理與前者基本相同。目前以phage display的應(yīng)用最為廣泛,本文只對

14、這一 方法加以介紹。任何一種病原體，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲，在其對宿主侵入或致病過程中，病原 體本身的蛋白質(zhì)成分(ligand)需要首先與宿主細(xì)胞上的受體(receptor)相互識別連 接。如口蹄疫病毒需要借助于受體細(xì)胞上的Heparan sulfate受體，并與其相互 作用后才能侵入細(xì)胞內(nèi)；巴貝斯蟲裂殖于需借助于宿主的補(bǔ)體作為橋梁，才能 與紅細(xì)胞結(jié)合并最后侵入紅細(xì)胞內(nèi)。對病原體與宿主受體相互作用成分的特性與 功能分析，是制訂免疫預(yù)防措施尺制備阻 斷藥物的前提。phagt display法是克隆 病原體ligand的一種最為理想的手段。Phagt display的基本操作過程為:提取某一病原體

15、基因組DNA,用超聲波將 ONA切割成5001 500的片段;將片段末端用T4PNA聚合酶處理后，與載體 DNA(phagcmid)連接形成噬菌體質(zhì)粒。用這些質(zhì)粒與輔助噬菌體(helperphage)同時轉(zhuǎn)染大腸桿菌。phagemid在大腸桿菌內(nèi)包裝成噬菌體，大量繁殖，同時將插入 的外源基因片段表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物主要集中在噬菌體顆粒的 表面；將特定的受體 固定于載體上(多為EL1SA板),方法同一般的ELISA包被。將噬菌體懸液作適當(dāng) 稀釋后，加入平板孔內(nèi),感作一段時間，用PES等緩沖液漂洗。最后,只有表達(dá)特異 功能蛋白的噬菌體才能與包被在平板上的受體相互結(jié)合，那些表達(dá)非相關(guān)蛋白的 噬菌體由于不能與受體連接而被洗脫;（4）用髙強(qiáng)度NaCl液將結(jié)合在受體上的噬 菌體分離下來，再感染大腸桿菌，便可將編碼特異功能蛋白質(zhì)的基因克隆。一個真核生物