溴麝香草酚藍(lán)比色法測(cè)定葉下珠生物堿的含量

1、溴麝香草酚藍(lán)比色法測(cè)定葉下珠生物堿的含量作者：鄧光輝 胡煒 劉榕城 張桂華 農(nóng)林【摘要】目的測(cè)定葉下珠中總生物堿的含量。方法以溴麝香草酚藍(lán)為顯色劑于415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。結(jié)果苦參堿在0.0040.02 mgml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.997 54）；其與溴麝香草酚藍(lán)所形成的離子對(duì)產(chǎn)物在6 h內(nèi)穩(wěn)定；平均加樣回收率為98.65(RSD=1.98)。結(jié)論該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于生藥及產(chǎn)品的生物堿質(zhì)量控制。 【關(guān)鍵詞】溴麝香草酚藍(lán) 比色法 葉下珠 生物堿葉下珠(別名珍珠草)為大戟科葉下珠屬中的一種草本植物，具有清肝明目、解毒消腫的功效，常用于 治療 腹瀉下痢、尿路感染、小兒疳積、肝

2、炎、腎炎等疾病，其化學(xué)成分主要有生物堿和黃酮兩大類(lèi)。生物堿是存在于生物體內(nèi)的含氮有機(jī)化合物，大多數(shù)存在于植物中，目前已分離到三千余種，其中近百種具有很強(qiáng)的生理活性1。 現(xiàn)代 藥理研究表明，生物堿具有抗腫瘤、抗炎、抗心律失常等方面的作用2,3 ,其在醫(yī)藥和農(nóng)藥方面的應(yīng)用已引起人們的廣泛關(guān)注。對(duì)天然生物堿的生物活性、提取、精制、鑒定方法等方面的研究多見(jiàn)報(bào)道4。目前總生物堿的含量測(cè)定有重量法、酸堿滴定法、分光光度法?？紤]到生物堿的結(jié)構(gòu)，本文采用酸性染料比色法，以苦參堿為對(duì)照品，對(duì)不同產(chǎn)地來(lái)源的葉下珠中的總生物堿進(jìn)行了含量測(cè)定，建立了葉下珠中總生物堿含量的測(cè)定方法。 1 材料與儀器JP600型變輻桿式

3、超聲波萃取器（武漢嘉鵬 電子 有限公司）；916型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（澳大利亞GBC公司），分析天平（上海第三分析儀器廠），酸度計(jì)，苦參堿 ( 中國(guó) 藥品生物制品檢定所)，溴麝香草酚藍(lán)和其余試劑均為分析純。葉下珠，購(gòu)自廣西、云南、廣東。 2 方法 2.1 儲(chǔ)備溶液的配置精確稱取苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用95乙醇溶解后定容于50 ml的容量瓶，搖勻，備用。2.2 對(duì)照品溶液的配置移取“2.1”項(xiàng)下儲(chǔ)備溶液5.00 ml于50 ml容量瓶，定容，搖勻，備用。2.3 樣品溶液的制備取葉下珠粉碎成粗粉，精確稱取5 g，加入0.5%的乙酸溶液200 ml，浸泡24 h，超聲波提取30 min過(guò)濾，往濾

4、液中加入氫氧化鈉溶液至中性，過(guò)濾。沉淀用95乙醇溶解后定容于50 ml容量瓶中，備用。 3 結(jié)果 3.1 條件的優(yōu)選3.1.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定移取對(duì)照品溶液2.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入pH=7.5的磷酸鹽緩沖液5.00 ml，加入0.025%的溴麝香草酚藍(lán)1.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振搖1 min，靜置30 min，分取氯仿層于具塞錐形瓶中，用無(wú)水氯化鈣干燥5 min，以5.00 ml蒸餾水加pH=7.5的磷酸鹽緩沖，加0.025%的麝香草酚藍(lán)，加氯仿的萃取溶液作為參比，在360550 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示溶液在415 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。

5、3.1.2 pH值的確定移取對(duì)照品溶液2.00 ml，按照“3.1.1”項(xiàng)下方法分別加入pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸鹽緩沖液，結(jié)果顯示：當(dāng)加入的磷酸氫二鈉與磷酸二氫鉀的濃度分別為0.008 mol/L和0.030 mol/L（pH=7.5）時(shí)，溶液的吸光度最大，所以實(shí)驗(yàn)選擇pH為7.5的磷酸鹽緩沖溶液。3.1.3 溴麝香草酚藍(lán)用量的確定移取對(duì)照品溶液5.00 ml，按照“3.1.1”項(xiàng)下方法分別加入0.025%的麝香草酚藍(lán)1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，結(jié)果顯示，當(dāng)加入的麝香草酚藍(lán)體積為4.00 ml時(shí)，溶液吸光度最大，所以實(shí)驗(yàn)選擇溴麝香草酚藍(lán)的用

6、量為4. 00 ml。3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制移取苦生堿對(duì)照品溶液1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ml，置于125 ml的分液漏斗中，加入二次蒸餾水至5.00 ml，加入pH=7.5的磷酸鹽緩沖液5.00 ml，加入0.05%的溴麝香草酚藍(lán)4.00 ml，加入氯仿10.00 ml，振搖1 min， 靜置30 min，分取氯仿層于具塞錐形瓶中，用無(wú)水氯化鈣干燥5 min，分別在415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程A=-0.026 3+25.675C（r=0.997 54），苦參堿檢測(cè)濃度在0.0040.02 mg/ml

7、范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系。3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)移取對(duì)照品溶液2.00 ml，按“3.1.1”項(xiàng)下方法在415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。并在室溫下每隔1 h測(cè)定1次吸光度，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果表明，苦生堿與溴麝香草酚藍(lán)的顯色產(chǎn)物在6 h內(nèi)穩(wěn)定，其RSD=1.65。3.4 精密度實(shí)驗(yàn)分別移取2.00 ml對(duì)照品溶液3份，按“3.1.1”方法在415 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，RSD=1.2。3.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)移取樣品溶液(廣西武鳴樣品)1.00 ml，按照“3.1.1”方法測(cè)定總生物堿的含量。在樣品溶液中加入3.00 ml的苦參堿對(duì)照品溶液后測(cè)定吸光度， 計(jì)算 總生物堿含量，進(jìn)行加樣回收實(shí)驗(yàn)。平行測(cè)

8、定3次。樣品溶液體積1.00 ml，生物堿平均含量0.059 07 mg，加入量0.060 00 mg，平均回收率98.65%，RSD=1.98%。3.6 總生物堿的測(cè)定將6種不同產(chǎn)地來(lái)源的葉下珠藥材粉，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定總生物堿含量。結(jié)果見(jiàn)表1。表1 不同產(chǎn)地來(lái)源葉下珠中總生物堿含量測(cè)定結(jié)果（略） 4 結(jié)論由于葉下珠中生物堿成分易溶于酸性溶液，因此采用0.5醋酸作為提取液，結(jié)合超聲波提取方法，可以保證藥材中生物堿成分的完全提取。根據(jù)在一定pH介質(zhì)中，生物堿類(lèi)與氫離子生成陽(yáng)離子，酸性染料在此條件下解離成陰離子，兩者發(fā)生離子對(duì)反應(yīng)，定量結(jié)合生成有色絡(luò)合物，該絡(luò)合物可被有機(jī)溶劑定量萃取的原理，本實(shí)驗(yàn)用苦參堿作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在pH=7.5的緩沖溶液中與溴麝香草酚藍(lán)定量顯色，從而求得葉下珠中總生物堿的含量。pH環(huán)境對(duì)顯色反應(yīng)影響顯著。本實(shí)驗(yàn)中使苦參堿與溴麝香草酚藍(lán)分別在pH為6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸鹽緩沖液中反應(yīng)后測(cè)定吸光度，結(jié)果表明，當(dāng)在pH為7.5的磷酸鹽緩沖液中，顯色反應(yīng)達(dá)到最佳?！?參考文獻(xiàn) 】 1 劉喜綱, 劉翠哲, 常金花. 應(yīng)用酸性比色法測(cè)定總生物堿的含量J. 中國(guó) 藥房, 2007, 18(11): 875.2 李金陵, 程愛(ài)民, 荊宇紅，等. 重要苦參抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)腫瘤