江蘇省高校科研項(xiàng)目申報(bào)書介紹.doc

1、附件 4-1-1-1 ：江蘇省普通高校學(xué)術(shù)學(xué)位研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目申報(bào)書申請(qǐng)人：研 究 生 層 次： 博士研究生碩士研究生一級(jí)學(xué)科名稱：基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)二級(jí)學(xué)科名稱：免疫學(xué)研究方向：糖生物學(xué)申請(qǐng)項(xiàng)目名稱： TAK1 的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中的作用指導(dǎo)教師：季玉紅所在學(xué)校：南通大學(xué)江蘇省學(xué)位委員會(huì)制表江蘇省教育廳二 O 一四年四月填表說明一、填寫本表前，應(yīng)先仔細(xì)閱讀江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目實(shí)施與管理辦法等有關(guān)文件及本說明，務(wù)必實(shí)事求是填寫。二、填寫本表欄目時(shí)，如需要可加附頁。三、本表所有信息必須全部填寫，不存在的內(nèi)容一律填“無” 。項(xiàng)目名稱TAK1 的糖基化修飾在調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞

2、炎癥微環(huán)境中的作用項(xiàng)2014年 05月目A.人文社科項(xiàng)目起止至項(xiàng)目類別B.自然科學(xué)項(xiàng)目年限概2015年 05月況二級(jí)學(xué)科1001二級(jí)學(xué)科100102重點(diǎn)國家級(jí)代碼名稱學(xué)科省 級(jí)19912013博（碩）士姓名徐志偉性 別出生年月年 1男入學(xué)年月年 9 月申月請(qǐng)人15162774xuzhiweixy163.co所 在聯(lián)系電子醫(yī)學(xué)院院 系電話968信箱m1一、立項(xiàng)依據(jù) （包括項(xiàng)目來源，研究意義，國內(nèi)外研究現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢等）炎癥反應(yīng)是機(jī)體免疫系統(tǒng)針對(duì)外界刺激如感染和組織損傷而產(chǎn)生的一種復(fù)雜的生理性反應(yīng) , 由趨化因子、細(xì)胞因子、脂類炎癥介質(zhì)等參與。 巨噬細(xì)胞是炎癥反應(yīng)的主要效應(yīng)細(xì)胞,激活的巨噬細(xì)

3、胞在炎癥開始后迅速抵達(dá)炎癥部位 , 參與吞噬病原體和分泌各種參與炎癥反應(yīng)的介質(zhì)和細(xì)胞因子 1-2 】。炎癥反應(yīng)中所產(chǎn)生的 大量炎癥介質(zhì)在有效清除病原體的同時(shí) , 也可造成正常細(xì)胞和組織的病理性損傷。 因此 , 對(duì)炎癥反應(yīng)這把機(jī)體防御雙刃劍的有效調(diào)控就顯得尤為重要。巨 噬 細(xì) 胞 至 少 可 以 被 分 為 兩 種 類 型 :Ml型 , 即 經(jīng) 典 活 化 的 巨 噬 細(xì) 胞(Classicallyactivatedmacrophage)和MZ型,即替代性活化的巨噬細(xì)胞(Altemativelyaetivatedmacrophage)MI型巨噬細(xì)胞在細(xì)菌或其產(chǎn)物脂多糖(Lipopolysaceh

4、arides,LpS) 或干擾素 (Interferon一了 ,IFN 一丫 ) 的誘導(dǎo)下產(chǎn)生 , 表現(xiàn)為 :高遞呈抗原的能力 3-4】 ; 高分泌白細(xì)胞介素 12(Inierlukin一 12,IL 一 12) 和白細(xì)胞介素23(Inierlukin一 23,IL 一 23) 及其隨后誘導(dǎo)的 I型免疫應(yīng)答 ; 高產(chǎn)生毒性中間產(chǎn)物 一氧化氮 (Nitrieoxide,No),活性氧中間產(chǎn)物 (Reaetiveoxygen intermediates,Rol):的能力 因此 ,Ml 型巨噬細(xì)胞被認(rèn)為具有殺傷細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞并可以分泌多種促炎性細(xì)胞因子的能力而 MZ型巨噬細(xì)胞可由白細(xì)胞介素 4(In

5、terlukin 一 4,IL 一 4)! 白細(xì)胞介素 13(Interlukin 一 13,IL 一 13)! 糖皮質(zhì)激素 ! 轉(zhuǎn)化生長因子一 p(Transformatinggro 誠 hfacto 卜 p,TGF 一 p) 和前列腺素 EZ(ProstaglandinEZ,PGEZ) 等誘導(dǎo)產(chǎn)生 5 , 表現(xiàn)為 : 低的遞呈抗原的能力 ; 產(chǎn)生抑制細(xì)胞增殖和活性的細(xì)胞因子 , 如白細(xì)胞介素 10(Interfukin 一 10,IL 一 10); 較好的清除碎片的能力 ; 促進(jìn)血管生成和創(chuàng)傷愈合的能力。轉(zhuǎn)化生長因子（ TGF）-活化激酶（ TAK ），也叫做絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶 7

6、(MAP3K7) ，是絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 家族的一員 6 。TAK 在 TNF的產(chǎn)生和其他炎性介質(zhì)激活MAPK中有關(guān)鍵作用，比如p38a MAPK ，c-Jun 氨基末端激酶(JNK1/JNK2) ，ERK1/2 和轉(zhuǎn)錄因子核因子kB (NFkB) kB (NFkB)， TAK 在幾種細(xì)胞因子介導(dǎo)的先天免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)中很重要，包括TNF，IL-1 和 TGF-通路，也包括Toll 樣受體的下游信號(hào)和NOD1/2 。在這些通路中，多個(gè)促炎細(xì)胞因子和內(nèi)毒素觸發(fā)TAK 的活動(dòng)，引起自身磷酸化作用和IkB 激酶復(fù)合物的繼發(fā)補(bǔ)充， 最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NFkB 的激活。原生形態(tài)的TAK 包含

7、一個(gè)催化激酶亞單位與調(diào)節(jié)亞基TAB （ TAK1 結(jié)合蛋白 1，一種擬磷酸化酶）形成的復(fù)合物和兩種同源蛋白TAB2 or TAB3 之一。脂多糖或 IL-1 引起的 TAK1的活化由Lys63 相關(guān)的多聚泛素化腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6 多聚泛素化觸發(fā)，它與TAB2 和 TAB3 的碳端的鋅指結(jié)構(gòu)結(jié)合，刺激TAK1 的自身磷酸化和活化 7 。蛋白質(zhì)的糖基化可以影響蛋白質(zhì)的折疊、成熟、配體- 受體結(jié)合及胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在維持生理功 / 或疾病的發(fā)生中均發(fā)揮重要作用 8 。越來越多的研究表明，蛋白質(zhì)的糖基化修飾與巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化修飾與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，例

8、如白細(xì)胞表面的整合素及選擇素等細(xì)胞表面分子在被糖基化修飾后，能促進(jìn)其向炎性部位募集， 以完成免疫細(xì)胞識(shí)別 / 清除病原體等過程。 最近的研究也表明蛋白質(zhì)糖基化修飾參與膠巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境的形成及炎癥的發(fā)生及發(fā)展9 . 巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面的2高級(jí)糖基化終產(chǎn)物（ advanced glycosylation end product，AGE）能與巨噬細(xì)胞細(xì)胞表面高度聚糖化作用終產(chǎn)物的受體（receptor for advanced glycation end products，RAGE）相結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，上述研究結(jié)果表明蛋白糖基化修飾可影響巨噬細(xì)胞局部的炎癥反應(yīng)，在炎癥過程中發(fā)揮重要作

9、用 10】。目前國內(nèi)外研究巨噬細(xì)胞炎癥作用過程中所涉及的信號(hào)通路主要有，絲裂原活化蛋白激酶（ mitogen activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路以及細(xì)胞核因子-kappa B（ nuclear factor-kappa B，NF- B）信號(hào)通路 11。轉(zhuǎn)化生長因子 激活激酶（TAK1，MEKK7）是 MAP3K家族的成員之一，能被多種細(xì)胞因子包括 IL-1 ，IL-18 ，TNF- 等激活，處于這兩條途徑的分支點(diǎn)上 12 。TAK1 作為炎癥反應(yīng)中細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)上游重要的激酶，可能對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥起著重要的調(diào)節(jié)作用。其中經(jīng)典 NF- B 信號(hào)通路的激活在炎癥過程中

10、發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。已有的研究表明脂多糖（ lipopolysaccharide ，LPS）刺激的炎癥模型中， TAK1 的活性明顯上調(diào)，以及炎癥因子的表達(dá)穩(wěn)定性增高 13-14 。但 TAK1的糖基化對(duì)其炎癥具體的分子調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。綜上所述， TAK1是否存在糖基化的修飾？ LPS 刺激巨噬細(xì)胞炎性激活調(diào)節(jié)過程是否需要 TAK1 糖基化的參與？具體的調(diào)節(jié)機(jī)制是什么？這些問題都值得我們深入研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Ayub A, Ashfaq UA, Haque A. HBV induced HCC: major risk factors from genetic to molecular l

11、evel. Biomed Res Int. 2013;13(1):810461.2 Thomas DL. Global control of hepatitis C: where challenge meets opportunity. Nat Med. 2013;19(7):850-858.3 Barone C, Koeberle D, Metselaar H, Parisi G , Sansonno D, Spinzi G . Multidisciplinary approach for HCC patients: hepatology for the oncologists. Ann O

12、ncol. 2013;24(2): 15-23.4 Tian Y, Yang W, Song J, Wu Y, Ni B. Hepatitis B virus X protein-induced aberrant epigenetic modifications contributing to human hepatocellular carcinoma pathogenesis. Mol Cell Biol. 2013;33(15):2810-2816.5 Lazo-G mez R, Ram rez-Jarqu n UN, Tovar-Y-Romo LB, Tapia R.Histone d

13、eacetylases and their role in motor neuron degeneration. Front Cell Neurosci. 2013;7(3):243.6 Hojfeldt JW, Agger K, Helin K. Histone lysine demethylases as targets for anticancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2013;12(12):917-30.7 Parbin S, Kar S, Shilpi A, Sengupta D, Deb M, Rath SK, Patra SK. Histo

14、ne deacetylases: a saga of perturbed acetylation homeostasis in cancer. J Histochem Cytochem. 2014 ;62(1):11-33.8 Kelly RD, Cowley SM. The physiological roles of histone deacetylase (HDAC) 1 and 2: complex co-stars with multiple leading parts. Biochem Soc Trans. 2013;41(3):741-749.9 Reichert N, Chou

15、krallah MA, Matthias P. Multiple roles of class I HDACs in proliferation, differentiation,and development. Cell Mol Life Sci. 2012;69(13):2173-2187.10SchneiderG,Kr? merOH, SchmidRM, SaurD. Acetylationasatranscriptionalcontrolmechanism-HDACsandHATs inpancreaticductaladenocarcinoma.JGastrointestCancer

16、.2011;42(2):85-92.11Di MarcotullioL,Canettieri G, InfanteP, GrecoA,GulinoA. Protected fromthe inside: endogenoushistone deacetylase inhibitors and the road to cancer.Biochim Biophys Acta. 2011;1815(2):241-252.12Gao C, Dimitrov T, Yong KJ, Tatetsu H, Jeong HW, Luo HR, Bradner JE, Tenen DG, Chai L. Ta

17、rgetingtranscriptionfactorSALL4in acute myeloid leukemia by interruptingits interaction withan epigeneticcomplex. Blood. 2013;121(8):1413-1421.13Jiang Y, Iakova P, Jin J, Sullivan E, Sharin V, Hong IH, Anakk S, Mayor A, Darlington G, Finegold M,Moore D,TimchenkoNA.FarnesoidX receptorinhibitsgankyrin

18、in mouse liversandpreventsdevelopment of liver cancer. Hepatology. 2013;57(3):1098-1106.314 Buurman R, Grlevik E, Sch?ffer V, Eilers M, Sandbothe M, Kreipe H, Wilkens L, Schlegelberger B, Khnel F, Skawran B. Histone deacetylases activate hepatocyte growth factor signaling by repressing microRNA-449

19、in hepatocellular carcinoma cells. Gastroenterology. 2012;143(3):811-820.注：項(xiàng)目名稱應(yīng)簡潔明了，字?jǐn)?shù)限25 個(gè)漢字內(nèi)。4二、研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的主要問題研究目標(biāo)：(1) 明確 TAK1是否存在糖基化修飾（2）明確 TAK1的糖基化修飾在細(xì)胞炎癥微環(huán)境中的作用；（3）明確 TAK1的糖基化修飾在巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中作用；（4）明確 TAK1的糖基化修飾在巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌中的作用；研究內(nèi)容：1.TAK1 糖基化修飾在巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中的作用。（1）TAK1 糖基化位點(diǎn)的鑒定。 分離、純化 TAK1 的蛋白，利用

20、糖基化抗體及質(zhì)譜分析檢測 TAK1 是否存在糖基化修飾及其可能的糖基化修飾位點(diǎn)；利用凝集素印跡及質(zhì)譜鑒定其糖型及糖鏈結(jié)構(gòu)。（2）TAK1 糖基化修飾與巨噬細(xì)胞微環(huán)境之間的關(guān)系 。分析炎癥環(huán)境中 TAK1 的糖基化修飾在巨噬細(xì)胞；同時(shí)分析 TAK1 的糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌的影響。（3）TAK1 糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞微環(huán)境影響的分子機(jī)制。 干預(yù) TAK1 的糖基化修飾檢測巨噬細(xì)胞中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)的靶基因的表達(dá)及巨噬細(xì)胞生物學(xué)行為的改變；在此基礎(chǔ)上構(gòu)建炎癥模型，分析干預(yù)TAK1 的表達(dá)對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。（4）TAK1 的糖基化修飾在巨噬細(xì)胞中磷酸化的作用。 分析巨噬細(xì)胞中 TA

21、K1 表達(dá)及糖基化修飾與磷酸化修飾之間的關(guān)系，抑制 TAK1 的糖基化后檢測該分子磷酸化的變化。擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題：1.TAK1 是否可通過O-糖基化修飾影響巨噬細(xì)胞激活我們前期的研究在預(yù)測 TAK1存在糖基化修飾位點(diǎn)的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證 PPAR 能發(fā)生 O 糖基化修飾，深入分析其糖基化位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其分別位于 TAK1 與 TAB2結(jié)合域內(nèi)，而先前的研究也發(fā)現(xiàn)突變 PPAR 的糖基化位點(diǎn)可減少其對(duì)巨噬細(xì)胞激活的抑制，這表明PPAR 可通過糖基化修飾影響巨噬細(xì)胞激活。在后續(xù)研究中我們將鑒定PPAR 的糖鏈結(jié)構(gòu)，并分析抑制其與 TAB2結(jié)合，是否影響巨噬細(xì)胞激活。2.促進(jìn) TAK1 的糖基化修飾是否能

22、調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎性激活及其細(xì)胞因子的分泌？先前的研究也已經(jīng)報(bào)道在巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)過程中，TAK1 發(fā)生糖基化修飾后可促進(jìn)5巨噬細(xì)胞的激活，這提示 促進(jìn) TAK1 的糖基化修飾影響巨噬細(xì)胞激活及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子的分泌。抑制 TAK1的糖基化后，下調(diào)炎癥基因的表達(dá)，抑制巨噬細(xì)胞的激活及其介導(dǎo)的細(xì)胞因子。3.巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率課題組在前期研究中已經(jīng)構(gòu)建了以 Flag 為標(biāo)簽的 TAK1 全長質(zhì)粒，并用于 HEK293T 細(xì)胞中的過表達(dá)，已經(jīng)取得了較好的結(jié)果。同時(shí)在前期研究中，課題組已經(jīng)進(jìn)行了巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，并取得了較高的轉(zhuǎn)染效率。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，課題組將完善實(shí)驗(yàn)技術(shù)與方法，較好實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因過表

23、達(dá)的目的。6三、課題的研究思路與方法、技術(shù)路線、試驗(yàn)方案（含創(chuàng)新性）及其可行性分析研究思路與方法 :1. 分析小膠質(zhì)細(xì)胞中 TAK1 是否可發(fā)生 O- 糖基化修飾。a） 構(gòu)建 TAK1真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，免疫共沉淀后運(yùn)用O-GlcNac 抗體進(jìn)行檢測；同時(shí)將分離純化得到的 TAK1蛋白運(yùn)用 Click-iTTM O-GlcNAc Enzymatic Labeling System 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，對(duì) TAK1進(jìn)行可視化標(biāo)記，檢測 TAK1是否可發(fā)生糖基化；b） 將轉(zhuǎn)染 TAK1表達(dá)載體的 HEK293T細(xì)胞分別用 OGT的激活劑 GlcNacstain 及 OGA的抑制劑 C

24、pOGA處理，分別運(yùn)用免疫共沉淀純化 TAK1蛋白，運(yùn)用 O-GlcNac 抗體進(jìn)行檢測明確 TAK1可發(fā)生糖基化修飾；c） 分別選取巨噬細(xì)胞的細(xì)胞株，運(yùn)用免疫印跡檢測TAK1 的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上選取TAK1表達(dá)較高的細(xì)胞系運(yùn)用 TAK1抗體進(jìn)行免疫共沉淀，免疫印跡檢測 TAK1的糖基化修飾。2. TAK1 的 O-GlcNAc 修飾位點(diǎn)的確定。a） 利用生物信息學(xué)方法分析預(yù)測 TAK1的糖基化修飾位點(diǎn)， 在此基礎(chǔ)上構(gòu)建點(diǎn)突變載體，分別轉(zhuǎn)染 HEK293T細(xì)胞后，免疫共沉淀聯(lián)合免疫印跡分析 TAK1的糖基化位點(diǎn)；b） 在此基礎(chǔ)上分貝運(yùn)用 OGT的激活劑 GlcNacstain 及 OGA的抑制

25、劑 CpOGA處理細(xì)胞，免疫共沉淀聯(lián)合免疫印跡分析 TAK1 的可能的糖基化位點(diǎn)；分離純化巨噬細(xì)胞中TAK1蛋白，運(yùn)用 ETD-MS/MS分析 TAK1發(fā)生 O-GlcNac 修飾的糖基化位點(diǎn)。3. 分析 TAK1糖基化修飾與巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境之間的關(guān)系（ a）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型的 TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，收集細(xì)胞，采用 MTT法、流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞細(xì)胞增殖情況； Realtime PCR法及 ELISA法，檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（ IL-1 、 IL-6 、 TNF- 、IFN、IL-10 等）的合成及分泌改變，分析 TAK1糖基化修飾與巨噬細(xì)胞生物學(xué)行為改變之間的關(guān)

26、系。（ b）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型的 TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，利用炎癥細(xì)胞因子 IL-1 、LPS 等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞，模擬炎性微環(huán)境，不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，采用上述方法檢測巨噬細(xì)胞的增殖、能力的改變，分析炎癥環(huán)境中 TAK1 的糖基化修飾在巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境發(fā)生發(fā)展中的作用。（ c）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型的 TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，利用炎癥細(xì)胞因子 IL-1 、LPS等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞，分別采用 Realtime PCR法及 ELISA法，檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子（ IL-1 、 IL-6 、 TNF-、 IFN- 、IL-10 等）的合成及分泌改變。（ d）

27、將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型的 TAK1分別轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，利用炎癥細(xì)胞因子 IL-1 、TNF- 等刺激上述轉(zhuǎn)染后巨噬細(xì)胞，利用中和抗體阻斷上述細(xì)胞因子的生物學(xué)效應(yīng)，并檢測上述增殖、 炎性因子釋放等指標(biāo)變化， 以分析巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境中 TAK1的糖基化修飾在其炎癥反應(yīng)放大循環(huán)中的作用。74. 分析 TAK1的糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境影響的分子機(jī)制（ a）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型 TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合 western blot ，檢測巨噬細(xì)胞中 TAK1與 TAB2結(jié)合的改變；采用 western blot分析 MKK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的 JNK、E

28、RK等基因的表達(dá)變化；采用 MTT及流式細(xì)胞術(shù)分析 TAK1糖基化修飾改變對(duì)該信號(hào)通路直接下游事件巨噬細(xì)胞的增殖的影響。（ b）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型 TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合 western blot ，檢測巨噬細(xì)胞中 TAK1與 IKK 、 結(jié)合的改變；采用 western blot 分析 IKK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)的 IKK、 等基因的表達(dá)變化。（ c）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型 TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合 western blot ，檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中 MTDH與 p65 結(jié)合的改變；采用核漿分離技術(shù)、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)，

29、檢測 TAK1及 p65 的核漿分布情況，分析 TAK1糖基化修飾對(duì)于 p65 向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)情況的影響；采用western blot分析 I B的磷酸化水平變化；采用熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)，分析TAK1糖基化修飾對(duì)于細(xì)胞核內(nèi)NF- B 活性的影響；采用 Realtime PCR技術(shù)、 ELISA 法，檢測炎性細(xì)胞因子（IL-1 、IL-6 、TNF- 、IFN- 、IL-10 等）的合成及分泌改變。（ d）在此基礎(chǔ)上，分別利用多種炎癥因子 IL-1 、TNF- 等處理巨噬細(xì)胞，模擬巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境，并干預(yù) TAK1的表達(dá)，分析其對(duì)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活的影響。5. 分析 TAK1 發(fā)生 0- 糖基化

30、修飾對(duì)巨噬細(xì)胞激活的影響。(1)TAK1 發(fā)生 N- 糖基化修飾對(duì) TAK1 與 IKK 結(jié)合能力的影響。a） 將野生型及糖基化位點(diǎn)突變的 TAK1 轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后，檢測外轉(zhuǎn)受體的表達(dá)情況；b） 利用 FITC 標(biāo)記的 15-P-DJ 處理巨噬細(xì)胞 1 小時(shí)，固定細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面綠色熒光的結(jié)合情況，觀察干預(yù) TAK1 糖基化修飾對(duì)其與 IKK 結(jié)合能力的影響。(c ） MTT 法檢測上所述巨噬細(xì)胞中細(xì)胞活力的變化，ELISA 檢測上述細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌的變化，同時(shí)收集細(xì)胞蛋白，免疫印跡檢測細(xì)胞活化標(biāo)記物的變化；6. 分析 TAK1發(fā)生 0- 糖基化修飾對(duì)巨噬細(xì)胞磷酸化的影響（ a）

31、將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型 TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，采用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合 western blot, 檢測 TAK1的磷酸化的變化（ b）將野生型及糖基化位點(diǎn)突變型 TAK1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入巨噬細(xì)胞，在炎癥因子的刺激的情況下，采用 western blot 檢測 TAK1以及靶定下游分子的磷酸化變化8技術(shù)路線：創(chuàng)新性：（ 1）本項(xiàng)目研究的特色之處：本項(xiàng)目以炎癥發(fā)生過程中蛋白質(zhì)翻譯后的O-GlcNAc修飾為核心，以TAK1 的糖基化修飾為切入點(diǎn)，系統(tǒng)的從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)等多學(xué)科系統(tǒng)的研究刺激情況下TAK1 的 O-GlcNAc 修飾在巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生

32、及發(fā)展中的作用，為研究巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生機(jī)制，尋找炎癥治療方法提供理論依據(jù)。這是本項(xiàng)目的特色之處。（ 2）本項(xiàng)目研究的創(chuàng)新之處： 本項(xiàng)目研究中將蛋白質(zhì)糖基化修飾引入到巨噬細(xì)胞炎癥的調(diào)解中，從糖生物學(xué)角度研究表觀遺傳學(xué)的調(diào)控機(jī)制。本項(xiàng)目的研究可為闡明多因素導(dǎo)致的炎癥發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。這是本項(xiàng)目研究的創(chuàng)新之處。可行性：（1）立項(xiàng)依據(jù)充分，預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確，課題研究理論可行。前期的研究發(fā)現(xiàn)TAK1蛋白質(zhì)的糖基化修飾參與巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)展，而TAK1 也被報(bào)道參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)TAK1 可以發(fā)生呢個(gè) O-糖基化修飾，并在前期的研究中發(fā)現(xiàn)炎9癥情況下 O-GlcNA

33、c 明顯增加，這提示在巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生發(fā)展過程中， TAK1 的糖基化修飾促進(jìn)炎癥的發(fā)生與發(fā)展。（ 2）成員隊(duì)伍合理，學(xué)科層次全面，項(xiàng)目研究人員可行。 項(xiàng)目研究組成員來自外科學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)等多學(xué)科，擁有多學(xué)科的而研究背景，為項(xiàng)目的完成提供理論支持；同時(shí)項(xiàng)目組中有多位成員主持及參加國家自然科學(xué)基金的研究，具有完成本課題的能力。（ 3）研究方法多樣，研究的技術(shù)可行。 項(xiàng)目組在前期的研究中已經(jīng)系統(tǒng)的掌握細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、表觀遺傳學(xué)等多學(xué)科的研究技術(shù)及方法，可為本課題的研究提供技術(shù)支持。四、研究工作的總體安排及進(jìn)度2013年 01月-2015 年 12月 分析

34、 TAK1 存在糖基化修飾；在此基礎(chǔ)上分析TAK1的O-GlcNAc 修飾位點(diǎn)。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議 1 人/次。2015年 01月-2015 年 10月 分析 TAK1 的 O-GlcNAc 修飾對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥的改變； 在此基礎(chǔ)上分析其對(duì) NF-kB 通路的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1 人/次。2015年 11 月 -2016 年 03 月 分析 TAK1 的 O-GlcNAc 修飾對(duì) TAK1 調(diào)節(jié)的靶基因表達(dá)改變；在此基礎(chǔ)上分析其對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子的影響。 參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議 1 人/次；參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議 1 人/次?？偨Y(jié)結(jié)果，發(fā)表論文 1-2 篇。2016年 04月-2016 年 12月 分析巨

35、噬細(xì)胞中 TAK1 的 O-GlcNAc 修飾與巨噬細(xì)胞炎癥微環(huán)境的關(guān)系；構(gòu)建炎癥模型干預(yù) TAK1 的 O-GlcNAc 糖基化修飾，分析對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)生及發(fā)展的影響。參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會(huì)議1人/次；參加國際學(xué)術(shù)會(huì)議 1 人/次?？偨Y(jié)結(jié)果，發(fā)表論文1-2篇。總結(jié)課題研究內(nèi)容，撰寫項(xiàng)目結(jié)題報(bào)告。10五、研究工作的預(yù)期成果及成果提交形式1. 在 293T 細(xì)胞中，運(yùn)用免疫共沉淀結(jié)合 western blot, 檢測 TAK1 分子本身存在糖基化修飾2.在 293T 細(xì)胞中，用 OGA 的抑制劑 GlcNAcstatin 處理以后，明顯增強(qiáng)了TAK1 的糖基化水平。113.在巨噬細(xì)胞中，分別用不同濃度

36、的LPS 對(duì)巨噬細(xì)胞進(jìn)行刺激， 檢測 TAK1 的糖基化變化，發(fā)現(xiàn)明顯增加。12六、研究基礎(chǔ)和工作條件（申請(qǐng)人與本課題有關(guān)的研究成果，含承擔(dān)項(xiàng)目、發(fā)表論文、獲獎(jiǎng)、國內(nèi)外評(píng)價(jià)與引用情況；現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備、研究技術(shù)及協(xié)作條件等）1工作基礎(chǔ)（與本項(xiàng)目相關(guān)的研究工作積累和已取得的研究工作成績）。課題組多年來從事炎癥發(fā)生及發(fā)展機(jī)制的研究。目前已經(jīng)有的與本課題研究相關(guān)的基礎(chǔ)有：（1）在前期的研究中，課題組已經(jīng)對(duì)炎癥的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制展開大量的研究，已經(jīng)積累豐富的研究基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文1-4 ）；（2）課題組多年來一直從事蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)及其相互作用的研究，已經(jīng)積累本課題研究必須的方法（課題組前期

37、發(fā)表的相關(guān)論文 5-8 ）；（3）課題組在前期研究中已經(jīng)對(duì)蛋白質(zhì)糖基化修飾展開研究，并積累豐富基礎(chǔ)（課題組前期發(fā)表的相關(guān)論文 9-10 ）；（ 4）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn) TAK1存在糖基化修飾；（ 5）課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)干預(yù) TAK1糖基化的表達(dá)后， 明顯抑制了巨噬細(xì)胞炎癥的發(fā)生。1.1 課題組前期發(fā)表的與本項(xiàng)目研究內(nèi)容相關(guān)的論文:1 Wu H, Chen P, Liao R, Li YW, Yi Y , Wang JX, Cai XY , He HW, Jin JJ, Cheng YF, Fan J, Sun J*, Qiu SJ*. Intratumoral regulatory T c

38、ells with higher prevalence and more suppressive activity in hepatocellular carcinoma patients. J Gastroenterol Hepatol. 2013;28(9):1555-1564.2 Wu H, Chen P, Liao R, Li YW, Yi Y , Wang JX, Sun TW, Zhou J, Shi YH, Yang XR, Jin JJ, Cheng YF, Fan J*, Qiu SJ*. Overexpression of galectin-1 is associated

39、with poor prognosis in human hepatocellularcarcinoma following resection. J Gastroenterol Hepatol. 2012;27(8):1312-1319.3Liao R, Wu H, Yi Y , Wang JX, Cai XY , He HW, Cheng YF, Zhou J, Fan J, Sun J*, Qiu SJ*. Clinicalsignificance and gene expression study of human hepatic stellate cells in HBVrelate

40、d-hepatocellularcarcinoma. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32:22.4Yi Y, Wu H, Gao Q, He HW, Li YW, Cai XY, Wang JX, Zhou J, Cheng YF, Jin JJ， Fan J*, Qiu SJ*.Interferon regulatory factor (IRF)-1 and IRF-2 are associated with prognosisand tumor invasion inHCC. Ann Surg Oncol. 2013;20(1):267-276.5 Shen M,

41、 Ji Y, Zhang S, Shi H, Chen G, Gu X*, Ding F*. A proteome map of primary cultured rat Schwann cells. Proteome Sci. 2012;10(1):20.6 Ji Y, Shen M, Wang X, Zhang S, Yu S, Chen G , Gu X*, Ding F*. Comparative Proteomic Analysis of Primary Schwann Cells and a Spontaneously Immortalized Schwann Cell Line RSC 96: A Comprehensive Overview with a Focus on Cell Adhesion and M