基因工程與體外表達(dá)PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1基因工程與體外表達(dá)基因工程與體外表達(dá)基因工程：為實(shí)現(xiàn)基因克隆所采用的方法及其相關(guān)的工作。.*第1頁(yè)/共65頁(yè)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶切割切割DNADNA連接酶連接酶生成生成3- 5磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵DNA聚合酶聚合酶探針標(biāo)記、補(bǔ)平探針標(biāo)記、補(bǔ)平3末端末端反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶cDNA合成合成多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶5磷酸化、探針標(biāo)記磷酸化、探針標(biāo)記末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶3末端多聚尾末端多聚尾堿性磷酸酶堿性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基常用的工具酶：第一節(jié) 基因工程的工具酶.*第2頁(yè)/共65頁(yè)一類(lèi)能識(shí)別雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶 特異核苷酸序列 ： 大多為 4

2、6 bp 回文對(duì)稱（palindrome sequence） 5GAATTC 3 5GGATCC 33CTTAAG 5 3CCTAGG 51.分類(lèi)： 根據(jù)酶的基因、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、依賴的輔助因子及與DNA結(jié)合和裂解的特異性，限制性內(nèi)切酶可分為三型，即型、型、型。.*第3頁(yè)/共65頁(yè) 型酶具有限制和修飾作用。要求DNA分子上有特定的識(shí)別順序，并在此識(shí)別位點(diǎn)下游100至1000bp處切割。 型酶與型酶一樣，有限制和修飾作用。但在識(shí)別位點(diǎn)附近切割DNA，但切點(diǎn)難以預(yù)測(cè)。 型酶并不兼有甲基化酶的活性。在DNA分子內(nèi)部的識(shí)別特異位點(diǎn)并切割雙鏈DNA，切割為點(diǎn)固定、已知，是基因克隆重常用的工具酶。.*第4頁(yè)/

3、共65頁(yè).*第5頁(yè)/共65頁(yè).*第6頁(yè)/共65頁(yè)Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG平端粘端.*第7頁(yè)/共65頁(yè)來(lái)源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst4.同功異源酶：.*第8頁(yè)/共65頁(yè)有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端(compatible end)。 GGATCC CCTAGG AGATC

4、T TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A 5.同尾酶.*第9頁(yè)/共65頁(yè).*第10頁(yè)/共65頁(yè) 為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。克隆載體(cloning vector)為使插入的外源DNA序列被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expression vector) 為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。.*第11頁(yè)/共65頁(yè)（一）質(zhì)粒 (plasmid)存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子特點(diǎn) 能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息, 會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀。

5、一、常用的克隆載體.*第12頁(yè)/共65頁(yè)嚴(yán)密控制型(stringent control) 只在細(xì)胞周期的一 定階段進(jìn)行復(fù)制 在細(xì)胞內(nèi)只含 1個(gè) 或幾個(gè)松弛控制型(relaxed control) 在整個(gè)細(xì)胞周期中 隨時(shí)都可進(jìn)行復(fù)制 在細(xì)胞內(nèi)一般在20 個(gè)以上, 甚至多達(dá) 數(shù)千個(gè).*第13頁(yè)/共65頁(yè)n克隆載體的的質(zhì)粒應(yīng)具備下列特點(diǎn).*第14頁(yè)/共65頁(yè).*第15頁(yè)/共65頁(yè).*第16頁(yè)/共65頁(yè)（二）噬菌體(phage)野生型噬菌體為雙鏈線性DNA分子，兩端各帶12個(gè)堿基的單鏈粘性末端?；蚪M分三個(gè)區(qū)域：左側(cè)區(qū)（含有包殼的病毒顆粒所需的全部基因）、中間區(qū)（非必需區(qū)，但包含與重組有關(guān)的基因）、右

6、側(cè)區(qū)（包含所有主要調(diào)控組分）。系替換型載體，外源DNA：9 23kb常用：EMBL 系列（置換型，適用基因組克隆） gt 系列（插入型，適用cDNA克隆） charon系列.*第17頁(yè)/共65頁(yè).*第18頁(yè)/共65頁(yè).*第19頁(yè)/共65頁(yè)（三） 粘性質(zhì)粒(cosmid)粘性質(zhì)粒(cosmid)：又稱粘粒，由DNA的cos區(qū)與質(zhì)粒構(gòu)成，雙鏈環(huán)狀DNA，克隆容量：4050kb。.*第20頁(yè)/共65頁(yè) 一種大腸桿菌雄性特異絲狀噬菌體，全長(zhǎng)6.5kb。復(fù)制型M13可用作克隆載體。 最大優(yōu)點(diǎn)：產(chǎn)生單鏈DNA 為了便于克隆外源DNA片段，在野生型噬菌體DNA的基因和基因之間插入一段lacDNA。包括lac

7、啟動(dòng)基因-操縱基因序列以及編碼-半乳糖苷酶頭145個(gè)氨基酸的序列，并插入了多克隆位點(diǎn)序列。M13mp系列包括M13mp2、M13mp10、M13mp18、M13mp19等。.*第21頁(yè)/共65頁(yè).*第22頁(yè)/共65頁(yè)（五）病毒載體 人類(lèi)遺傳病和腫瘤的基因治療研究中，常用的病毒載體有反轉(zhuǎn)錄病毒、 腺病毒、腺相關(guān)病毒、HSV病毒?？蓪⑼庠椿?qū)胧荏w細(xì)胞，以達(dá)到糾正遺傳缺陷或殺死腫瘤細(xì)胞的目的。多數(shù)病毒載體已質(zhì)?；《据d體主要包括病毒啟動(dòng)子、包裝元件、選擇性遺傳標(biāo)記，以及pBR322的復(fù)制子。.*第23頁(yè)/共65頁(yè)酵母人工染色體 (yeast artificial chromosome, YAC

8、)細(xì)菌人工染色體 (bacterial artificial chromosome, BAC)動(dòng)物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他.*第24頁(yè)/共65頁(yè) 除具有克隆載體的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的DNA序列。（一）大腸桿菌表達(dá)載體含復(fù)制起始位點(diǎn)、抗性基因、克隆位點(diǎn)，可以導(dǎo)入大腸桿菌。表達(dá)載體中含啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。1.啟動(dòng)子：trp-lac(tac)啟動(dòng)子：由trp啟動(dòng)子加上lac操縱子中的操縱基因、SD序列融合而成。噬菌體PL啟動(dòng)子：一種溫度誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。T7噬菌體啟動(dòng)子：表達(dá)效率很高的啟動(dòng)子。二、表達(dá)載體.*第25頁(yè)/

9、共65頁(yè)2.核糖體結(jié)合位點(diǎn)：SD序列3.轉(zhuǎn)錄終止序列.*第26頁(yè)/共65頁(yè)(二)真核表達(dá)載體真核表達(dá)載體至少要含兩類(lèi)序列：原核質(zhì)粒的序列，包括在大腸桿菌中起作用的復(fù)制起始序列、能用在細(xì)菌中篩選克隆的抗藥性基因標(biāo)志等，以便插入真核基因后能先在很方便操作的大腸桿菌系統(tǒng)中篩選獲得目的重組DNA克隆、并復(fù)制繁殖得到足夠使用的數(shù)量。.*第27頁(yè)/共65頁(yè)在真核宿主細(xì)胞中表達(dá)重組基因所需要的元件，包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止和加poly-A信號(hào)序列、mRNA剪接信號(hào)序列、能在宿主細(xì)胞中復(fù)制或增殖的序列，能用在宿主細(xì)胞中篩選的標(biāo)志基因、以及供外源基因插入的單一限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)等。.*第28頁(yè)/共65頁(yè).

10、*第29頁(yè)/共65頁(yè)一、目的基因的獲?。ㄒ唬┗蚪MDNA文庫(kù) 采用限制性內(nèi)切酶將基因組DNA切成片段，每一片段都與一個(gè)載體分子拼接成重組體DNA，將所有重組體DNA分子都引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體，這樣一個(gè)混合體稱為基因文庫(kù)。.*第30頁(yè)/共65頁(yè)（二）cDNA文庫(kù)將某一時(shí)間某一種類(lèi)細(xì)胞中所有的cDNA的混合體與載體進(jìn)行連接，使每一個(gè)cDNA分子都與一個(gè)載體分子拼接成重組DNA，將所有重組DNA分子引入宿主細(xì)胞并進(jìn)行擴(kuò)增，得到分子克隆的混合體稱為cDNA文庫(kù)。.*第31頁(yè)/共65頁(yè)（三） PCR擴(kuò)增特定基因 TA克隆系統(tǒng)由Invitrogen公司發(fā)展而來(lái)的商業(yè)試劑盒，它用于P

11、CR產(chǎn)物的克隆和測(cè)序。其原理是利用Taq酶能夠在PCR產(chǎn)物的3末端加上一個(gè)非模板依賴的A，而T載體是一種帶有3T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）中 。.*第32頁(yè)/共65頁(yè)四、人工化學(xué)合成.*第33頁(yè)/共65頁(yè)二、載體的選擇與制備 噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫(kù)，pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建cDNA文庫(kù)和克隆一些較小的DNA片段，M13噬菌體則用于克隆一些待測(cè)序的DNA片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時(shí)要考慮載體中應(yīng)有合適的限制酶切位點(diǎn)。如果構(gòu)建的目的基因是要表達(dá)的，則要選擇合適的表達(dá)載體。.*第34頁(yè)/共65頁(yè)方

12、式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接 (2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接1. 粘性末端連接三、DNA分子的體外連接.*第35頁(yè)/共65頁(yè)Bam H切割反應(yīng) GGATCC CCTAGGT4 DNA連接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用 Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG載體DNA用Bam H切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重組體GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG載體自連目

13、的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接.*第36頁(yè)/共65頁(yè)不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAGAATTCCTTAAGAGATCTTCTAGAEco R切割位點(diǎn)Bg l切割位點(diǎn)AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+ Bg l雙酶切Eco R+ Bg l雙酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA連接酶15C重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點(diǎn)連接相似。.*第37頁(yè)/共65頁(yè)2. 平端連接 限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補(bǔ)齊或切平形成的平端適用于：.*第38頁(yè)/共65頁(yè)目的基因載體限

14、制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4 DNA連接酶15C重組體載體自連目的基因 自連.*第39頁(yè)/共65頁(yè)在末端轉(zhuǎn)移酶(terminal transferase) 的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。3. 同聚物加尾連接.*第40頁(yè)/共65頁(yè)四、將重組體DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞1、轉(zhuǎn)化指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并使其獲得新的表型的過(guò)程。2、感染以噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外經(jīng)過(guò)包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當(dāng)細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增。.*第41頁(yè)/共65頁(yè)3、轉(zhuǎn)染指真核細(xì)胞主動(dòng)攝取或被動(dòng)導(dǎo)入外源DNA片

15、段而獲得新的表型的過(guò)程。轉(zhuǎn)染方法：1、磷酸鈣共沉淀法2、電穿孔法3、DEAE-葡聚糖法4、脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染5、顯微注射法.*第42頁(yè)/共65頁(yè)五、目的基因的篩選與鑒定1、采用遺傳學(xué)方法篩選特定的重組DNA(1) 抗藥性標(biāo)記選擇(2) 標(biāo)志補(bǔ)救(marker rescue).*第43頁(yè)/共65頁(yè)(插入失活法)抗藥性標(biāo)記選擇.*第44頁(yè)/共65頁(yè)組氨酸缺陷型大腸桿菌無(wú)組氨酸的培養(yǎng)基酵母咪唑甘油磷酸脫水酶基因促進(jìn)組氨酸合成DNA重組體標(biāo)志補(bǔ)救若克隆基因的表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷互補(bǔ),那么就可以利用營(yíng)養(yǎng)突變菌株進(jìn)行篩選,這就是標(biāo)志補(bǔ)救.*第45頁(yè)/共65頁(yè) 互補(bǔ)的檢測(cè)目 錄.*第46頁(yè)/共65頁(yè)2

16、、免疫學(xué)方法利用特異性抗體檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物雞的肌球蛋白的克隆和免疫學(xué)檢測(cè)方法.*第47頁(yè)/共65頁(yè)原位雜交目 錄3、核酸雜交法篩選特定DNA.*第48頁(yè)/共65頁(yè)Southern印跡目 錄.*第49頁(yè)/共65頁(yè)4、PCR技術(shù)對(duì)特定DNA進(jìn)行直接鑒定5、利用限制性內(nèi)切酶酶切圖譜鑒定DNA hMLCK重組質(zhì)粒酶切圖譜分析1未酶切質(zhì)粒 2. EcoR酶切 3. Hind 酶切 4EcoR/Hind 雙酶切 5. 250bpDNA Ladder.*第50頁(yè)/共65頁(yè)一、轉(zhuǎn)染方法與原理1、磷酸鈣沉淀2、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染3、電穿孔4、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染5、顯微注射篩選標(biāo)志 tk- Neor G418瞬時(shí)轉(zhuǎn)染

17、 目的基因不整合進(jìn)宿主基因組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 目的基因整合進(jìn)宿主基因組.*第51頁(yè)/共65頁(yè)（一）TK-細(xì)胞突變株篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞.*第52頁(yè)/共65頁(yè).*第53頁(yè)/共65頁(yè).*第54頁(yè)/共65頁(yè)1. 寡核苷酸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變法：用于刪除或置換DNA片段中的核苷酸。原理：Klenow片段延伸與單鏈環(huán)狀DNA模板配對(duì)的寡核苷酸引物，引物中除有一處與模板的堿基錯(cuò)配外，其余全部與模板互補(bǔ)，由寡核苷酸錯(cuò)配處誘發(fā)突變，并在體外新合成一個(gè)雜合雙鏈DNA，最后用T4DNA酶連接成雙鏈閉環(huán)DNA分子；轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞，經(jīng)復(fù)制產(chǎn)生野生型和誘變型兩種DNA分子。通過(guò)篩選，獲得誘變型DNA分子。.*第55頁(yè)/共65頁(yè)步驟：將目的

18、基因片段插入M13噬菌體載體以重組噬菌體制備單鏈DNA設(shè)計(jì)并合成誘變寡核苷酸引物誘變寡核苷酸引物與靶單鏈DNA雜交Klenow片段延伸雜交的寡核苷酸引物T4DNA酶連接成雙鏈閉環(huán)DNA分子轉(zhuǎn)化宿主菌篩選含誘變型DNA的重組噬菌體制備單鏈DNA，測(cè)序驗(yàn)證.*第56頁(yè)/共65頁(yè)2.含U模板法.*第57頁(yè)/共65頁(yè)3. PCR定點(diǎn)誘變法：高效定點(diǎn)誘變技術(shù)原理：除合成所需的5端和3端常規(guī)引物（a，d）外，再合成一對(duì)帶有誘變位點(diǎn)的互補(bǔ)寡核苷酸引物（b，c）。分別利用誘變引物b和5端引物a，及誘變引物c和3端引物d擴(kuò)增出兩個(gè)誘變的片段（a/b片段和c/d片段）。經(jīng)去除擴(kuò)增反應(yīng)的剩余引物后，將擴(kuò)增出兩個(gè)誘變的片段等量混合、變性、退火，用DNA聚合酶大片段補(bǔ)齊。再利用5端和3端常規(guī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到定點(diǎn)誘變的DNA片段。.