《酵母表達(dá)系統(tǒng)》ppt課件

1、三三 酵母表達(dá)系統(tǒng)酵母表達(dá)系統(tǒng)一一 釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)UASURSTATA起始起始位點(diǎn)位點(diǎn)編碼序列編碼序列mRNA40-120bp20-40bp100-1400bp1、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)；、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)； 4、URS：上游阻遏序列：上游阻遏序列2、TATA盒：富含盒：富含AT； 5、DAS：下游激活序列：下游激活序列3、UAS：上游激活序列：上游激活序列;DAS半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制半乳糖誘導(dǎo)、葡萄糖抑制正電荷區(qū)正電荷區(qū)疏水區(qū)疏水區(qū)極性區(qū)極性區(qū)Met目的蛋白目的蛋白信號(hào)肽剪切位點(diǎn)信號(hào)肽剪切位點(diǎn)Met目的蛋白目的蛋白-Lys-Arg-Glu-A

2、la-Glu-Ala-KEX2DAPDAPDAP：STE13編碼的二肽酶編碼的二肽酶二二 甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子1、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子、甲醇酵母與甲醇氧化酶啟動(dòng)子2、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺陷、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺陷3、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理、甲醇酵母表達(dá)系統(tǒng)操作原理甲醇酵母系統(tǒng)宿主甲醇酵母系統(tǒng)宿主工程工程 畢赤酵母畢赤酵母 漢森酵母漢森酵母最適溫度最適溫度 30 37最適最適pH值值 4.5 4.5甘

3、油阻遏甘油阻遏 是是 否否糖基化糖基化 部分過(guò)度部分過(guò)度 較正常較正常高密度發(fā)酵高密度發(fā)酵 100g/L 100g/L 甲醇酵母系統(tǒng)宿主甲醇酵母系統(tǒng)宿主宿主 選擇標(biāo)志畢赤酵母畢赤酵母 his4、G418、 Zeocin、Cu+漢森酵母漢森酵母 leu2、 his3 、ura3、 G418甲醇酵母系統(tǒng)宿主甲醇酵母系統(tǒng)宿主宿主株 特點(diǎn) Y11430 野生型、野生型、Mut+GS115 his4- 、Mut+KM71 his4-、 aox1:ARG4 (AOX1-)、Muts SMD1168 his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌、胞外蛋白酶缺陷，高分泌MC1003 his4-、AOX1-、AOX2-

4、，甲醇不生長(zhǎng)，甲醇不生長(zhǎng)甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件甲醇酵母系統(tǒng)的整合事件畢赤酵母系統(tǒng)方式表達(dá)載體畢赤酵母系統(tǒng)方式表達(dá)載體1AOX1位點(diǎn)插入位點(diǎn)插入宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)：可插入位點(diǎn)： 5AOX1 3AOX1 TT轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts2His4位點(diǎn)插入位點(diǎn)插入轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)：可插入位點(diǎn)： 5His4 3His43 多基因插入事件串聯(lián)整合多基因插入事件串聯(lián)整合宿主株宿主株:GS115、KM71可插入位點(diǎn)：可插入位點(diǎn)： 5AOX1 3

5、AOX1 TT轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：GS115:His+Mut+KM71:His+Muts4 基因取代基因取代GS115，AOX1+轉(zhuǎn)化子：轉(zhuǎn)化子：His4+Muts漢森酵母系統(tǒng)的高拷貝整合型表達(dá)載體漢森酵母系統(tǒng)的高拷貝整合型表達(dá)載體高拷貝整合元件：高拷貝整合元件：A、高度反復(fù)序列：、高度反復(fù)序列：rDNA 提供多個(gè)整合位點(diǎn)提供多個(gè)整合位點(diǎn)B、缺陷型標(biāo)志基因：、缺陷型標(biāo)志基因：Leu2d 提高選擇壓力提高選擇壓力C、抗性標(biāo)志；、抗性標(biāo)志；neo 提高選擇壓力提高選擇壓力 甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體需求帶入需求帶入ATG單位點(diǎn)單位點(diǎn)甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體甲醇酵母系統(tǒng)胞內(nèi)表達(dá)載體

6、需求帶入需求帶入ATG多位點(diǎn)多位點(diǎn)甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號(hào)肽：信號(hào)肽：PHO1甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號(hào)肽：信號(hào)肽：MF甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體甲醇酵母系統(tǒng)分泌表達(dá)載體信號(hào)肽：信號(hào)肽：MF標(biāo)志：標(biāo)志：Kan4、甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響要素與對(duì)策、甲醇酵母系統(tǒng)高效表達(dá)影響要素與對(duì)策1載體穩(wěn)定性載體穩(wěn)定性2基因劑量基因劑量3整合位點(diǎn)整合位點(diǎn) 在分泌表達(dá)情況下，甲醇慢生長(zhǎng)型更利于表達(dá)6 6基因序列的基因序列的ATAT含量含量 AT AT含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的構(gòu)造含量越高、越容易出現(xiàn)類似于終止子的構(gòu)造7分泌信號(hào)分泌信號(hào)8 8表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性 分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響要素分泌表達(dá)時(shí)，胞外蛋白酶是要影響要素降低培育基降低培育基pHpH值：蛋白酶在酸性條件下活性較低值：蛋白酶在酸性條件下活