制備色譜離子色譜和超臨界流體色譜

1、第八章第八章 Chapter 8 現(xiàn)代色譜分析 Modern chromatography 目目 錄錄 1. 高效制備液相色譜高效制備液相色譜HPPC 2. 離子色譜離子色譜IC 3. 超臨界流體色譜超臨界流體色譜SFC 一、高效制備液相色譜一、高效制備液相色譜HPPC high performance preparative liquid chromatography 制備型液相色譜：制備型液相色譜：獲得高純（獲得高純（色譜純色譜純）物質(zhì)的有效方法。）物質(zhì)的有效方法。 基本原理：基本原理： 利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使其不同程度分布在不利用各組分物理化學(xué)性質(zhì)差異，使其不同程度分布在不 相溶

2、的兩相中，且各組分在兩相多次分布，從而達(dá)到分相溶的兩相中，且各組分在兩相多次分布，從而達(dá)到分 離的目的。離的目的。 HPPC特點(diǎn)特點(diǎn): （1）多為細(xì)顆粒多孔填料，分離效率高；）多為細(xì)顆粒多孔填料，分離效率高； （2）應(yīng)用廣泛，如極性和非極性、離子型和非離子型、小分子）應(yīng)用廣泛，如極性和非極性、離子型和非離子型、小分子 和大分子、熱穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性化合物；和大分子、熱穩(wěn)定性和熱不穩(wěn)定性化合物； （3）據(jù)化合物理化性質(zhì)配檢測(cè)器）據(jù)化合物理化性質(zhì)配檢測(cè)器, 如如 UV、DAD、FD、ELSD; （4）可連續(xù)自動(dòng)化操作。）可連續(xù)自動(dòng)化操作。 分析柱分析柱：內(nèi)徑：內(nèi)徑16 mm，柱長，柱長5 30 c

3、m 半制備柱半制備柱：內(nèi)徑內(nèi)徑8 mm，長，長1530 cm，一次制備，一次制備0.11 mg 制備柱：制備柱：內(nèi)徑內(nèi)徑2050 mm，柱長，柱長50 cm，粒徑，粒徑25 100 m， 流速可達(dá)數(shù)十流速可達(dá)數(shù)十mL/min 比較：比較： 高效液相色譜法：高效液相色譜法：分離分析，追求高準(zhǔn)確度、分析精度。分離分析，追求高準(zhǔn)確度、分析精度。 液相制備色譜法：液相制備色譜法：分離純化，追求低成本。分離純化，追求低成本。 比較：比較： 分析液相分析液相制備液相制備液相 樣品從檢測(cè)器進(jìn)入廢液瓶樣品從檢測(cè)器進(jìn)入廢液瓶樣品從檢測(cè)器進(jìn)入收集器樣品從檢測(cè)器進(jìn)入收集器 化合物定性或化合物定性或/ /和定量和定量

4、化合物分離或化合物分離或/ /和純化和純化 HPPC發(fā)展發(fā)展 20世紀(jì)世紀(jì)50-60年代第一個(gè)制備柱色譜儀；年代第一個(gè)制備柱色譜儀； 70年代第一套制備液相系統(tǒng)，小粒徑、高壓泵年代第一套制備液相系統(tǒng)，小粒徑、高壓泵 HPPC應(yīng)用應(yīng)用 化工、制藥、天然產(chǎn)物、生物技術(shù)和生化中珍貴產(chǎn)品的化工、制藥、天然產(chǎn)物、生物技術(shù)和生化中珍貴產(chǎn)品的 分離和純化。分離和純化。 量量應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍 pg酶的分離酶的分離 mg生物、生化試驗(yàn)生物、生化試驗(yàn) 結(jié)構(gòu)鑒定：合成副產(chǎn)物、生物基質(zhì)中代謝物、天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定：合成副產(chǎn)物、生物基質(zhì)中代謝物、天然產(chǎn)物 g標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品 毒理試驗(yàn)化合物毒理試驗(yàn)化合物 kg工業(yè)規(guī)模、活性化

5、合物、藥物工業(yè)規(guī)模、活性化合物、藥物 按固定相分類：按固定相分類： 半制備型（小規(guī)模制備型）半制備型（小規(guī)模制備型）：100 mg 制備型制備型：0.1100 g 大規(guī)模制備型：大規(guī)模制備型：100 g HPPC分類分類 按進(jìn)樣量分類：按進(jìn)樣量分類： 正相、反相、凝膠、離子交換、親和色譜等正相、反相、凝膠、離子交換、親和色譜等 1. 色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷）色譜柱的柱容量（柱負(fù)荷） 超載：超載：進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。進(jìn)樣量超過柱容量。柱效迅速下降，峰變寬。 對(duì)分析柱：對(duì)分析柱：不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量不影響柱效時(shí)的最大進(jìn)樣量 對(duì)制備柱：對(duì)制備柱：不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量

6、不影響收集物純度時(shí)的最大進(jìn)樣量 超載可超載可提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子提高制備效率，以柱效下降一半或容量因子k降低降低10%為為 宜宜 2. 液相制備色譜的方法液相制備色譜的方法 收集組分的幾種情況：收集組分的幾種情況： （a）可獲得良好分離，）可獲得良好分離，主峰主峰 （b）用制備柱，）用制備柱，超載超載提高效率；提高效率； （c）兩主成分之間的）兩主成分之間的小組分小組分； 超載，分離切分使待分離組分成超載，分離切分使待分離組分成 為主成分（為主成分（富集富集）后，再次分離）后，再次分離 制備。制備。 3. 制備型液相色譜儀制備型液相色譜儀 制備型液相色譜制備型液相色譜：結(jié)構(gòu)與

7、分析型一樣，但結(jié)構(gòu)與分析型一樣，但泵流量大泵流量大、進(jìn)樣量進(jìn)樣量 大大、采用制備柱；、采用制備柱；柱后餾分收集器柱后餾分收集器。 制備柱制備柱：內(nèi)徑內(nèi)徑2050 mm，柱長，柱長50 cm。 二、離子色譜二、離子色譜 Ion Chromatography, IC 離子色譜法：離子色譜法：用電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)陽、陰離子混合物作常量和痕用電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)陽、陰離子混合物作常量和痕 量分析的色譜法。量分析的色譜法。 1. 離子色譜法原理離子色譜法原理 principle of IC 利用利用色譜技術(shù)色譜技術(shù)測(cè)定測(cè)定離子型化合物離子型化合物，即以無機(jī)，即以無機(jī)( (特別是無機(jī)特別是無機(jī) 陰離子陰離子) )混合物

8、為主要分析對(duì)象?；旌衔餅橹饕治鰧?duì)象。 傳統(tǒng)離子交換色譜傳統(tǒng)離子交換色譜存在著兩個(gè)難于解決的問題：存在著兩個(gè)難于解決的問題： (1)(1)需要需要高濃度高濃度淋洗液洗脫且洗脫淋洗液洗脫且洗脫時(shí)間很長時(shí)間很長； (2)(2)洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線洗脫后的組分缺乏靈敏、快速的在線檢測(cè)方法檢測(cè)方法。 1975年，年，H. Small及其合作者創(chuàng)建及其合作者創(chuàng)建離子色譜，離子色譜，八十年代迅速發(fā)展八十年代迅速發(fā)展 離子色譜法原理離子色譜法原理 離子交換原理，離子交換原理，與傳統(tǒng)離子交與傳統(tǒng)離子交 換的不同點(diǎn)：換的不同點(diǎn)： 采用采用交換容量非常低交換容量非常低的特制離子的特制離子 交換交換樹脂

9、樹脂為為固定相固定相； 細(xì)顆粒細(xì)顆粒柱填料，高柱效；采用柱填料，高柱效；采用高高 壓輸液壓輸液泵；泵； 低濃度淋洗液低濃度淋洗液或或本底電導(dǎo)抑制本底電導(dǎo)抑制（在分離柱后，采用抑制柱（在分離柱后，采用抑制柱 來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）；來消除淋洗液的高本底電導(dǎo)）； 可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無機(jī)離子混合物；可采用電導(dǎo)檢測(cè)器，快速分離分析微量無機(jī)離子混合物； 各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。各種抑制裝置及無抑制方法的出現(xiàn)，發(fā)展迅速。 2. 離子色譜的優(yōu)點(diǎn)離子色譜的優(yōu)點(diǎn) （1）分析速度快分析速度快 數(shù)分鐘數(shù)分鐘內(nèi)完成試樣的分析；內(nèi)完成試樣的分析； （2）分離能力高）分離能力高 適宜

10、條件下，可使常見各種適宜條件下，可使常見各種 陰離子混合物分離陰離子混合物分離( (多組分分離多組分分離 分析分析) )。例：使用雙柱法，十幾。例：使用雙柱法，十幾 分鐘內(nèi)，七種陰離子完全分離分鐘內(nèi)，七種陰離子完全分離。 （3）分離混合陰離子的最有效方法）分離混合陰離子的最有效方法 （4）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱）耐腐蝕，儀器流路采用全塑件，玻璃柱 3. 離子色譜裝置類型離子色譜裝置類型 suppressed apparatus of IC 抑制型：抑制型：抑制柱型、連續(xù)抑制型、雙柱型抑制柱型、連續(xù)抑制型、雙柱型 分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常在分離柱中離子交換樹脂的交換容量通常

11、在0.01 0.05mmol/g干樹脂。加一根抑制柱，消除檢測(cè)干擾。干樹脂。加一根抑制柱，消除檢測(cè)干擾。 非抑制型非抑制型: 單柱型單柱型 進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量進(jìn)一步降低分離柱中樹脂的交換容量(0.0070.07 mmol/g干干 樹脂樹脂) )，使用，使用低濃度、低電離度低濃度、低電離度的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗的有機(jī)弱酸及弱酸鹽作淋洗 液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連，液，如苯甲酸、苯甲酸鹽等。檢測(cè)器可直接與分離柱相連， 不需抑制柱。不需抑制柱。 離子色譜連續(xù)抑制裝置圖離子色譜連續(xù)抑制裝置圖 通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變通過抑制柱將洗脫液轉(zhuǎn)變 成了電導(dǎo)值很小的水，消成

12、了電導(dǎo)值很小的水，消 除了本底電導(dǎo)的影響除了本底電導(dǎo)的影響 洗脫劑洗脫劑NaOH中的中的Na+與高容量的擬制柱中交與高容量的擬制柱中交 換樹脂產(chǎn)生離子交換，換樹脂產(chǎn)生離子交換，OH和和H+中和產(chǎn)生水，中和產(chǎn)生水， 從而消除洗脫劑本底對(duì)檢測(cè)的干擾。從而消除洗脫劑本底對(duì)檢測(cè)的干擾。 離子色譜連續(xù)抑制原理圖離子色譜連續(xù)抑制原理圖 4. 離子色譜的應(yīng)用離子色譜的應(yīng)用 application of IC 低濃度無機(jī)或有機(jī)陰離子分析、堿金屬、堿土金屬、重金屬低濃度無機(jī)或有機(jī)陰離子分析、堿金屬、堿土金屬、重金屬 、稀土金屬盒有機(jī)酸、胺和銨鹽等、稀土金屬盒有機(jī)酸、胺和銨鹽等 （1）水質(zhì)分析、高純水離子分析、礦

13、泉水、雨水、廢水及電）水質(zhì)分析、高純水離子分析、礦泉水、雨水、廢水及電 廠水分析；廠水分析； （2）紙漿和漂白液分析、食品分析、生物體液分析）紙漿和漂白液分析、食品分析、生物體液分析 （3）鋼鐵工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等應(yīng)用。）鋼鐵工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等應(yīng)用。 分析對(duì)象：分析對(duì)象： 雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱雙柱；薄殼型陰離子交換樹脂分離柱(3250 mm), 流動(dòng)相：流動(dòng)相：0.003 molL-1NaHCO3/0.0024 molL-1Na2CO3， 流量流量138 mL/h。 七種陰離子在七種陰離子在20 min內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量內(nèi)基本上得到完全分離，各組分含量 在在350 ppm。

14、 舉例：舉例： 5. 離子色譜法展望離子色譜法展望 固定相：固定相：合成新的低交換容量離子交換樹脂合成新的低交換容量離子交換樹脂 流動(dòng)相：流動(dòng)相：新的洗脫液新的洗脫液 檢測(cè)器：檢測(cè)器：高靈敏度高靈敏度 三、超臨界流體色譜三、超臨界流體色譜 SFC supercritical fluid chromatography 超臨界流體色譜超臨界流體色譜 以超臨界流體做流動(dòng)相，依靠流動(dòng)相的溶劑化能力來以超臨界流體做流動(dòng)相，依靠流動(dòng)相的溶劑化能力來 進(jìn)行分離、分析的色譜過程。進(jìn)行分離、分析的色譜過程。 20世紀(jì)世紀(jì)80年代發(fā)展和完善起來的一種新技術(shù)。年代發(fā)展和完善起來的一種新技術(shù)。 1. 概述概述 超臨界

15、流體：超臨界流體：在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一在高于臨界壓力與臨界溫度時(shí)，物質(zhì)的一 種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。種狀態(tài)。性質(zhì)介于液體和氣體之間。 超臨界流體色譜超臨界流體色譜(SFC)：具有具有HPLC和和GC不具有的優(yōu)點(diǎn)不具有的優(yōu)點(diǎn): （1）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣；）可處理高沸點(diǎn)、不揮發(fā)試樣； （2）大分子、高聚物、熱不穩(wěn)定化）大分子、高聚物、熱不穩(wěn)定化 合物分離分析；合物分離分析； （3）比）比LC柱效和分離效率更高。柱效和分離效率更高。 SFC是是GC和和LC的補(bǔ)充的補(bǔ)充 超臨界流體性質(zhì)超臨界流體性質(zhì) （1）性質(zhì)介于液體和氣體之間性質(zhì)介于液體和氣體之間; ; 有氣體的低黏度

16、、液體的高密度，中間的擴(kuò)散系數(shù)。有氣體的低黏度、液體的高密度，中間的擴(kuò)散系數(shù)。 （2）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分）可通過改變超臨界流體的密度（程序改變）調(diào)節(jié)組分 分離分離（類似于（類似于GC程序升溫，程序升溫，HPLC梯度淋洗）。梯度淋洗）。 超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。超臨界流體的密度與壓力有關(guān)。 流體流體 超臨界超臨界 溫度溫度/ 超臨界壓力超臨界壓力 /106Pa 超臨界壓力超臨界壓力 /gcm-3 在在4107Pa時(shí)時(shí) 密度密度 CO231.17.290.470.96 N2O36.57.170.450.94 NH3132.511.280.240.40 n-C4H10

17、152.037.50.230.50 一些超臨界流體的性質(zhì)一些超臨界流體的性質(zhì) 2. 原理原理 SFC的流動(dòng)相的流動(dòng)相：超臨界流體，如超臨界流體，如CO2、N2O、NH3 SFC的固定相的固定相：固體吸附劑固體吸附劑（硅膠）或（硅膠）或鍵合鍵合到載體（或到載體（或 毛細(xì)管壁）上的毛細(xì)管壁）上的高聚物高聚物；可使用；可使用LC的柱填料的柱填料。有填充柱。有填充柱SFC 和毛細(xì)管柱和毛細(xì)管柱SFC； 分離機(jī)理：分離機(jī)理：吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同吸附與脫附。組分在兩相間的分配系數(shù)不同 而被分離；而被分離； 通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相的密度），調(diào)整組分通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的壓力（調(diào)節(jié)流動(dòng)相

18、的密度），調(diào)整組分 保留值；保留值； 壓力效應(yīng)壓力效應(yīng)： 不利因素：不利因素：SFC柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大柱壓降大（比毛細(xì)管色譜大30倍），影響分離倍），影響分離 （柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大柱前端與柱尾端分配系數(shù)相差很大壓力效應(yīng)壓力效應(yīng)）； 克服辦法：克服辦法：超臨界流體密度在臨界壓力處受壓力影響最大，超臨界流體密度在臨界壓力處受壓力影響最大，超超 過臨界壓力過臨界壓力20%，柱壓降對(duì)分離的影響小；，柱壓降對(duì)分離的影響??； 利用壓力效應(yīng)：利用壓力效應(yīng)：SFC中壓力變化對(duì)容量因子影響顯著，超流中壓力變化對(duì)容量因子影響顯著，超流 體密度隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時(shí)間體密度

19、隨壓力增加而增加，密度增加提高溶劑效率，淋洗時(shí)間 縮短?？s短。 如：如：CO2流動(dòng)相，當(dāng)壓力：流動(dòng)相，當(dāng)壓力：7.09.0106 Pa，C16H34的保留的保留 時(shí)間時(shí)間 25 min 5 min。 程程 序序 升升 壓壓 3. 超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程超臨界流體色譜的結(jié)構(gòu)與流程 Instrument structure and the general process of SFC (1)(1)結(jié)構(gòu)流程結(jié)構(gòu)流程 (2) 主要部件主要部件 SFC的高壓泵的高壓泵 無脈沖無脈沖注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器，注射泵；通過電子壓力傳感器和流量檢測(cè)器， 計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量。計(jì)算機(jī)控制流動(dòng)相的密度和流量。 SFC的色譜柱和固定相的色譜柱和固定相 SFC的色譜柱：的色譜柱：LC色譜柱或交聯(lián)毛細(xì)管柱；色譜柱或交聯(lián)毛細(xì)管柱； SFC的固定相的固定相：固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或固體吸附劑（硅膠）或鍵合到載體（或 毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱毛細(xì)管壁）上的高聚物；專用的毛細(xì)管柱SFC。 主要部件主要部件 流動(dòng)相流動(dòng)相 SFC的流動(dòng)相的流動(dòng)相：超臨界流體超臨界流體CO2、N2O、NH3、乙烷等、乙烷等 CO2應(yīng)用最廣泛；無色、無味、無毒、價(jià)廉易得、對(duì)各類應(yīng)用最廣泛；無色、無味、