血小板活化因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子作用的研究

1、血小板活化因子對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子作用的研究【摘要】目的觀察腦損害時(shí)病理活性介質(zhì)血小板活化因子(platelet activating factor, PAF)及其拮抗劑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子（Ca2+i）濃度的影響，探討PAF致使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i超載的途徑及其作用機(jī)制。方法采用AR-CM-MIC陽(yáng)離子檢測(cè)系統(tǒng)，觀察不同濃度的PAF以及其特異性受體拮抗劑BN52021和非特異性拮抗劑MK-801對(duì)體外培養(yǎng)14天的大鼠皮層神經(jīng)元Ca2+i濃度的影響。結(jié)果510-6 mol/L的PAF可使培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞Ca2+i濃度明顯增高，與對(duì)照組比較差異有顯著意義(P0.01)；BN52021可明顯阻止P

2、AF所致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i超載，在此基礎(chǔ)上加用MK-801可使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i水平下降的更為明顯。結(jié)論P(yáng)AF可通過多種渠道致使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載。【關(guān)鍵詞】血小板活化因子 鈣 神經(jīng)元 The effect of platelet activating factors on cytosolic free calcium of cultured neurons from cerebral cortex in rats WANG Wei?, XU Jianhua. ?Department of Neurology,Tongji Hospital,Tongji Medical Univers

3、ity Wuhan 430030【Abstract】ObjectivesTo determine the effect of platelet activating factor (PAF) on cytosolic free calcium (Ca2+i) of cultured neurons from cerebral cortex in rats and their pathepenetic effect on neuronal calcium overload and ceubal brain. MethodsThe primary neuron cultured for 14 da

4、ys was obtained and the effect of PAF in different concentrations on Ca2+i was observed by the AR-CM-MIC cation measurement system .The route of PAF increase Ca2+i was observed with BN52021 and MK-801. ResultsThe Ca2+i was elevated by PAF in the concentration of 510-6 mol/L (P0.01), but the effect w

5、as blocked by the specific PAF receptor antagonist BN52021. The effect of BN52021 was strengthened by MK-801. ConclusionCa2+i of the cultured neurons is elevated by PAF. PAF receptor antagonist BN52021 and MK-801 have a potent resistant effect on PAF.【Key words】Platelet activating factor Calcium Neu

6、rons 細(xì)胞內(nèi)外鈣離子的穩(wěn)態(tài)失調(diào)是缺血性神經(jīng)元損傷及壞死的主要機(jī)制之一，而PAF是一種與花生四烯酸代謝密切相關(guān)的內(nèi)源性活性磷脂及脂質(zhì)介質(zhì)。大量研究結(jié)果表明，腦缺血過程中神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載和PAF積聚是腦損害各個(gè)病理環(huán)節(jié)中的“扳機(jī)點(diǎn)”，二者共同介導(dǎo)并直接參與了缺血及再灌注期腦組織的損害；低濃度的PAF則可影響神經(jīng)細(xì)胞鈣離子的流動(dòng)，使神經(jīng)細(xì)胞游離鈣離子(Ca2+i)濃度水平明顯增高1-3。但迄今為止，PAF促使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載的途徑及機(jī)制尚不十分清楚。為此，我們采用AR-CM-MIC陽(yáng)離子檢測(cè)系統(tǒng)，觀察不同濃度的PAF對(duì)體外培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元Ca2+i濃度的影響，并同時(shí)觀察了PAF特異性受

7、體拮抗劑BN52021以及MK-801對(duì)PAF所致神經(jīng)元鈣離子超載的作用，探討PAF致使神經(jīng)元鈣離子超載的途徑及其在腦損害時(shí)的作用機(jī)制。材料與方法一、 材料 PAF、Fura2-AM (Sigma公司)，BN52021(法國(guó)Braguet博士惠贈(zèng))，MK-801(重慶醫(yī)科大學(xué)藥理教研室)，AR-CM-MIC陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)（美國(guó)Spex公司），Diapho-TMD型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。二、 方法1.神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)：取孕18日SD大鼠，斷頭后無(wú)菌取腦并去除腦膜， 無(wú)菌Hank液沖洗后，分離大腦皮層并將其放入試管中，充分吹打至看不見組織塊為止，靜置5分鐘。將上清液移入10 ml離心管

8、中，100g離心5分鐘，去除上清，置于完全培養(yǎng)基（DMEM/F12 85% ，胎牛血清5%，小牛血清10%），混勻。以5106個(gè)細(xì)胞/L 接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，37 ，50分鐘。抽取未貼壁的細(xì)胞，以5105個(gè)細(xì)胞/L接種于放置有小玻片（已涂有多聚賴氨酸）的12孔培養(yǎng)板中，37，5% CO2 條件進(jìn)行培養(yǎng)，定期換液至第14天，可見典型的錐體樣神經(jīng)細(xì)胞，取出小玻片用Hank液清洗2次后待用。2.單細(xì)胞胞漿Ca2+i濃度測(cè)定：3 mol/L Fura-2/AM孵育小玻片，37，40分鐘，中間輕輕振搖1次，小玻片經(jīng)無(wú)鎂Hank液漂洗2次，放入含有1ml無(wú)鎂Hank液的特制瓶中，在陽(yáng)離子測(cè)定系統(tǒng)中檢

9、測(cè)單個(gè)錐體樣神經(jīng)元的熒光強(qiáng)度，激發(fā)光波長(zhǎng)分別為340 nm和380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為505 nm，觀察不同實(shí)驗(yàn)條件下熒光強(qiáng)度的變化。通過玻璃微量移液器加入條件液，在1秒鐘內(nèi)完成加樣過程，由下式計(jì)算胞漿內(nèi)Ca2+i1 ：Ca2+i =Kd*(R-Rmin)/(Rmax-R)。式中R是實(shí)測(cè)率，Rmin是最小率，Rmax是最大率，Kd是Fura-2與鈣離子結(jié)合的解離常數(shù)，是F380最小/F380最大的比值。神經(jīng)元的自發(fā)熒光在沒有負(fù)載Fura-2 時(shí)進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算鈣離子濃度前減去自發(fā)熒光和背景熒光。3.實(shí)驗(yàn)分組：（1)PAF組： 通過玻璃微量移液器分別將510-6 mol/L、510-5 mol/L

10、的PAF加入被測(cè)細(xì)胞周圍孵育液中，1秒鐘內(nèi)完成；（2)BN52021組：在加入510-5 mol/L PAF之前，將20 g BN52021加入細(xì)胞孵育液中，然后將PAF（510-5 mol/L）加入到被測(cè)細(xì)胞周圍孵育液中；（3)聯(lián)合治療組（BM）：在加入PAF之前將BN52021 20 g及MK-801 40 g 同時(shí)加入到細(xì)胞孵育液中，然后再將PAF（510-5 mol/L）加入到被測(cè)細(xì)胞周圍孵育液中。結(jié)果神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)Ca2+i濃度為（0.9941.034）10-7 mol/L。510-6 mol/L PAF組神經(jīng)細(xì)胞Ca2+i水平較對(duì)照組有所增加，510-5 mol/L PAF組神經(jīng)細(xì)胞

11、Ca2+i水平較對(duì)照組增加更為明顯（P0.01)。BN52021組神經(jīng)細(xì)胞Ca2+i水平較510-5 mol/L PAF組有所下降，而BN52021聯(lián)合MK-801治療組神經(jīng)細(xì)胞Ca2+i水平較510-5mol/L PAF組下降的更為顯著（P0.01）。見表1。表1血小板活化因子及其拮抗劑對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的影響(s)組別例數(shù)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i(110-7 mol/L)對(duì)照組180.990.15PAF 110-6 mol/L組71.380.19*PAF 110-5 mol/L組102.040.18*PAF+BN 52021組71.160.13*PAF+BM組71.050.12*

12、與對(duì)照組比較，P0.01; 與PAF 110-6 mol/L組比較，P0.01;* 與PAF 110-5 mol/L組比較，P0.01討論P(yáng)AF為缺血半暗帶區(qū)主要的病理介質(zhì)4,其不僅對(duì)神經(jīng)組織有直接的毒性作用，更為重要的是其在腦缺血繼發(fā)性腦損害過程中增強(qiáng)、活化了一系列與損害有關(guān)的介質(zhì)和關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)。Kochanek等5 用生光鈣探針-水母發(fā)光蛋白研究PAF對(duì)細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的影響，發(fā)現(xiàn)極低濃度的PAF則可影響神經(jīng)細(xì)胞鈣離子的流動(dòng)，致使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i濃度明顯增加。本研究結(jié)果證實(shí)了該結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)510-6mol/L PAF可使神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+i水平明顯增高。隨著PAF濃度的增加，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)

13、Ca2+i水平逐漸提高。當(dāng)PAF的濃度達(dá)到510-4 mol/L 時(shí)，培養(yǎng)神經(jīng)元立即皺縮、死亡?？梢奝AF對(duì)神經(jīng)元本身有直接的毒性作用。大量研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，腦缺血時(shí)PAF可通過與之特異受體相偶聯(lián)的G蛋白結(jié)合，激活GTPase及磷脂酰肌醇(phosphatidylinostiol, PI)特異的磷脂酶C（PLC），從而促進(jìn)磷脂肌醇代謝增強(qiáng),使二酰基甘油（diacylglycerol，DG）及三磷酸肌醇(inositol trisphosphate，IP3 ）水平增高，最終引起細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣離子增加、蛋白激酶C活化，從而使膜結(jié)構(gòu)改變，離子通道受損及跨膜信息傳遞紊亂3,6,7。本研究結(jié)果顯示，特異性

14、PAF受體拮抗劑BN52021可有效地阻止PAF所致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，也為以上理論提供了佐證?，F(xiàn)已明確，PAF可通過激活I(lǐng)P3致使神經(jīng)元胞內(nèi)鈣庫(kù)中儲(chǔ)存的鈣離子釋放增加。但PAF是否可直接通過細(xì)胞膜上的受體操縱型或電壓敏感型鈣離子通道，使細(xì)胞外大量的鈣離子內(nèi)流，目前尚不十分清楚。我們?cè)谟锰禺愋訮AF受體拮抗劑BN52021的同時(shí)加用了非特異性的NMDA受體拮抗劑MK-801,結(jié)果更為有效地阻斷了PAF所致的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載現(xiàn)象。該結(jié)果說(shuō)明，PAF可直接影響細(xì)胞膜上的受體操縱型鈣離子通道，增加神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2i濃度。由此可見，PAF作為一種病理活性介質(zhì)，可通過多種渠道致使神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子

15、超載。因此，腦缺血的腦保護(hù)治療措施應(yīng)強(qiáng)調(diào)針對(duì)各個(gè)病理環(huán)節(jié)的綜合治療。本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)資助項(xiàng)目（No.39870260）作者單位：430030 武漢，同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（王偉）；華中理工大學(xué)生物物理與生物化學(xué)研究所（徐建華）參考文獻(xiàn)1Bazan NG,Allan G. PAF in the modulation of excitatory amino acid neurotransmitter release and of gene expression.J Lipid Mediat Cell Signal, 1996,14:321-330.2Feuerstein G，Yu

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