實(shí)驗(yàn)報(bào)告2熒光分光光度法測(cè)定維生素B2的含量

1、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目：熒光分光光度法測(cè)定維生素 B2的含量【實(shí)驗(yàn)題目】熒光分光光度法測(cè)定維生素 B2的含量【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?掌握標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量分析維生素B2的基本原理。2、了解熒光分光光度計(jì)的基本原理、結(jié)構(gòu)及性能，掌握其基本操作?！緦?shí)驗(yàn)原理】維生素B2(又叫核黃素，VR)是橘黃色無臭的針狀結(jié)晶。其結(jié)構(gòu)式為:由于分子中有三個(gè)芳香環(huán)，具有平面剛性結(jié)構(gòu)，因此 它能夠發(fā)射熒光。維生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī) 溶劑，在中性或酸性溶液中穩(wěn)定，光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定。維生素B2溶液在430440nm藍(lán)光的照射下，發(fā)出綠色 熒光，熒光峰在 535nm附近。維生素 B2在pH 67的溶 液中熒光強(qiáng)度最大，而且其熒光強(qiáng)度與維

2、生素B2溶液濃度呈線性關(guān)系，因此可以用熒光光譜法測(cè)維生素E2的含量。維生素B在堿性溶液中經(jīng)光線照射會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)化為 另一物質(zhì)一一光黃素，光黃素也是一個(gè)能發(fā)熒光的物質(zhì)，其熒光比維生素 B2的熒光強(qiáng)得多，故測(cè)維生素B2的熒光時(shí)溶液要控制在酸性范圍內(nèi)，且在避光條件下進(jìn)行。在稀溶液中，熒光強(qiáng)度 F與物質(zhì)的濃度c有以下關(guān)系：F= 2.303Io s be 當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件一定時(shí)，熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系：F=Kc這是熒光光語法定量分析的依據(jù)?！局饕獌x器與試劑】主要儀器：F-2500 HiTachi熒光分光光度計(jì)；1cm石英皿；50mL容量瓶；5mL移液管；燒杯； 膠頭滴管試劑：維生素B2標(biāo)準(zhǔn)溶液：

3、未知液 4【實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟】1、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取維生素 E2標(biāo)準(zhǔn)溶液(10.0 卩 g/mL)1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分別置于50mL的容量瓶中，各加入去離子水稀釋至刻度，搖勻。標(biāo)記為的一系列維生素B標(biāo)準(zhǔn)溶液。待測(cè)。2、待測(cè)液制備取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中，加入去離子水稀釋至刻度，搖勻。待測(cè)。3、激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的繪制設(shè)置入em= 540nm為發(fā)射波長(zhǎng)，在250500nm范圍內(nèi)掃描標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄熒光發(fā)射強(qiáng) 度和激發(fā)波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，便得到激發(fā)光譜。 從激發(fā)光譜圖上找出其最大激發(fā)波長(zhǎng)入ex。在此激發(fā)波長(zhǎng)下，在400600nm范

4、圍內(nèi)掃描，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系，便得到熒光發(fā)射光譜。從熒光發(fā)射光譜上找出其最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)入em4、標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品的熒光測(cè)定將激發(fā)波長(zhǎng)固定在最大激發(fā)波長(zhǎng)入ex,熒光發(fā)射波長(zhǎng)固定在最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)處入em掃描蒸餾水和上述 5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液的熒光發(fā)射強(qiáng)度。數(shù)據(jù)記錄于表1中。以溶液的熒光發(fā)射強(qiáng)度 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在同樣條件下測(cè)定未知溶液的熒光強(qiáng)度，并由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定未知試樣中維生素B2的濃度，計(jì)算待測(cè)樣品溶液中的維生素 B2的含量?！緮?shù)據(jù)記錄與結(jié)果分析】、維生素B2激發(fā)光譜圖:最大激發(fā)波長(zhǎng)入ex=373nm、維生素B2熒光發(fā)射光譜圖：TiPriSf最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)

5、處入 em=524nm表1標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測(cè)溶液的濃度和熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)記錄:維生素Eb溶液濃度/ （卩g/mL）0.0000.2000.4000.6000.8001.000相對(duì)熒光強(qiáng)度0.23424.6548.0070.5091.86112.9、系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度與熒光發(fā)射強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖:由計(jì)算機(jī)處理得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=112.49x-1.7769相關(guān)系數(shù)r=則待測(cè)溶液的濃度 c =0.907卩g/mL【問題討論】1、試解釋熒光光度法較吸收光度法靈敏度高的原因？答：原因是由于現(xiàn)代電子技術(shù)具有檢測(cè)十分微弱光信號(hào)的能力，并且熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)度成正比，提高激發(fā)光強(qiáng)度也可以增大熒光強(qiáng)度，使測(cè)定的靈敏度提高；而吸收光度法測(cè) 定的是吸光度，不管是增大入射光強(qiáng)度，還是提高檢測(cè)器的靈敏度，都會(huì)使透射光信號(hào) 與入射光信號(hào)以同樣的比例增大，吸光度值不會(huì)改變，因此靈敏度不能提高。2、維生素B2在pH=67時(shí)熒光最強(qiáng)，本實(shí)驗(yàn)為何在酸性溶液中測(cè)定？答：因?yàn)榫S生素 B2在堿性溶液中經(jīng)光線照射，會(huì)發(fā)生分解而轉(zhuǎn)