梅魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性研究[精選]

1、 目錄摘要21前言5低值魚(yú)研究意義5肽的概述5生物活性肽簡(jiǎn)介5生物活性肽的吸收機(jī)制5生物活性肽作用概述6自由基概述62實(shí)驗(yàn)材料、試劑、與器材7原料7試劑7主要儀器73實(shí)驗(yàn)方法8中性蛋白酶的配置83.2 羥自由基清除率的測(cè)定8超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定8 dpph自由基清除活性的測(cè)定8 氨基氮的測(cè)定94實(shí)驗(yàn)結(jié)果9中性梅魚(yú)蛋白酶解曲線結(jié)果9單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果10羥自由基的清除作用10對(duì)dpph體系中的自由基清除作用11超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定115實(shí)驗(yàn)結(jié)論12參考文獻(xiàn)14致謝15梅魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化性研究摘要 梅魚(yú)是一種海洋低值的魚(yú)類(lèi)，是浙江海洋捕撈的主要魚(yú)類(lèi)之一。其蛋白質(zhì)的含量非常豐富

2、，但是其蛋白質(zhì)的利用價(jià)值并未得到充分利用和開(kāi)發(fā)。希望通過(guò)研究能更好的了解梅魚(yú)蛋白質(zhì)的抗氧化性，使其充分被利用，提高其產(chǎn)品的價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)主要以小梅魚(yú)為原料，通過(guò)模擬在人體環(huán)境，得到的水解產(chǎn)物，通過(guò)多種分離的手段對(duì)酶解的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，對(duì)她的抗氧化性進(jìn)行了一系列的研究。試驗(yàn)中對(duì)梅魚(yú)多肽的抗氧化性進(jìn)行了體外的研究，其結(jié)果表明，多肽對(duì)dpph有明顯的清楚作用，并表現(xiàn)除了良好的量較關(guān)系。烷基自由基氧化的體系中，mda半數(shù)一直濃度為9.8mg/ml。脂質(zhì)過(guò)氧化體系中，多肽對(duì)亞油酸氧化有明顯的抑制作用。羥基自由基和超氧陰離子氧化體系中，顯負(fù)清除作用。關(guān)鍵詞梅魚(yú)；抗氧化；羥自由基；超氧陰離子；study o

3、n resistance to oxidation of the enzymatic hydrolysate of small miscellaneous fishyu jianfei(food and pharmacy school, medical school, zhejiang ocean university, zhoushan, zhejiang 316002)abstract small miscellaneous fish is a marine low-value fish, it is one of the main fish of zhejiang and fujian

4、marine fishing. its protein content is very rich, but its protein utilization value has not been making full use of and development. hope that through research to better understand small miscellaneous fish protein oxidation resistance, make it be used fully, improve the value of its products.this ex

5、periment mainly small miscellaneous fish as raw material, through simulation in the human body environment, the hydrolysis product, through a variety of separation means of enzymatic hydrolysis product separation and purification, the oxidation resistance of her a series of research.experiments of o

6、xidation resistance of small miscellaneous fish polypeptide in vitro studies, the results showed that peptides has obvious clear effect to dpph, and in addition to the amount of good relations. half alkyl free radical oxidation system, mda concentration is 9.8 mg/ml. lipid peroxide system, polypepti

7、de of linoleic acid oxidation has obvious inhibitory effect. hydroxyl and superoxide anion in the oxidation system, show negative removal effect.keywords small miscellaneous fish; resistance to oxidation; hydroxy radical; superoxide anion 1 前言1.1 低值魚(yú)研究意義隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近些年我國(guó)的海洋漁業(yè)也到推進(jìn)。但是也出現(xiàn)了捕撈強(qiáng)度過(guò)大的情況，造成了對(duì)海洋資

8、源的嚴(yán)重破壞，一些優(yōu)質(zhì)的水產(chǎn)品資源正在不斷的衰弱，數(shù)量不斷地下降，然而低值魚(yú)，比如小雜魚(yú)（包括小梅魚(yú)）的比重處在一個(gè)不斷上升的階段3。這些低值魚(yú)產(chǎn)量每年可以達(dá)到100多萬(wàn)噸，主要的特點(diǎn)是形體比較小，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，蛋白質(zhì)含量較高，往往因?yàn)轭^和內(nèi)臟所占的比例過(guò)大，而被人們忽略其價(jià)值，甚至很少能被直接食用14。這些魚(yú)的生長(zhǎng)周期不想那些優(yōu)質(zhì)的魚(yú)類(lèi)那樣那么長(zhǎng)，所以獲得率較高。但是由于其脂肪、蛋白質(zhì)含量高，非常容易腐爛。目前，國(guó)際水產(chǎn)市場(chǎng)的發(fā)展方向是使水產(chǎn)加工變成綜合型、深加工。低值魚(yú)的價(jià)值也逐漸的到了一些專(zhuān)家學(xué)者的重視2。研究表明，其中所含的脂質(zhì)多為不飽和脂肪酸，具有降血脂，改善心腦血管疾病的作用，其蛋

9、白又都富含人體所需的必需氨基酸，是一種優(yōu)秀的蛋白質(zhì)來(lái)源。其肉質(zhì)的酶解產(chǎn)物具有一定的清除自由基和抗氧化、抗菌作用17。小梅魚(yú)是一種我國(guó)近海捕撈的低值魚(yú)類(lèi)，主要分布在我國(guó)渤海、黃海和東海，主要出產(chǎn)于江蘇、浙江、福建、山東的沿海。以渤海、舟山漁場(chǎng)和江蘇呂四漁場(chǎng)出產(chǎn)最為豐富。小黃魚(yú)體長(zhǎng)而扁側(cè)，呈柳葉形，嘴尖，頭內(nèi)有耳石，背部灰褐色，腹兩側(cè)為黃色，鱗片中等大小，背鰭較長(zhǎng)，中間有起伏，尾鰭雙截形。其肉中富含蛋白質(zhì)，能夠維持身體中鉀鈉的平衡，能消除水腫?？梢蕴岣呷梭w的免疫能力，并具有一定的降血壓能力13，還能改善貧血，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。含有人體所必需的微量元素銅，對(duì)于人體中的血液、中樞神經(jīng)和免疫系統(tǒng)，頭發(fā)、皮膚

10、和骨骼組織以及肝、心等內(nèi)臟的發(fā)育和功能有重要影響5。同時(shí)，其中所含的微量元素硒具有抗氧化的作用，其作用機(jī)理是通過(guò)阻斷身體的過(guò)氧化反應(yīng)而起到抗輻射、延緩衰老的作用。能有效的清除人體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的自由基，能延緩衰老。還可以延緩和抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、擴(kuò)散使癌細(xì)胞退化萎縮，對(duì)各種癌癥有防止功效。1.2 肽的概述1.2.1 生物活性肽簡(jiǎn)介肽是一種介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間的物質(zhì)。氨基酸分子是其基本組成單位，兩個(gè)或以上的氨基酸脫水縮合形成若干個(gè)肽鍵從而組成一個(gè)肽，多個(gè)肽進(jìn)行多級(jí)折疊就組成一個(gè)蛋白質(zhì)分子1。人體中數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的蛋白質(zhì)因?yàn)橛辛穗?，而具有了生理功能和活性。其本身也有非常?qiáng)烈的生物活性。所謂的生物活性肽是

11、氨基酸以不同組成和排列的方式構(gòu)成的線性、環(huán)形結(jié)構(gòu)的不同肽的總稱(chēng)。其具有多種人體代謝和生理調(diào)節(jié)的功能，如抗氧化、促進(jìn)免疫、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂的功效。是目前食品界非常熱門(mén)的研究課題和具有發(fā)展前景的功能因子15。1.2.2 生物活性肽的吸收機(jī)制一般認(rèn)為，蛋白質(zhì)是特異性非常強(qiáng)的大分子，在人體內(nèi)必需被完全的消化降解成氨基酸才可以被吸收和利用2。直接由肽進(jìn)入上皮細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)部被水解的吸收途徑一直出于被忽視的狀態(tài)。但其實(shí)，一百多年前，就已經(jīng)有人提出了由肽直接轉(zhuǎn)運(yùn)的觀點(diǎn)。1959年aagar等首先觀察到腸道能完整地吸收轉(zhuǎn)運(yùn)雙甘肽，此后neway和smith證實(shí)了肽可以被完整轉(zhuǎn)喻吸收的觀點(diǎn)4。研究中

12、表明，蛋白質(zhì)在人體的腸道中并沒(méi)有完全地被水解成小分子的氨基酸，非常大的一部分的小肽和多肽，都是在小腸黏膜刷狀肽酶水解后，以自由氨基的形式進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)19。小肽和游離的氨基酸相比較，吸收的機(jī)制是不同的。小肽的吸收機(jī)制主要是依賴(lài)與h+或者ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)體系，這種轉(zhuǎn)運(yùn)的特點(diǎn)是，能耗比較低，轉(zhuǎn)運(yùn)的速度較快，運(yùn)載體不容易飽和；游離的氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制主要是依賴(lài)于na+的轉(zhuǎn)運(yùn)體系，這種轉(zhuǎn)運(yùn)體系的特點(diǎn)是吸收比較慢，運(yùn)載體容易飽和，同時(shí)消耗的能量比較大。小肽的直接吸收，能夠很好的避免同氨基酸之間的吸收，并且由吸收直接進(jìn)入血液的小肽，相對(duì)于氨基酸能夠更快的被人體所利用。同時(shí)小肽也具有一些游離氨基所不具備的一些功

13、能。如抗菌，降壓，降脂以及抗氧化的功能。1.2.3 生物活性肽作用概述1.2.3.1抑菌作用抗菌肽，又稱(chēng)抗微生物活性肽，在自然界中廣泛分布，原核生物和真核生物中都存在。比較為人所知的是乳酸鏈球菌素。大部分是50個(gè)以下的氨基酸構(gòu)成的6。有親水性和親脂性。作用機(jī)理是親脂性的與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合，親水性的與其體液融合，能使細(xì)菌的細(xì)胞膜被破壞形成小圓孔，是細(xì)胞泄漏，導(dǎo)致生長(zhǎng)受阻或者直接死亡。1.2.3.2 抗氧化及清除自由基的作用近些年來(lái)的大量對(duì)低值魚(yú)的研究表明，魚(yú)肉中的蛋白酶解肽是具有抗氧化性作用的，其抗氧化的能力強(qiáng)度與分子量的大小、氨基酸的組成有著密切的關(guān)系9。有報(bào)道稱(chēng)非常多的氨基酸機(jī)器衍生物都具有抗

14、氧化的能力，比如半胱氨酸、色氨酸、賴(lài)氨酸、纈氨酸、5-羥色氨酸等。有一些研究者認(rèn)為肽的抗氧化能力與它的肽片段中所含的疏水氨基酸有一定關(guān)系，其指出n-端為疏水性氨基酸纈氨酸或者是亮氨酸的時(shí)候，抗氧化的能力較強(qiáng)20。這很可能是因?yàn)槭杷缘陌被峥梢允箍寡趸呐c脂肪酸的互相作用增強(qiáng)，同時(shí)提高了其脂質(zhì)自由基的捕捉能力15。另外，氧化的強(qiáng)弱還與肽中所含的一些可以于自由基反應(yīng)的特殊基團(tuán)有關(guān)系，即所謂的供氫基團(tuán)，只有當(dāng)這些肽具有適當(dāng)分子量的時(shí)候，這些特殊的供氫基團(tuán)才可以得到最大程度的暴露，并與自由基作用，這時(shí)候才具有比較強(qiáng)的抗氧化活性18。運(yùn)用天然抗氧化劑取代合成的抗氧化劑是未來(lái)食品行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)中

15、發(fā)現(xiàn)，魚(yú)蛋白酶解液中分離所得到的一些多肽、短肽，在不同的抗氧化體系中表現(xiàn)出不同的抗氧化能力。肽是一種具有巨大潛力的天然的抗氧化劑資源，從動(dòng)物蛋白酶解液中去找尋新型的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑也將是現(xiàn)代醫(yī)藥、保健行業(yè)、食品行業(yè)的一個(gè)發(fā)展方向。1.3 自由基概述自由基是體內(nèi)氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的有害化合物，具有強(qiáng)氧化性，主要有一下幾個(gè)危害：第一：可以損傷集體的組織和細(xì)胞，削弱細(xì)胞的抵抗能力，是身體容易收到細(xì)菌和病菌的感染；第二：會(huì)產(chǎn)生破壞細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，形成致癌物質(zhì)12；第三：改變細(xì)胞內(nèi)的遺傳信息，干擾細(xì)胞生長(zhǎng)和分化；第四：破壞細(xì)胞膜干擾細(xì)胞的新陳代謝，是細(xì)胞膜喪失保護(hù)細(xì)胞的能力；第五：侵襲細(xì)胞組織及荷爾

16、蒙所必需的氨基酸，干擾體內(nèi)系統(tǒng)的運(yùn)作，導(dǎo)致惡性循環(huán)，以至產(chǎn)生更多的自由基危害全身19；第六：破壞蛋白質(zhì)破壞體內(nèi)的酶，導(dǎo)致炎癥和衰老16。在人體內(nèi)，96-99%的o2產(chǎn)生超氧化陰離子、羥自由基和過(guò)氧化氫，可以使成膜結(jié)構(gòu)喪失其原有的生物學(xué)功能，導(dǎo)致線粒體、dna、rna、生物膜等廣泛損傷，從而引起各種疾病。2 實(shí)驗(yàn)材料、試劑、與器材2.1 原料小梅魚(yú)：購(gòu)于市場(chǎng)2.2 試劑試劑規(guī)格廠家鄰二氮菲中性蛋白酶250g250g硫酸亞鐵2mol/l，50ml無(wú)水乙醇分析純雙氧水分析純鄰苯三酚分析純多肽凍干粉分析純dpph分析純氫氧化鈉 分析純鄰苯二甲酸氫鉀分析純2.3 主要儀器儀器名稱(chēng)廠家電熱恒溫水浴鍋上海醫(yī)

17、療器械五廠分析天平電熱恒溫箱uv-2100可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)電子ph儀磁力攪拌器rc-6 plus高速冷凍離心機(jī)微量移液器3 實(shí)驗(yàn)方法將小梅魚(yú)用水洗凈，去掉頭、內(nèi)臟、魚(yú)骨，集中起來(lái)剁碎，放入燒杯中，加入去離子水，用勻漿機(jī)攪拌，攪拌過(guò)后用ph儀調(diào)節(jié)ph值到7.0，并以2500u/g加入中性蛋白酶，在水浴鍋中酶解112h。酶解結(jié)束后，在100下加熱10min滅酶，用冷凍離心機(jī)在4（10000/min），之后放入-20下保藏備用。3.2 羥自由基清除率的測(cè)定采用鄰二氮菲法，取0.75mmol/l 鄰二氮菲1.0ml，ph7.4 的 pbs 2.0ml，蒸餾水 1.0ml，混合均勻，加入0.75mmo

18、l/l 硫酸亞鐵 1.0ml，0.12% 雙氧水 1.0ml(新鮮配制)，振蕩混勻，記作 ap；以 1.0ml 蒸餾水代替 1.0ml的 0.12% 的雙氧水，其余條件同 ap處理記作 ab；以1.0ml 酶解液代替 1.0ml 蒸餾水，其余條件同 ap處理記作 as。ap、ab、as均在 37水浴鍋中保溫 60min，然后蒸餾水調(diào)零，測(cè)定 536nm 處吸光度，并計(jì)算羥自由基清除率： asap羥自由基清除率/% 100 abap超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定取多肽溶液備用。取鄰苯三酚0.1ml并加入tris-hcl（ph 8.2）緩沖溶液 5 ml于試管中，加入不同濃度的水解液 0.25 m

19、l，迅速混勻，25 水浴保溫 15 min后使用1cm比色皿，以蒸餾水做空白對(duì)照，在320nm處時(shí)測(cè)吸光度ai，并測(cè)定本底扣除水解自身的干擾，水解液對(duì)超氧陰離子自由基清除率按式計(jì)算14。清除率 s=a0-（ai-aj）/a0100% 式中，a0試劑空白的吸光度值；ai樣液的吸光度值；aj樣液本底的吸光度值。 dpph自由基清除活性的測(cè)定稱(chēng)取適量多肽凍干粉溶于10ml 蒸餾水，溶解后分別取1ml至反應(yīng)體系，其中樣品組為1ml dpph+1ml樣品；對(duì)照組 1 為 1ml 95% 乙醇 1ml 樣品；對(duì)照組 2為 1ml 蒸餾水 1ml dpph；調(diào)零組為95% 乙醇?；旌暇鶆?，避光反應(yīng) 30mi

20、n。檢測(cè)各組在波長(zhǎng)535nm 處的吸光度，依次記為 a1、a2、a3，計(jì)算清除率。 a3(a1a2)dpph自由基清除率/%100 a33.5 氨基氮的測(cè)定采用電位滴定法。吸取約20ml含氨基酸的樣品溶液轉(zhuǎn)移至100 ml容量瓶中，加水至標(biāo)線定容，混勻后吸取20.0ml定容液置于200ml燒杯中，加入去離子水60ml，開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器，用0.1mol/l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至酸度計(jì)指示ph值8.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的毫升數(shù)；加入10.0mlph值8.2、40%中性甲醛溶液，混勻，再用上述氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液繼續(xù)滴定至ph值9.2，記錄消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液毫升數(shù)7。同時(shí)取20ml去離子水置于另

21、一200ml潔凈燒杯中，先用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)至酸度計(jì)指示ph值8.2(此時(shí)不計(jì)堿消耗量)，再加入10./l氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至ph值9.2，作為試劑空白，滴定用氫氧化鈉溶液要提前用鄰苯二甲酸氫鉀進(jìn)行濃度標(biāo)定。采用下列公式計(jì)算氨基氮：氨基氮(%)=(vlv2)c0.014/(m20100)100公式中：v1=樣品稀釋再加入甲醛后滴定至終點(diǎn)(ph值9.2)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml)；v2=空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后滴定至終點(diǎn)(ph值9.2)所消耗的氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(ml)；c=氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/l)；0.014=氮的毫摩爾質(zhì)量(g/mm01)；m=測(cè)定用樣品溶液相當(dāng)于樣品

22、的質(zhì)量(g)；水解度(dh)的測(cè)定dh(%)=(已水解的肽鍵數(shù)/原料中總肽鍵數(shù))100=(bc)/(ac)100公式中：a=原料中總氨基氮數(shù)；b=水解液中的氨基氮數(shù)；c=原料游離的氨基氮數(shù)；b和c通過(guò)氨基氮的測(cè)定方法測(cè)定，c也由上述方法測(cè)定完成，用10ml非酶解樣品替代。4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1 中性梅魚(yú)蛋白酶解曲線結(jié)果將的到的蛋白液與中性蛋白酶混合，放入恒溫水浴鍋中，恒溫水浴。從112個(gè)小時(shí)不等。得到的不同水解程度的酶解液，來(lái)研究其抗氧化性。水解程度隨著時(shí)間的增加，逐漸增加，5小時(shí)以后水解程度不再有太大的變化，如圖1?；揪S持在27.12%左右。圖 1水解時(shí)間與水解度關(guān)系曲線解度關(guān)系曲線氨基氮所指

23、的是以氨基酸形式存在的氮元素含量，該指標(biāo)可以反應(yīng)出被測(cè)物質(zhì)的鮮度。該指標(biāo)越高，說(shuō)明被測(cè)物質(zhì)中的氨基酸含量越高，鮮味越好。在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)量中性梅魚(yú)蛋白酶解液中的氨基氮含量來(lái)作為一個(gè)水解程度的判斷。測(cè)定的結(jié)果如圖1。4.2 單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.2.1 羥自由基的清除作用用不同水解程度的蛋白酶水解液對(duì)羥基自由基的清除率進(jìn)行測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)中采用鄰二氮菲-fe2+作為氧化還原指示劑，其原理是其在反應(yīng)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)顏色的變化，從而反映出液體中氧化還原狀態(tài)的改變。在這個(gè)體系中通過(guò)fenton反應(yīng)產(chǎn)生ho，可以使鄰二氮菲-fe2+水溶液被氧化成為鄰二氮菲-fe3+，使得鄰二氮菲-fe2+在536nm處的最大吸

24、收峰消失，通過(guò)這個(gè)來(lái)計(jì)算體系中ho的變化10。羥基自由基產(chǎn)生方程：fe2+h2o2fe3+oh+ ho圖2酶解時(shí)間與羥基自由基清除關(guān)系曲線通過(guò)圖2，可以看到中性的梅魚(yú)蛋白酶解液，對(duì)于羥自由基沒(méi)有表現(xiàn)出良好的清除能力。其中在九小時(shí)前表現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，說(shuō)明在九小時(shí)內(nèi)，水解程度越大，清除羥自由基的能力越強(qiáng)。過(guò)了九小時(shí)之后，清除羥自由基的能力逐漸下降。由圖二可以看出對(duì)羥基自由基的清除作用并不理想4.2.2 對(duì)dpph體系中的自由基清除作用本實(shí)驗(yàn)中用分光光度法來(lái)測(cè)定中性梅魚(yú)蛋白酶解液的dpph清除能力。dpph自由基有機(jī)溶液呈現(xiàn)出紫色，通過(guò)測(cè)量在535nm處的吸光度，來(lái)計(jì)算其清除能力9。這種方法主要是利

25、用自由基清除劑提供的一個(gè)電子與dpph自由基中的孤對(duì)電子配對(duì)，使得自身溶液從紫色變成黃色10。通過(guò)測(cè)量，得到各組在535處的吸光度，通過(guò)計(jì)算得到其dpph自由基清除率。如圖3通過(guò)觀察圖3，可以知道，酶解時(shí)間為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)。水解時(shí)間越長(zhǎng)的中性梅魚(yú)蛋白酶解液，清除的效果越好。當(dāng)酶解的時(shí)間為10h時(shí)，清除效果最佳，溶液中所剩的dpph自由基含量最少。但是dpph自由基的含量總體水平均在85%以上，所以說(shuō)，中性梅魚(yú)蛋白酶解液對(duì)dpph自由基的清除率的效果并不是特別的理想。圖3酶解時(shí)間與dpph自由基清除率關(guān)系曲線4.2.3 超氧陰離子自由基清除活性的測(cè)定超氧陰離子自由基（o-2）是一中活性的

26、氧粒子，是在新陳代謝的過(guò)程中不斷產(chǎn)生的一中中間產(chǎn)物。過(guò)量的超氧陰離子的存在會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生一定的毒害作用，生物體的衰老和病變的發(fā)生，都與這種離子有著直接或間接的關(guān)系。在堿性的條件下，鄰苯三酚會(huì)發(fā)生自身氧化反應(yīng)，會(huì)生成中間產(chǎn)物超氧陰離子自由基以及有色的中間產(chǎn)物13。超氧陰離子又可以促進(jìn)鄰苯三酚的自身氧化，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定中性梅魚(yú)蛋白酶解液對(duì)鄰苯三酚自身氧化的抑制作用11，也就是比較在320nm處的吸光度，經(jīng)過(guò)計(jì)算可以得到清除率。圖4酶解時(shí)間與超氧陰離子清除率的關(guān)系曲線結(jié)果表明中性梅魚(yú)蛋白酶解液對(duì)超氧陰離子的清除作用并不是特別的理想，如圖4。基本維持在20%上下。從相關(guān)的理論上分析，有可能是中性梅魚(yú)蛋白

27、酶解液中含有與鄰苯三酚相似，其分子結(jié)構(gòu)中都存在羥基，超氧陰離子自由基在加速鄰苯三酚自氧化的同時(shí)，也加速了相似物質(zhì)的氧化，從而導(dǎo)致清除的作用不明顯20。5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論酶解時(shí)間（h）羥基自由基清除率dpph清除率超氧陰離子清除率17.8965%2%3%4%5%6%7%8%9%10%11%12%表一酶解時(shí)間與三種自由基清除率的關(guān)系本實(shí)驗(yàn)采用dpph自由基體系、羥基自由基體系、超氧陰離子自由體系來(lái)評(píng)價(jià)梅魚(yú)蛋白酶及產(chǎn)物的抗氧化能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，梅魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物具沒(méi)有良好的抗氧化能力，對(duì)dpph，羥基自由基、超氧陰離子并沒(méi)有表現(xiàn)出良好的清除能力。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，不同水解程度的梅魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物的自由基清除能

28、力也是不同的。在dpph自由基體系中，隨著水解時(shí)間的增加，清除能力稍微減弱了；在羥基自由基的體系中，水解時(shí)間為9h時(shí)，自由基的清除能力達(dá)到最強(qiáng)；在超氧陰離子自由基體系中，在9h表現(xiàn)出最強(qiáng)的清楚效果。從理論上分析的原因之一為可能是由于不同水解度所產(chǎn)生的活性肽產(chǎn)物的同時(shí)，可能也產(chǎn)生了一些其他具有氧化性的一些物質(zhì)，導(dǎo)致與其本身的抗氧化因子反應(yīng)，從而減弱了其抗氧化能力；或者梅魚(yú)蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化能力本身就不具備很強(qiáng)的抗氧化性，或許通過(guò)螯合或者進(jìn)一步處理，能具備較好的抗氧化性17。圖5酶解時(shí)間與三種自由基清除率的關(guān)系 從圖5可以看出，中性梅魚(yú)蛋白酶解液對(duì)超氧陰離子自由基的清除率是最好的，對(duì)羥基自由基的

29、清除率并不是特別好。參考文獻(xiàn)1 范曉,j.水生生物學(xué)報(bào),1999，23（5）4:144145.2 李丹,肖剛等.苦蕎黃銅清除自由基作用的研究j.食品科技,2000(6):6263.3 張燕平.天然蜂膠對(duì)自由基不清除作用j.食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(1):4852. 4 freeman, h. c. and p. l. hoogland, 1956. processing of cod and haddock viscera: 1. laboratory experiments. j. fish res. board can. 13: 869877. 5 hale, m. b., 1969. relative activi