脲酶的測定方法

1、一、脲酶測定(比色法)脲酶是對尿素轉(zhuǎn)化起關(guān)鍵作用的酶，它的酶促反應(yīng)產(chǎn)物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用來表示土壤供氮能力。1、試劑配制：（1） pH6.7檸檬酸鹽溶液：取368g檸檬酸溶于600mL蒸餾水中，另取295g氫氧化鉀溶于水，再將兩種溶液合并，用1N氫氧化鈉將pH調(diào)至6.7，并用水稀釋至2L。（2） 苯酚鈉溶液：稱取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀釋至100mL（A液），保存再冰箱中。稱取27g氫氧化鈉溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B兩液各20mL混和，并用蒸餾水稀釋至100mL備用。（3） 次氯酸鈉溶液：用水稀釋

2、制劑至活性氯的濃度為0.9，（1.9g次氯酸鈉溶于1L水中）溶液穩(wěn)定。（4） 10尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。（5） N的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水稀釋至1L，則得1mL含0.1mgN的標(biāo)液，再將此液稀釋10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。2、操作步驟稱取5土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯處理,加塞塞緊輕搖15;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的檸檬酸鹽緩沖液(6.7),仔細(xì)混勻。在37恒溫箱中培養(yǎng)24。然后用熱至38的蒸餾水稀釋至刻度(甲苯應(yīng)浮在刻度以上),搖蕩,將懸液過濾。取濾液1mL置于50mL容量瓶中,用蒸餾水稀釋至10mL,然后加入4mL

3、苯酚鈉溶液,并立即加入3mL次氯酸鈉溶液，加入每一試劑后,立即將混合物搖勻,20后,將混合物稀釋至刻度,在波長578處測定吸光值。脲酶活性以樣品所得的吸光值減去對照樣品吸光值之差,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出氨態(tài)氮量。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸餾水至20mL，再加4mL苯酚鈉溶液和3mL次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻，20min后顯色，定容。1h內(nèi)再分光光度計(jì)上于578nm處比色。3、結(jié)果計(jì)算以24小時(shí)后1g土壤中NH3N的質(zhì)量（mg）表示脲酶活性（Ure）UreaVn/m式中：a為由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N濃度（mg/mL）；V為顯色液體積（50

4、mL）；n為分取倍數(shù)；m為烘干土重（g）。補(bǔ)充：1) 1h內(nèi)在（青定）酚的藍(lán)色在1h內(nèi)保持穩(wěn)定）在分光光度計(jì)上用1cm液槽，于578nm處將顯色液進(jìn)行比色測定。2) 無土對照：不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。以檢驗(yàn)試劑純度，整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)對照3)無基質(zhì)對照：以等體積的水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同。每個(gè)土樣都設(shè)此對照。過氧化氫酶測定(容量法)過氧化氫酶也叫接觸酶，能促進(jìn)過氧化氫對各種化合物的氧化。幾乎在所有的生物體內(nèi)部有過氧化氫酶，在某些細(xì)菌里，其數(shù)量約為細(xì)胞干重的1。土壤的過氧化氫酶活性，與土壤呼吸強(qiáng)度和土壤微生物活動(dòng)相關(guān)，在一定程度上反映了土壤微生物學(xué)過程的強(qiáng)度。原理過氧化氫酶過氧

5、化氫酶的測定有測壓法和滴定法。測壓法是測定過氧化氫分解時(shí)析出的氧量(反應(yīng)式為： H2O2+H2O O2+H2O，方法簡單，但準(zhǔn)確性較差。后者則是定量滴定酶促反應(yīng)后剩余的過氧化氫量，反應(yīng)式為 2KMnO4+5H2O2+3H2SO42MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2，此法測定結(jié)果較好。試劑(1) 0.3% H2O2：按1：100將30的H2O2用水稀釋。(2) 3N H2SO4（也就是1.5mol/l H2SO4）：以配1000ml為例，需要的濃硫酸的體積為1.5*98.08/1.83=80.39ml，可以取80ml。KMnO4的分子量=158.026,當(dāng)量=31.605.高錳酸鉀水溶液受

6、到水中還原物和雜質(zhì)以及受日光直射等影響能分解析出棕色的含水的二氧化錳沉淀，而有濃度的改變。因此在配制其標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)必須使用棕色瓶盛裝，以防日光直射作用.配制后并應(yīng)放置一段時(shí)間，待與水中還原物完全作用后，濾去沉淀，然后進(jìn)行標(biāo)定，才能得到基本穩(wěn)定不易變化的標(biāo)準(zhǔn)溶液。(3) 0.1N KMnO4溶液：稱取化學(xué)純高錳酸鉀3.161克，溶于l升無CO2蒸餾水（沸水）中，溶解后,在暗處放置一周, 然后用虹吸管將上部澄清溶液移于棕色瓶中(或用玻璃棉濾過)保存，以備標(biāo)定.注：C(1/5 KMnO4)=0.1mol/l表示的就是0.1N KMnO4溶液。0.1N KMnO4溶液標(biāo)定（GB/T601-2002）稱取

7、0.2g（準(zhǔn)至0.0001g）于105110烘至恒重的基準(zhǔn)草酸鈉。溶于100mL（8+92）硫酸溶液中，用配制好的高錳酸鉀溶液c（1/5 KMnO4）=0.1mol/l滴定，近終點(diǎn)時(shí)加熱至65，繼續(xù)滴定至溶液呈粉紅色保持30s，同時(shí)作空白試驗(yàn)（不加草酸鈉，其他一樣）。高錳酸鉀溶液標(biāo)準(zhǔn)濃度按下式計(jì)算c（1/5KMnO4）=m*1000/（V1-V2）*M 式中 c（1/5KMnO4）高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)液之物質(zhì)的量濃度，mol/L； m草酸鈉之質(zhì)量，g； V1滴定草酸鈉消耗的高錳酸鉀溶液之用量，mL； V2空白試驗(yàn)用高錳酸鉀溶液之用量，mL；M草酸鈉的摩爾質(zhì)量的數(shù)值,單位為（g/mol）， M(1/2N

8、a2C2O4)=66.999 或者c（1/5KMnO4）=m/（V1-V2）*0.067000.06700與1.00mL高錳酸鉀溶液c（1/5KMnO4）=0.1mol/l相當(dāng)?shù)囊钥吮硎镜牟菟徕c的質(zhì)量。操作步驟：（1）取2.0 g土，置于100mL（或150ml）三角瓶中，并注入40mL蒸餾水和5mL 0.3H2O2溶液。（B）（2）同時(shí)設(shè)置對照，即三角瓶中注入40mL蒸餾水和5mL 0.3過氧化氫溶液，而不加土樣。（A）（3）將三角瓶放在往返式振蕩機(jī)上120r/min振蕩20min后，加入5mL3N硫酸，以穩(wěn)定未分解的過氧化氫。再將瓶中懸液用慢速濾紙過濾。吸取25mL濾液，用0.1N KMn

9、O4滴定至淡粉紅色終點(diǎn)。結(jié)果計(jì)算用于滴定土壤濾液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為B，用于滴定25mL原始的過氧化氫混合液所消耗的高錳酸鉀量（毫升數(shù)）為A。以20min后1g土壤消耗的0.1N KMnO4溶液的毫升數(shù)表示（以20min后1g土壤中的過氧化氫的毫克數(shù)表示？）。土壤過氧化氫酶活性 =（A-B）T/dwt式中，T為高錳酸鉀滴定度的校正值。 dwt烘干土質(zhì)量（g）滴定度：分析化學(xué) 專屬名詞單 位：g/ml、mg/ml表示符號(hào)：Ts：每毫升標(biāo)準(zhǔn)溶液中所含滴定劑（溶質(zhì)）的克數(shù)。例如：THCl0.001012g/ml的HCl溶液，表示每毫升此溶液含有0.001012g純HCl。Ts/x：指每毫升

10、標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于的待測組分的質(zhì)量。S：代表滴定劑（標(biāo)準(zhǔn)溶液）的化學(xué)式。 X：代表被測物的化學(xué)式。例如：THCl/Na2CO30.005316g/ml HCl溶液，表示每毫升此HCl 溶液相當(dāng)于0.005316g Na2CO3。 例：用T（EDTA/CaO）=0.5mg/ml的EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定含鈣離子的待測溶液，消耗了5ml,則待測溶液中共有CaO 2.5mg。 計(jì)算方法： T=n*M/V或T=C*M土壤蔗糖酶活性測定（3,5- 二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶

11、解所生成的還原糖與3,5- 二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)8%蔗糖，pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.876g Na2HPO42H2O溶于1L蒸餾水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.078g KH2PO4溶于1L蒸餾水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL） 預(yù)先將分析純葡萄糖置80烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象

12、，則應(yīng)棄之，重新配制。 3）3,5- 二硝基水楊酸試劑（DNS試劑） 稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml 2mol/LNaOH和50ml水中，再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml（保存期不過7天）。三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于試管中，再補(bǔ)加蒸餾水至1mL，加DNS試劑1mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min（從試管放入重新沸騰時(shí)算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長508nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤蔗糖酶測定稱取1 g土壤，置于50mL三角瓶

13、中，注入3 ml 8%蔗糖溶液，1 ml pH 5.5磷酸緩沖液和200L甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37下培養(yǎng)24h。到時(shí)取出，迅速過濾。從中吸取濾液1ml，注入50ml容量瓶中，加1ml DNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min，隨即將容量瓶移至自來水流下冷卻3min。溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至7 ml，并在分光光度計(jì)上于508nm處進(jìn)行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個(gè)試驗(yàn)需做無土壤對照；如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h，1g干土

14、生成葡萄糖毫克數(shù)表示。蔗糖酶活性=（a樣品a無土a無基質(zhì)）nma樣品、a無土、a無機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)；n為分取倍數(shù)；土壤多酚氧化酶活力的測定試劑配制 （1） 1%鄰苯三酚溶液 （2） 乙醚（3） 0.5N鹽酸 （4） 重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液0.75g重鉻酸鉀溶于1升0.5N HCl(相當(dāng)于50mI醚中含5mg紫色沒食子素)(5) pH45檸檬酸磷酸緩沖液。1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取重鉻酸鉀標(biāo)準(zhǔn)溶液，用0.5N HCI稀釋成各種不同濃度。定容后，在分光光度計(jì)上于430nm處比色測定。以光密度位為縱坐標(biāo)，以濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2. 投作步驟 取1g土樣(過0.25mm篩)，置

15、于50ml三角瓶中，然后注入10ml 1鄰苯三酚溶液，將瓶內(nèi)含物搖蕩后放在30度恒溫掐小培養(yǎng)2h。取出后加4mlpH 45檸檬酸磷酸緩沖液，再加35ml乙醚，用力搖蕩數(shù)次，萃取30min。最后，將含溶解的紫色沒食子素的著色乙醚相進(jìn)行比色。比色時(shí)用波長為430nm的濾光片。為防止因乙醚引起的誤差，每比色一次用元水乙醇洗滌比色液槽一次。 為了消除土壤中原有的醚溶性有機(jī)物質(zhì)而引起的誤差及校正。沒食子酚的純度，需設(shè)無基質(zhì)的土壤和無土壤的基質(zhì)作對照。在無基質(zhì)的土壤的對照中，用水代替基質(zhì)進(jìn)行培養(yǎng)。 3活性表示 紫色沒食子索的量，根據(jù)用重鉻酸鉀繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線查知。多酚氧化的活性，以2h后1g土壤中紫色沒食子

16、素的毫克數(shù)表示。 纖維素酶活性測定一、試劑：1）醋酸緩沖液（pH 5.5）：164.08 g無水醋酸鈉（C2H3O2Na）溶于700 ml去離子水，用醋酸（C2H4O2）調(diào)節(jié)pH至5.5，用去離子水稀釋至1 L。2）CMC溶液（0.7%，w:v）：7 g羧甲基纖維素鈉鹽溶于1 L醋酸緩沖液，45下攪拌2 h，此溶液在4下可存放7天。3）還原糖試劑：試劑A：16 g無水碳酸鈉（Na2CO3）和0.9 g氰化鉀（KCN）溶于去離子水并稀釋至1 L。 試劑B：0.5 g六氰鐵鉀（K4Fe（CN）6）溶于去離子水并稀釋至1 L，貯于棕色瓶中。試劑C：1.5 g 硫酸鐵銨（NH4SO4Fe2(SO4)2

17、H2O）、1 g十二烷基硫酸鈉（C12H25O4SNa）和4.2 ml濃硫酸溶于50去離子水，冷卻后稀釋至1 L。4）水合葡萄糖溶液：28 mg水合葡萄糖溶于少量去離子水中，并定容至1 L。二、儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱，水浴鍋，分光光度計(jì)，攪拌器，三角瓶三、操作步驟取10.00 g（耕地）或5.00 g（林地）新鮮土壤（2 mm）于100 ml三角瓶中，加15 ml醋酸緩沖液和15 ml CMC溶液，蓋上塞子，于50下培養(yǎng)24 h，過濾。同時(shí)做空白對照，但在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)才加入15 ml CMC溶液，并迅速過濾。取2.00 ml濾液于50 ml容量瓶中，并用去離子水定容至刻度。吸取2.00 ml稀釋液于

18、20 ml試管中，加 2.00 ml還原糖試劑A和2.00 ml還原糖試劑B，蓋緊混勻，在100水浴中加熱15 min 后，立即至于20水中冷卻5 min。加10.00 ml還原糖試劑C，混勻，20下靜置顯色60 min，于690 nm波長處比色測定（要求在30 min內(nèi)完成）。標(biāo)準(zhǔn)曲線：吸取0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml水合葡萄糖溶液，用去離子水稀釋至2 ml，同上加入還原糖試劑A、B、C后，比色測定還原糖含量。c) 空白：無土空白：不加土樣，其余操作與樣品試驗(yàn)相同，整個(gè)試驗(yàn)設(shè)置一個(gè)，重復(fù)一次。無基質(zhì)空白：以等體積水代替基質(zhì)，每個(gè)土樣設(shè)置一個(gè)。四、結(jié)果計(jì)算 土壤纖維素酶活性（gg-1(24 h)-1）(C*V*f)/ dwt式中C為樣品的葡萄糖含量（gml-1）；V為土壤溶液體積（30 ml）；f為稀釋倍數(shù)（25）；dwt為烘干土壤質(zhì)量（g）五、注意事項(xiàng)（1）此方法較適用于林地土壤，耕