夏枯草對草酸結(jié)石小鼠鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響9.1資料

1、夏枯草對草酸結(jié)石小鼠鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響李靜*胡國全 桂敬強(qiáng) 賀紹君 劉德義 陳會良 靳二輝（安徽科技學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院 安徽省鳳陽縣東華路 9號233100）方法用乙摘要：目的 探討夏枯草對草酸結(jié)石小鼠的鈣代謝及腎臟組織結(jié)構(gòu)的影響。二醇和氯化銨誘導(dǎo)結(jié)石，用夏枯草干預(yù)，第28d，測定血清中鈣和磷含量，測定肝臟、右側(cè)腎臟和腦組織勻漿中的鈣含量，左腎用于制作HE染色切片。結(jié)果結(jié)石組腎鈣顯著高于對照組（P0.05）,而夏枯草組腎鈣顯著低于結(jié)石組（P0.05）,與對照組差異不顯著。各組的血清、肝、腦組織勻漿中鈣含量差異均不顯著。結(jié)石組的腎小管腔中分布大量散在的透明草 酸鈣晶體，夏枯草組腎組織未見

2、草酸鈣晶體沉積，且腎小管擴(kuò)張情況明顯緩解。 結(jié)論夏枯 草可減少草酸結(jié)石小鼠的腎鈣含量， 減緩腎小管的擴(kuò)張， 保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)， 可 做為防治草酸結(jié)石的輔助藥物。關(guān)鍵詞：夏枯草；草酸結(jié)石；腎；小鼠中圖分類號：S853.7文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號:Effect of Pruneiia vulgaris L. on Calcium Metabolism and Renal Structure of CalciumOxalate Stones in MiceLI Jing* , Hu Guo-qua n, Gui Jin g-qia ng. He Shao-ju n, Liu De-yi, C

3、hen Hui-lia ng Jin Er-hui (College of Ani mal Scien ce, An hui Science and Tech no logy Uni versity, Fen gya ng. An hui 233100,China)Abstract: Objective To investigate the intervention effect of Prunella vulgaris L. on calcium oxalate stones in mice of calcium metabolism and renal structure. Method

4、The mice with calcium oxalate stone formation were induced by 1% ethylene glycol and 1% ammonium chloride, meanwhile used Prunella vulgaris L. as intervening factors. After 28 days, the calcium and phosphorus content was measured in serum. The content of calcium in liver， right kidney and brain orga

5、 ni zati on homoge nate were detected . Histological sect ion of left kid ney were made HE staining. The calcium content and phosphate content in kidney tissues a was determined.Histological sect ion of kid ney were made HE stai ning.Results That calcium levels in renal tissue收稿日期：基金項目：安徽科技學(xué)院自然科學(xué)研究項

6、目（ZRC2013366 ）;安徽科技學(xué)院重點學(xué)科基金項目（AKXK20101-2）作者簡介：李靜（1979-）,女，黑龍江省齊齊哈爾人，講師，博士。從事中草藥防治結(jié)石疾病方面的研究，Tel: E-mail : lijing3719 。 *李靜為通訊作者。of Oxalate Calcium Stone group was significantly higher than normal control group（ P0.05） ,calcium levels in renal tissue of Prunella vulgaris L. Oxalate Calc

7、ium Stone group was significantly lower than Oxalate Calcium Stone group （ P0.05） , and than normal control group was no significant differences. The content of calcium in liver and brain organization homogenate in each groups was no significant differences. The calcium oxalate stones in renal tubul

8、ar were visible in the Oxalate Calcium Stone group, crystals deposition of calcium oxalate stones inPrunella vulgaris L. group were significantly reduced, significantly reduce renal tubular dilation. Conclusion The Prunella vulgaris L. could reduce the calcium content in renal organization homogenat

9、e, urea nitrogen and creatinine content in the body, and slow the expansion of renal tubular, protection of renal tubular epithelial cell structure in mice of calcium oxalate stones, can be used as supplementary drug in preventing oxalate calcium.2。夏枯3。Keywords: Prunella vulgaris L. ; calcium oxalat

10、e stones; kidney; mice 夏枯草( Prunella vulgaris L. )屬于唇形科夏枯草屬植物，命名取其“夏至后即 枯”之意，藥用部位為干燥果穗，全草也可入藥 1，主要含有三萜及其苷類、甾 醇及其苷類、黃酮類、香豆素、苯丙素、有機(jī)酸、揮發(fā)油及糖類等成分 草在調(diào)節(jié)血壓和血糖，消炎殺菌，抗病毒感染，抑制腫瘤生長方面廣泛應(yīng)用磷代謝的影響，為進(jìn)一步研究Utsunomiya 等首次發(fā)現(xiàn)在體外模擬試驗中夏枯草水提取液能有效抑制草酸鈣 結(jié)晶的形成。夏枯草水提取液和甲醇提取物在體外對草酸鈣結(jié)晶形成均有抑制作 用5，推測其原因可能夏枯草促進(jìn)草酸鈣結(jié)晶的成核作用，但因其促進(jìn)成核和微 結(jié)

11、晶作用， 故而降低了草酸鹽的飽和度， 從而顯著抑制草酸鈣晶體的聚集和生長 6-7。草酸鈣結(jié)石屬中醫(yī)“石淋” 、“砂淋”范疇 8，病因是腎虛濕熱蘊結(jié)于下焦、 久之燒灼尿液中雜質(zhì)結(jié)成砂石 9，夏枯草苦寒，能除濕瀉熱，疏肝解郁，同時夏 枯草利尿作用明顯，提示夏枯草可能成為防治結(jié)石的輔助藥物 10。本試驗采用 1%乙二醇和 1%氯化銨溶液飲水誘導(dǎo)形成草酸鈣結(jié)石模型，測定小鼠血清、肝臟、腎臟、腦組織中鈣、磷的含量，探究夏枯草對草酸結(jié)石小鼠的鈣、 研究夏枯草對草酸結(jié)石小鼠腎小球和腎小管組織結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用， 其藥用價值和開發(fā)防治草酸結(jié)石的藥物提供試驗依據(jù)。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 試驗動物6

12、0 日齡，動物1.43，磷含量由安徽省試驗動物中心提供的SPF級昆明小鼠30只，雄性， 生產(chǎn)許可證號 SCXK(皖)2011-002。試驗鼠顆粒飼料中鈣含量0.87 %。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境溫度 20 C 24 C,濕度50 %65 %，光照12 h13 h。1.1.2 試驗藥品與試劑氯化銨（NH4CI）,滬試生產(chǎn)，批號：F20050621,分析純。乙二醇（C2H6O2）, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：T20110608,分析純。夏枯草，經(jīng)安徽科技學(xué)院食品藥品學(xué)院時維靜教授鑒定為正品，安徽省福春堂中藥飲片有限公 司，產(chǎn)地：湖南，批號： 2011063；圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)的生 化

13、分析試劑盒： 鈣試劑盒， 批號： 142211014；無機(jī)磷試劑盒， 批號： 142411013。 南京建成生物工程研究所生產(chǎn)試劑盒：鈣測定試劑盒，批號：20120413；磷測定試劑盒，批號： 20120418，用于測定組織蛋白的考馬斯亮藍(lán)試劑盒，20120415，乙醇、二甲苯、伊紅、蘇木精等均為國產(chǎn)級分析純。1.1.3 試驗主要儀器設(shè)備Mindray BS 200 全自 電動玻璃勻漿機(jī)； OLYMPUS-CH30 顯微自動煎藥包裝機(jī)，青島達(dá)爾電子機(jī)械銷售有限公司； 動血清生化分析儀；分光光度計；離心機(jī)；高壓蒸汽滅菌器； 漩渦混合儀； IEICA-RM-2128 型切片機(jī)， LY-1 型展片機(jī)

14、； 攝影系統(tǒng)。1.2 試驗方法1.2.1 草酸鈣成石液的配制參考文獻(xiàn) 11 中的建立草酸結(jié)石模型小鼠方法配制草酸鈣成石液：配制比例 為：氯化銨1 g,乙二醇1 mL,用蒸餾水定容到100 mL。1.2.2 夏枯草水煎液的制備將500g的夏枯草放入無紡布煎藥袋中，浸泡入 5 L水中2h，自動煎藥包裝 機(jī)煎煮至沸騰后文火30min,過濾；藥渣再次加入2.5L水，煎煮至沸騰后文火 20min，將兩次濾液混合，濃縮至 250mL,相當(dāng)于2g/mL，高壓蒸汽滅菌，4C 冰箱存放。1.2.3 分組與采樣小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 1w 后，按體重相近原則分為對照組，結(jié)石組和夏枯草組。 結(jié)石組和夏枯草組飲用草酸鈣成石液

15、， 對照組飲用蒸餾水。 小鼠給藥采用灌胃方 式，夏枯草組灌胃夏枯草水提取液lOmL/kg d,對照組和結(jié)石組灌胃相應(yīng)體積的生理鹽水，持續(xù)28d。試驗結(jié)束時，小鼠禁食不禁水過夜，稱重，雙側(cè)眼球 摘除法采血，制備血清，血清中的鈣、磷含量用 Mindray BS 200全自動血清生 化分析儀測定，處死剖殺，取肝臟，腎臟，腦組織，按公式計算腎體比，腎體比（%）=腎臟濕重（g） /宰前活重（g） X100,其中左側(cè)腎臟采用4%中性甲醛固定，石蠟包埋，6卩m切片，HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)，右側(cè)腎臟用于測定組織勻漿中的鈣、磷含量。肝臟，右側(cè)腎臟，腦組織用冰生理鹽水沖洗后制備10%的組織勻漿，用南京建成生物工程

16、研究所生產(chǎn)試劑盒測定鈣含量。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析所有試驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù) 琳準(zhǔn)差（MSD）表示，用spSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行 數(shù)據(jù)分析各數(shù)據(jù)之間的統(tǒng)計學(xué)差異，P0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。2試驗結(jié)果 2.1夏枯草對草酸鈣結(jié)石小鼠體重和腎體比的影響s kidney index in each group表1各組小鼠腎臟指數(shù)的比較組別宰前體重（g）腎體比（%）Gro upweightkidney index對照組27.78 .731.12 .09normal control gro up結(jié)石組30.17 .361.64 .16*Oxalate Calcium Stone group夏枯草組29.81 .

17、161.11 0.14 Pru nella vulgaris L. groupTable 1 The comp aris on of the mice注：與對照組比較 *表示P0.05，*表示P0.01 ;與結(jié)石組比較 表示P0.05，表示P0.01，下同。Note: that compared with the normal control group, * Pv0.05, * Pv0.05, that compared with the Oxalate CalciumStone grou p, P 0.05, P 0.05, the same below.由表1數(shù)據(jù)可顯示，各組小鼠的宰前體

18、重差異均不顯著，結(jié)石組的腎體比極 顯著高于對照組，均數(shù)高0.52%,結(jié)石組的腎體比極顯著高于夏枯草組，均數(shù)高0.51%，而對照組和夏枯草組的腎體比差異不顯著。2.2夏枯草對草酸結(jié)石小鼠血清鈣、磷及肝、腎，腦組織鈣含量的影響表2各組小鼠血清鈣、磷及肝、腎，腦組織鈣含量的比較Table 2 The comp aris on of the mices calcium and phosphorus levels in serum and calciumin liver， kidney and brain organization in each group組別血清 Ca 血清P肝 組 織腎 組 織腦

19、組 織Gro up(mmol/L)(mmol/L )Ca(umol/g prot)Ca(umol/g prot)Ca(umol/g prot)calciump hos phoruscalciumincalciumincalciuminrenal tissuekidneybrain對照組2.04 .112.52 0.2594.48 2.8092.63 2.3346.06 396normal control gro up結(jié)石組2.01 0.303.43 0.48*96.78 5.28103.38 3.38*47.48 1.38Oxalate Calcium Stonegroup夏枯草組1.95 0

20、.172.77 0.6196.82 3.6390.30 .5446.72 直.75Pru nella vulgaris L.group由表2數(shù)據(jù)顯示，各組小鼠血清鈣含量差異均不顯著， 結(jié)石組小鼠血清磷含量顯著高于對照組和夏枯草組(P 0.05)，對照組和夏枯草組的血清磷含量差異不顯著，結(jié)石組小鼠腎組織中鈣含量顯著高于對照組和夏枯草組 (P1-t% - 1 二 A:、“一-此、一 -F23 A化.-F 二宀f J,、 一. I L【P; J .兀- P K.:2 1：；1二-汀、打上5.斗1-圖1對照組腎臟皮質(zhì)(HE , 400X) 圖2對照組腎臟髓質(zhì)(HE , 400X)Fig. 1 Kidn

21、ey cortex in normal control group蠱z 210尹“務(wù)Fig. 2 Kidney medulla in normal control group圖3結(jié)石組腎臟皮質(zhì)(HE , 400X) 圖4結(jié)石組腎臟髓質(zhì)(HE , 400X)Fig. 3 Kidney cortex in Oxalate Calcium Stone group Fig. 4 Kidney medulla in Oxalate Calcium Stone group尹 aIIq - .住H、-Pt/1 L -11】.QI1 曜 _1 H *,_Tiz廠 L匸廠,T匕疔_ r J y_hyL=I /廠

22、汽辭Dt 尹：n；r-V1ri-J圖5夏枯草組腎臟皮質(zhì)(HE , 400X)圖6夏枯草組腎臟髓質(zhì)(HE, 400X)Fig. 5 Kidney cortex inL. intervention groupPru nella vulgarisFig. 6 Kidney medulla in Pru nella vulgaris L. intervention group注：Rc. 腎小球；Pt. Note: Rc. Renal corp uscle; Pt.近曲小管；Dt.遠(yuǎn)曲小管Proximal convoluted tubule; Dt . Distal convoluted tubule;

23、HE病理切片下為無色透明晶體，由圖 1可見正常組小毛細(xì)血管球位于腎小體中央且結(jié)構(gòu)完好， 腎小囊壁層和草酸鈣結(jié)晶在常規(guī) 鼠腎小體斷面接近圓形， 臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，腎小囊的結(jié)構(gòu)和體積大小正常，腎小管排列緊密，近端、遠(yuǎn) 端腎小管組織結(jié)構(gòu)清晰且管腔大小正常， 近曲小管管徑較粗，管腔較小，遠(yuǎn)曲小 管管徑較細(xì)，管腔較大，腔面規(guī)則，細(xì)胞排列緊密，對照組大鼠未見腎小管擴(kuò)張 和草酸鈣晶體沉積， 上皮細(xì)胞排列整齊， 積和囊腔大小正常，無病理變化，圖2可見腎臟髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁 管腔大小正常，細(xì)胞界限明顯。圖3中結(jié)石組小鼠腎小球體 皮質(zhì)部腎組織腫脹，近端腎小管的管壁腫脹變厚，管腔大小 明顯變大，圖4中結(jié)石

24、組未見明顯變化，遠(yuǎn)端腎小管管壁輕微變薄且管腔擴(kuò)張， 部分髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小管和集合管管壁變薄且模糊，細(xì)胞數(shù)量減少，界線不清晰， 細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，上皮細(xì)胞壞死、脫落、變性，細(xì)胞核大部分降解，胞漿減少，排 列不整齊，腎小管腔顯著變大粗，異常擴(kuò)張，管壁細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整，變性、壞死, 腎小管腔內(nèi)有的大量彌漫散布的透明結(jié)晶體， 部分結(jié)晶體形成較大的不規(guī)則四邊 形或六邊形或連成片狀，部分腎小管的管腔內(nèi)可見嗜伊紅樣染色壞死物質(zhì)及部分 腎間質(zhì)有明顯慢性炎性細(xì)胞浸潤，圖5可見夏枯草組腎小球的輕度萎縮，腎小囊 腔變大，腎小囊壁層和臟層細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊，近端腎小管的管壁腫脹輕度腫脹且管 腔縮小，遠(yuǎn)端腎小管管壁變薄且管腔變大，圖

25、6顯示夏枯草組腎髓質(zhì)內(nèi)遠(yuǎn)端腎小 管和集合小管未見異常擴(kuò)張，但部分腎小管管壁變薄，上皮細(xì)胞界限較為清晰，部分腎小管管腔中有紅色絲狀物質(zhì)滲出，未見結(jié)晶體，髓袢細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常。3 討論乙二醇是草酸的前體物質(zhì), 在機(jī)體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為草酸, 從腎臟分泌排泄, 氯化 銨可酸化尿液,具有腎毒作用,可損害腎小管,二者協(xié)同,可形成泌尿系統(tǒng)的草 酸鈣結(jié)晶 12。采用乙二醇配合不同藥物或試劑作誘石劑誘發(fā)大鼠腎草酸鈣結(jié)石 模型,可以篩選、評價防治結(jié)石藥物療效 13 。本試驗中結(jié)石組的腎體比極顯著 高于對照組和夏枯草組, 可能草酸結(jié)石小鼠在氯化銨和乙二醇的刺激作用下, 腎 臟中草酸鈣結(jié)晶沉積及繼發(fā)的機(jī)械性、 阻塞性炎癥使腎臟

26、腫脹增重。 夏枯草組與 對照組腎體比接近, 說明夏枯草可能在減少腎臟中草酸鈣結(jié)晶及緩解腎臟炎癥方 面發(fā)揮一定的作用。機(jī)體內(nèi)鈣的代謝異常是引起含鈣尿路結(jié)石的重要因素之一。 泌尿系結(jié)石產(chǎn)生 是由于體內(nèi)促進(jìn)結(jié)石和抑制結(jié)石的條件失衡所致,其成分以草酸鈣結(jié)晶居多 14-15 ,其形成與體內(nèi)鈣代謝和沉積及草酸代謝有關(guān)。 草酸鈣結(jié)石的形成與高鈣尿 有關(guān),腎臟遠(yuǎn)曲小管和集合管的上皮細(xì)胞受損導(dǎo)致鈣的重吸收障礙, 也可導(dǎo)致腎 小管上皮細(xì)胞的粘附性增加 16 。肖勁逐 17等研究表明,飲用1%乙二醇 +3%NH4Cl 3.0 mL 每天分兩次灌胃 Wistar 健康雄性大鼠, 連續(xù) 4 w 給予一定劑量 的夏枯草不

27、同提取物干預(yù), 結(jié)果顯示各組鈣磷無差異, 夏枯草水溶和夏枯草 50% 甲醇組腎鈣明顯低于草酸鈣結(jié)石模型大鼠結(jié)石組。 本研究的結(jié)果表明各組血清鈣 差異不顯著。 結(jié)石組的腎組織鈣濃度明顯高于正常組和夏枯草組,差異有顯著性意義,可能由于腎組織中形成大量草酸結(jié)晶有關(guān)。 在夏枯草干預(yù)下, 能夠明顯降 低造模后雄性小鼠血鈣和腎組織鈣的濃度, 結(jié)石組血磷升高, 可能是機(jī)體為了保 證血鈣和血磷代謝的平衡, 反饋地增強(qiáng)了腸道對磷吸收的結(jié)果。 各組肝組織、 腦 組織的鈣含量差異均不顯著, 說明尿道結(jié)石主要影響腎鈣的含量, 而不影響其他 臟器組織中鈣的含量影響。 鈣磷代謝受動物品系、 試驗條件等多種因素影響, 夏

28、枯草與鈣代謝的關(guān)系需要進(jìn)一步的驗證和研究。1%氯化銨和 1%乙二醇溶28d,結(jié)石組的腎小管中18。腎組織內(nèi)的晶體沉積乙二醇和氯化銨是制備草酸鈣結(jié)石模型常用藥物， 液給予小鼠自由飲用，可誘導(dǎo)形成草酸結(jié)石，本試驗第 可見大量的草酸結(jié)晶，腎小管擴(kuò)張，與文獻(xiàn)報導(dǎo)一致 受到肝臟將乙二醇等草酸前體轉(zhuǎn)變?yōu)椴菟岬乃俣纫约澳蜮}和草酸的排泄等因素 影響。從本試驗可見夏枯草減少草酸結(jié)石小鼠腎組織中的結(jié)晶， 并有效緩解腎小 管和集合管的擴(kuò)張， 減少腎小管上皮細(xì)胞的損傷， 提示夏枯草可能存在抑制尿草 酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，通過減少結(jié)晶保護(hù)腎臟，減少對腎小管的組織結(jié)構(gòu)的損傷。 腎臟受損與草酸鈣晶體沉積相關(guān)， 夏枯草可能通過吸

29、附于草酸鈣晶體表面的能力 增強(qiáng)，抑制草酸鈣結(jié)晶聚集和生長， 以減緩腎小管細(xì)胞損傷。 體外模擬環(huán)境與體13內(nèi)環(huán)境存在溫度、 pH 值等多種因素差異，體外試驗證明， 0.25mL 夏枯草水提液 對 10mL 人工尿液中的一水草酸鈣結(jié)晶的抑制指數(shù)隨 NaCl 濃度和 pH 值升高逐 漸降低 19 。體外試驗和體內(nèi)試驗，抗草酸結(jié)石作用機(jī)理和途徑可能不同，雖然 體外試驗中夏枯草可顯著抑制草酸結(jié)晶的形成， 提示夏枯草中可能存在抑制尿草 酸鈣結(jié)晶形成物質(zhì)，但其抗草酸結(jié)石的作用機(jī)制有待于進(jìn)一步探討。4 結(jié)論夏枯草水煎煮液能夠降低草酸結(jié)石小鼠腎組織中的鈣含量，但對血清、肝、腦組織勻漿中鈣含量均無顯著差異， 夏枯

30、草能夠減少腎小管內(nèi)草酸鈣結(jié)晶的大小和數(shù)量，減緩草酸結(jié)石小鼠腎小管的擴(kuò)張程度， 可保護(hù)腎臟的組織結(jié)構(gòu)， 在防治草酸鈣結(jié)石中發(fā)揮一定的作用。參考文獻(xiàn)123劉悅 ,宋少江 ,徐綏緒 .夏枯草的化學(xué)成分及生物活性研究進(jìn)展報,2003,20(1):551.崔體圣 ,苗明三 .夏枯草的化學(xué)、藥理及臨床應(yīng)用探討 國家藥典委員會 .中華人民共和國藥典：J. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)J.中醫(yī)學(xué)報，2014,29( 3):386-388.2005 年版一部 M. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2005：197-198.4et al. The effect of kampou medicine on the growth crys

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