化學概論課程論文

1、化學概論課程論文禽流感的起源與發(fā)展、預防與治療鄭文聰201230220229指導教師 周琢強 副教授學院名稱資源環(huán)境學院 專業(yè)名稱1制藥工程論文提交日期2013年6月 24 日 論文答辯日期年 月 日 II 鍵入文字鍵入文字鍵入文字 摘要20世紀90年代以前，禽流感就已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)大規(guī)模的爆發(fā)。禽流感嚴重威脅著世界各國的養(yǎng)禽業(yè)及人類健康。由于禽流感病毒抗原及其致病的易變性以及近年的流行新特點,要求未來的防制措施要采取早日檢測,包括用先進的分子生物學診斷技術進行病毒鑒定、檢疫,加強疫苗免疫預防等,建立全國性禽流感檢測、防控網(wǎng)絡,有效防控高致病力禽流感。關鍵詞: 高致病力禽流感 ; 易變性 ;

2、 流行病學 ; 診斷 ; 防治 目錄摘要. I1禽流感流行的基本狀況 1.1禽流感的危害. 1 1.2 世界各國高致病力禽流感的流行概況. 1 1.3 中國禽流感的流行狀況. 2 2 禽流感的流行病學特征2.1 易感禽類增多.32.2 遷棲水禽傳播病原的可能性增大.3 2.3 水禽成為重要的傳染源和AIV儲存庫. .32.4 AIV的傳播途徑.4 2.5 AIV已經(jīng)突破種間障礙,直接感染哺乳動物.4 2.6 高致病力AIV正在獲得對人類的感染能力,是對人類公共衛(wèi)生的重大威脅因素.4 3 禽流感的結構與作用機理3.1 禽流感病毒的基本特征.5 3.2 AIV的結構組成及功能.6 3.3禽流感病毒

3、致病性相關基因及其分子機制 .8 3.3.1血凝素(Hemagglutinin, HA ).8 3.3.2神經(jīng)氨酸酶( Neuraminidase, NA ) . 93.3.3非結構蛋白(Non-structural Protein, NS ) . 103.3.4基質蛋白(Matrix Proteins, M ) .11 3.3.5核蛋白(Nucleoprotein, NP)及聚合酶(Polymerase) . 12 3.4 禽流感病毒宿主特異的分子基礎 .123.4.1宿主受體. .133.4.2 HA蛋白.133.4.3宿主受體對HA受體特異性的選擇.143.4.4其他分子機制.144 禽

4、流感的預防與治療4.1研制中的流感疫苗. 154.1.1 核酸疫苗.16 4.1.2 減毒活疫苗 .174.1.3 重組載體疫苗. 184.1.4 抗原表位疫苗. .18 4.2 禽流感的主要診斷方法.19結語.206 參考文獻.20 1 禽流感流行的基本狀況1.1禽流感的危害禽流感性感冒(Avianlnfluenza,AI)簡稱禽流感,是由A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病。幾乎所有的家禽和野禽均易感。禽類感染后表現(xiàn)為高致病力禽流感病毒(HPAIV)引起的急性高度致死性疾病和低致病力禽流感病毒(LPAIV)引起的輕度上呼吸道癥狀、產(chǎn)蛋下降等系列綜合癥。歷史上高致病力禽流感的每次大爆發(fā)都給世界養(yǎng)

5、禽業(yè)造成了毀滅性的破壞。禽流感被國際獸醫(yī)局(OIE)定為A類傳染病,并被列入國際生物武器公約動物類傳染病名單。世界范圍內(nèi)流行的高致病力禽流感病毒均屬于H5或H7亞型,病癥的特點是高發(fā)病率、高死亡率,病程短促,甚或導致感染雞群的全群覆滅。同時也不時出現(xiàn)低致病力H5、H7、H9亞型禽流感病毒的廣泛流行,對養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的威脅1.2 世界各國高致病力禽流感的流行概況20世紀90年代以前,爆發(fā)9次禽流感;1959年以來,全世界已爆發(fā)高致病性禽流感39次,90年代后又爆發(fā)30次,特別是2004年亞洲各國禽流感的爆發(fā)更是引起世界的關注,高致病性禽流感發(fā)生頻率加快,次數(shù)增多,范圍擴大,不斷侵襲著整個世界養(yǎng)

6、禽業(yè)。上世紀90年代初之前報道的高致病力禽流感的大爆發(fā)有8次,分別是1959年蘇格蘭的H5NI,1967年英國的H7N3,1975年澳大利亞的H7N7,1979年英國的H5N2,1983年冰島的H5N8, 1983年美國的H5N2, 1985年美國的H7N7,1991年冰島的H5N1。進入90年代以后,國外高致病力禽流感的爆發(fā)頻頻發(fā)生,從1991年10月起,公開報道發(fā)生高致病力禽流感的國家有澳大利亞(H7N3和H7N7),巴基斯坦的(H7N3),墨西哥的(H5N2),意大利的(H7N1),荷蘭的(H7N7) 2003,越南(H5N1) 2004,泰國(H5N1)2004,比利時(H7N7)20

7、03,德國(H7N7)2003,韓國(H5N1)2003,美(H7N?)2004。韓國(H5N1)2004,日本(H5N1)2004,印度尼西亞(H5N1)2004,柬埔塞(H5N1)2004,老撾(H5N1)2004,巴基斯坦(H7N? H9)2004,美國(H7N? H7N2)2004,加拿大(H7N?)2004。1976年以來3,澳大利亞發(fā)生了4次高致病力禽流感,前2次由H7N7引起,后兩次由H7N3引起。1994年巴基斯坦爆發(fā)的高致病力禽流感有220萬只禽受到感染,群體平均發(fā)病率為13.9%86%,發(fā)病群體死亡率51%100%。1994年5月,墨西哥從3個州的雛雞中分離出低致病的H5N

8、2亞型病毒,1995年初爆發(fā)了H5N2亞性高致病力禽流感,臨診特征和剖檢有高致病力禽流感的特征,其病原是由最初的H5N2亞型低致病性禽流感突變而來。1999年,意大利爆發(fā)了H7N1亞型高致病力禽流感,銷毀了1 400萬只家禽,補償農(nóng)戶6 300萬美元,損失6.2億美元。2003年荷蘭禽流感波及比利時和德國。在荷蘭,全國1/4(3 000萬只)的家禽被銷毀;比利時銷毀了270萬只家禽,德國銷毀了40萬只家禽。除了關注已導致禽流感大規(guī)模爆發(fā)流行的H5、H7亞型病毒外,還應密切關注其他亞型具有高致病力特征的禽流感病毒引發(fā)禽流感大爆發(fā)的可能。如1979年在英國的火雞中和1993年在新加坡的鴨中分離到H

9、10禽流感病毒株,其靜脈致病指數(shù)(IVPI)分別為1.56和1.62,完全符合高致病力的特征。1998年在中國分離到的H3N8毒株,其IVIP為1.44,屬高致病力禽流感毒株。1.3 中國禽流感的流行狀況我國的禽流感發(fā)生比較晚,發(fā)病情況遠較歐美等地區(qū)為輕,我國最早報告禽流感的是徐為燕(1980)在南京雞鴨加工廠的外觀健康的鴨群中,隨機采了86只鴨泄殖腔棉拭子進行了檢查,有15例分離出A型流感病毒。1992年陳伯倫等4在廣東省某地雞群中分離出H9亞型的禽流感病毒,陳福勇等(1997)從某雞廠分離出H9N2AIV5。唐秀英等6(1996)從發(fā)病雞群中分離到2株H4N6及3株H9N2病毒;從鵝體內(nèi)分

10、離到3株H5N1病毒,并首次從發(fā)病雞群中分離到一株H14N5禽流感病毒。經(jīng)權威部門致病性測定,3株H5N1鵝體內(nèi)分離毒株為高致力毒株,其余分離株為低致病力毒株。1997年4月,香港流浮山3個雞場的4 800只雞突然死亡,檢驗結果為H5N1禽流感病毒感染;1997年5月21日1名3歲男童死于雷耶氏綜合癥及肺炎合并癥,并從氣管分泌物中分離出一株H5N1禽流感病毒,毒株命名為A/hongkong/156/97(H5N1)。11月、12月分別發(fā)現(xiàn)第2例、第3例、第4例H5N1亞型禽流感病毒感染者,截止1998年2月11日有18人被確診為H5N1亞型禽流感病毒感染發(fā)病,其中6人死亡,12人康復或正在康復

11、,1人視為可疑。這次禽流感的發(fā)生被稱為/香港禽流感事件。在這次事件中,約有150萬只雞、鴨和鵝等被補殺,直接耗資6 000萬港元,用于對養(yǎng)禽業(yè)的補貼達10億港元。這次禽流感給人類造成的災害及對家禽業(yè)造成的損失雖無法與前幾次禽流感大爆發(fā)相比,但卻開創(chuàng)了禽流感直接感染人并致人死亡的先例。2004年1月27日我國廣西自治區(qū)隆安縣宣布發(fā)生高致病性禽流感,至2004年2月19日在不到一個月的時間內(nèi),我國有16個省市自治區(qū),超過40個縣、市(區(qū))報告發(fā)生了高致病性禽流感,經(jīng)國家農(nóng)業(yè)部哈爾賓獸醫(yī)研究所國家禽流感參考實驗室鑒定,為H5N1AIV。(至2004年3月16日,所有49起疫情的疫區(qū)全部解除封鎖)。這

12、次禽流感的爆發(fā)共報告發(fā)病禽只143 084只,捕殺9 016 316只,免疫雞只14 015 884只,所造成的經(jīng)濟損失尚未完全統(tǒng)計。2 禽流感的流行病學特征2.1 易感禽類增多 從禽流感的流行資料分析得知7,8,禽流感病毒可存在于許多家禽及野生禽類,如火雞、雞、珍珠雞、石雞、鵪鶉、鵝和鴨;野雞、野鵝、三趾鷸、赤翻鷸雞、燕鷗、天鵝、鹱、鷺、海鷗、海鸚和鷗。從八哥、長尾小鸚鵡、鸚鵡、白鸚,編織鳥、麻雀和鷹等籠養(yǎng)鳥中也可分離到病毒。2.2 遷棲水禽傳播病原的可能性增大有人發(fā)現(xiàn),遷棲水禽(如:遷棲鴨)產(chǎn)生的病毒比其他禽類多7。1966年,明尼蘇達洲發(fā)生高致病性AI,給當?shù)仞B(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重損失。該地火

13、雞群在每年711月份發(fā)病率最高,此時正是野鳥經(jīng)過該洲南遷及大量火雞在牧場上飼養(yǎng)8。Sle-mons等在俄亥俄州對當?shù)厮菁斑w徙經(jīng)過該州的水禽進行了為期3年的調(diào)查,發(fā)現(xiàn)秋季遷徙鳥中AI感染率平均為5.9% ,19861988年共從水禽中分離出55株AIV,分別屬于23個HA亞型8。Otsuki等,在日本377只天鵝、284只針尾鴨等鳥的899份糞便樣品中分離到5株AIV,其亞型為H3N6、H9N2、H11N3、H13N6。這些鳥類可在中國北部和西伯利亞地區(qū)與日本之間遷徙2004年春12月份發(fā)生在我國華南和東南亞多國的H5N1高致病性禽流感,我國多數(shù)專家認為與遷徙鳥有關,因為從西伯利亞到我國華南、

14、東南沿海有三條遷徙鳥飛行路線。2.3 水禽成為重要的傳染源和AIV儲存庫有研究認為,A型AIV復雜的生態(tài)系統(tǒng)存在于禽類,尤其是水禽8。1952年由wakker等從加拿大商品鴨中分離到AIV以來,迄今世界上許多國家的專家已從家鴨、野鴨和鵝中分離到近30個血清亞型AIV,但是大多數(shù)水禽AIV分離株對鴨、鵝和雞無致病力或致病力較低,過去的教科書和資料記載普遍認為水禽僅是AIV的攜帶者,排毒而不發(fā)病。然而20世紀90年代中期(1996,1999)以來,水禽感染PHAIV發(fā)病和死亡的事實打破了人們對水禽流感的傳統(tǒng)認識)水禽不僅可以自然發(fā)病和死亡,而且是AIV的巨大儲存庫,可橫向傳染陸生禽類而成為發(fā)生流感

15、的傳染來源。有人研究認為水禽的AIV可以在北方冬季寒冷的池塘和湖中越冬,并在第二年再感染飛到該地生活的鳥類。2004年初我國第一起AI疫情就發(fā)生于廣西隆安縣一個養(yǎng)鴨場。2.4 AIV的傳播途徑不少研究認為AI的傳染源為受感染的病禽7,AI感染病禽可以從呼吸道,結膜或糞便中排出病毒,傳播途徑主要為感染禽與易感禽群的直接接觸,或由病禽呼出的氣溶膠或與暴露于病毒污染物(如:鳥類和哺乳動物,飼料,水源,設備,籠具,運輸車輛和昆蟲等)的間接接觸。垂直傳播的證據(jù)很少8。但有證據(jù)表明,實驗感染雞的蛋中有AIV的存在。以H5N2毒株所作人工感染試驗表明,在感染后34 d內(nèi)母雞產(chǎn)的蛋中幾乎都含有病毒。因此,不能

16、完全排除垂直傳播的可能性,污染雞群產(chǎn)的蛋也不能作孵化用。有人發(fā)現(xiàn)水禽的AIV可以傳染給陸生禽,水禽生活的水域中可分離到病毒,并可傳染給豬,因此認為過去宣傳的豬、雞、鴨(鵝)立體養(yǎng)殖或混養(yǎng)易造成AIV的傳播。2.5 AIV已經(jīng)突破種間障礙,直接感染哺乳動物1999年以來,鄧國華9陸續(xù)從廣東,廣西等省分離到一些H5N1亞型AIV,對這些分離株的生物學特性進行了詳細的研究,發(fā)現(xiàn)這些分離株對雞已表現(xiàn)為高致病力,但不具備感染哺乳動物的能力。但是2002年研究我國部分的AIV分離株獲得對小鼠這一動物模型的高度感染性。他們發(fā)現(xiàn)16株病毒中的3株能夠突破小鼠的血腦屏障,可在感染后第3天造成全身感染。因此說明,

17、我國AIV在長期的進化過程中,逐漸獲得了對哺乳動物的感染能力。2004年12月我國華南地區(qū)和東南亞部分國家HPAI的爆發(fā)也證明了這一點,于康震等10指出,從豬體內(nèi)分離到H9N2AIV,泰國的3只家貓感染了H5N2AIV,2004年2月12日泰國一只老虎感染H5N1AIV死亡11。2.6 高致病力AIV正在獲得對人類的感染能力,是對人類公共衛(wèi)生的重大威脅因素 自從人類認識禽流感的一百多年里,人們的基本認識是,AIV是不感染人的。但1997年中國香港禽流感事件中致18人感染6人死亡的事例拉開了禽流感病毒直接感染人的序幕,人們不得不重新認識HPAIV的公共衛(wèi)生意義。2003年2月香港又確診H5N1引

18、起發(fā)病和致人死亡的病例。2003年4月荷蘭H7N7亞型HIV引起了83人感染,導致1名獸醫(yī)死亡; 2004年1 2月越南、泰國H5N1HPAIV感染人和引起人死亡。付朝陽,邢大昌等3認為,禽流感被認為是人流感病毒發(fā)生變異的最大新基因庫,禽流感的爆發(fā)和流行,將增加禽流感病毒與人流感病毒發(fā)生基因重排的機會,增加新流感病毒產(chǎn)生的機率,對人類的健康構成潛在的威脅。他們經(jīng)過對A/HK/156/97病毒株8個片段的序列分析,并分別與人源和禽源流感病毒進行比較,發(fā)現(xiàn)該病毒8個基因片段同源率最高(90.1%98.5%)的毒株均為禽流感病毒,未發(fā)現(xiàn)任何曾經(jīng)在中間宿主中與人流感病毒發(fā)生基因重排的證據(jù),因此確定該病

19、毒來源于禽類。我國大陸雖未發(fā)現(xiàn)AIV感染人的病例,但必須承認AIV在免疫選擇壓力下發(fā)生變異的可能性,必須高度關注已經(jīng)開始或正在感染人的高致病力禽流感病毒亞型的演化動態(tài)。3禽流感的結構與作用機理3.1 禽流感病毒的基本特征禽流感病毒(Avian Influenza virus,AIV)屬于正粘病毒科(Orthomy Xoviridae)流感病毒屬,屬A型禽流感病毒。流感病毒內(nèi)部的核心由單鏈核糖核酸及核蛋白組成,根據(jù)核蛋白(NP)與基質蛋白(MS)的抗原性不同可分為A、B、C三型禽流感病毒。病毒粒子一般為球形,也有桿狀或長絲狀的。病毒粒子核心外有一層脂質囊膜,從囊膜伸出的棒狀纖突稱血凝素(Hema

20、gglutinin,HA),蘑菇狀纖突稱神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase,NA),HA和NA均具有抗原性,根據(jù)H與N的不同可區(qū)分為不同亞型。血凝素可和紅細胞表面的糖蛋白受體結合而發(fā)生凝集現(xiàn)象,具有亞型和株的特異性。神經(jīng)氨酸酶是具有催化活性的四聚體,能將唾液酸從糖蛋白和糖脂中切開,其重要功能是能將吸附在細胞表面的病毒粒子解脫下來。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)禽流感病毒有16種HA和9種NA,根據(jù)HA和NA的不同將禽流感病毒分為許多亞型,目前世界上已分離到上千種AI病毒毒株,分屬100多個亞型,各亞型之間缺少交叉保護作用。引起HPAI的毒株大部分是H5或H7亞型,而大多數(shù)的H5與H7分離株的毒力又是很低的。

21、AIV的抗原性可不斷的發(fā)生變異,常見的變異形式是抗原的漂移(drift)和抗原的轉移(shift)?？乖钠剖怯删幋aHA或NA蛋白的基因發(fā)生點突變引起的,其中HA基因的變異率高?？乖霓D移是HA和NA主要抗原的變化,由于突變幅度較大,導致新的亞型產(chǎn)生。實驗證明,不同亞型的病毒同時感染一個細胞時,病毒基因組可發(fā)生節(jié)段的交換。AIV的基因組有8個RNA片段,從理論上推斷,如果同一個細胞同時感染兩種或以上的AIV,有可能產(chǎn)生256種新的重組病毒。這是容易產(chǎn)生HPAIV毒株的基礎。大量的研究表明,AIV的致病力與HA糖蛋白切割位點上的一組堿性氨基酸有關。HPAIV的這組氨基酸的序列的最小單位為B-X

22、-B-R,其中B為堿性氨基酸精氨酸或賴氨酸,X為非堿性氨基酸,R為精氨酸。病毒與細胞膜的融合需要HA上的切割位點容易受到蛋白酶的切割,而后方可產(chǎn)生融合,從而使病毒基因組穿入細胞漿完成一次感染過程。細胞內(nèi)識別和切割HA糖蛋白的特異蛋白酶在體內(nèi)不同細胞內(nèi)的活力決定了病毒在體內(nèi)的分布。由于H5和H7亞型HPAIV的HA切割位點上存在一系列的堿性氨基酸,細胞內(nèi)的類枯草桿菌堿性蛋白酶使得這種切割更容易產(chǎn)生。由于宿主的大多數(shù)細胞都有這種蛋白酶,所以HA的切割在宿主細胞內(nèi)發(fā)生。由于幾乎所有細胞都能產(chǎn)生切割HPAIV上HA的蛋白酶,故HPAIV再感染下一個細胞時不再需要外源蛋白酶的幫助即可產(chǎn)生感染,這就是HP

23、AIV引起嚴重病癥和高死亡率的原因。而非HPAIV在HA切割位點上僅有單一堿性氨基酸(精氨酸),它只能被類胰蛋白酶所識別,而這種蛋白酶只存在于呼吸道和腸道細胞,所以非HPAIV的復制僅限于這些特定部位,所引發(fā)的病癥也是有限的。3.2 AIV的結構組成及功能AlV的基因組由8個片段組成，按序列大小依次為PB2, PB1 , PA, HA,NP, NA, M和NS，共編碼11種病毒蛋白11,12 ; A型AIV粒子在電鏡下多呈球形，直徑為80-120 nm，部分呈多面形或絲狀13 o A由囊膜和核衣殼組成14囊膜來自宿主細胞的脂膜，包括內(nèi)膜蛋白、類脂和糖蛋白3層;糖蛋白形成2種纖圖，一種是由HA分

24、子的三聚體構成的棒狀纖圖，另一種是由NA分子的四聚體構成的蘑菇狀纖圖15。在病毒囊膜上鑲嵌有以四聚體形式存在的基質蛋白2C matrix protein 2, M2;基質蛋白1 ( matrix protein 1, Ml)在囊膜內(nèi)壁上形成一層包裹在病毒核心外的膜結構，維持病毒形態(tài)16, 17。核衣殼由RNA、核蛋白及3種多聚酶組成，呈對稱的超螺旋結構。AIV每個片段的兩端都有一段保守序列，5末端和3末端的保守序列反向互補形成鍋柄環(huán)狀的二級結構，從而形成病毒RNA聚合酶結合所必需的核普酸識別位點ls，具體結構見圖1.1 圖1.1禽流感病毒結構模式圖AIV粒子由(o. 8-1.1 %的1ZNA,

25、 (5w8)%的碳水化合物、(20w24)%的脂質和(70w 75)%的蛋白質組成;碳水化合物主要包括核糖半乳糖、甘露糖、墨角藻糖和氨基葡糖，在病毒粒子中以糖蛋白或糖脂的形式存在;脂質位于病毒的囊膜內(nèi)，大部分為磷脂，少量為膽固醇糖脂19, 20。由于流感病毒具有多形性，因此不同毒株的化學組成也有一定的差異。 A1V每個基因片斷的5末端和3末端均有高度保守序列，5末端保守序列為13個核普酸:5 GGA ACA AAG AUG Appps , 3末端保守序列為12個核普酸:3 Ho-UCG UUU UCG UCC X210 22;它們分別編碼1 w-2種蛋白質，共編碼11種蛋白:PB2, PBI,

26、 PB1-F2, PA, HA, NP, NA, Ml, M2, NS1和NS2,具體功能見表1.2表1.2禽流感病毒基因組及其編碼蛋白的功能3.3禽流感病毒致病性相關基因及其分子機制 AIV侵入宿主機體后引起疾病的嚴重程度即致病性或表現(xiàn)的病毒毒力是病毒與宿主之間相互作用的結果。一方面取決于病毒本身相關的毒力因子，這些因子主要有HA, NA, PB2, M2, NS 1蛋白;另一方面與宿主本身及其抗病毒狀態(tài)密切相關，二者相輔相成，共同決定了AIV的致病力。3.3.1血凝素(Hemagglutinin, HA ) HA蛋白是由片段4編碼的，約1742-1778 nt，編碼562-566個氨基酸，

27、是構成AIV囊膜纖突的主要蛋白之一，是最重要的保護性抗原，能誘導機體產(chǎn)生亞型特異抗體，在病毒吸附及穿膜過程中起關鍵作用。HA是病毒毒力主要決定因素，而HA前體(HAO )能否有效地被水解為HA 1和HA2兩個亞單位是決定病毒感染性的先決條件(Chen et al., 1998)，故而HAO對蛋白酶切割的敏感性與AIV的毒力呈正相關。如果HA易于被切割，毒株有較高的毒力，反之，則毒力較低。HA前體的裂解的難易程度，主要與HA裂解位點的氨基酸的性質及排列順序、裂解位點附近的糖鏈及感染宿主等密切相關(陳宣爍等，2006;黃淑堅等，2004;曹梅等，2004)。 HA裂解位點的氨基酸的性質、數(shù)目及排列

28、是影響其有效裂解的主要因素。對禽HS和H7亞型高致病性毒株的HA蛋白的氨基酸序列分析表明，高致病力毒株的HA的裂解位點至少由4個堿性氨基酸殘基組成，其序列為R-E-R-R-R-K-K-R,該序列可被分布于宿主全身的多種細胞蛋白酶(如在禽類體內(nèi)廣泛存在的PC6絲氨酸蛋白酶)識別，決定了HPAW在禽體內(nèi)的廣泛嗜細胞性，引起宿主各系統(tǒng)的變化;而低致病力毒株的HA裂解位點含有1-2個堿性氨基酸，其序列呈R-X-X-R/K(X為非堿性氨基酸殘基)，這些毒株只能被一些細胞(主要局限于呼吸道粘膜、消化道粘膜)的蛋白水解酶識別和切割，從而使病毒只能局限在消化道或呼吸道粘膜上皮細胞中增殖，引起局部(呼吸道或消化

29、道)感染(Wood et al., 1993; Vey et al.,1992)。另外，裂解序列的氨基酸可通過插入、缺失或重組等方式，實現(xiàn)LPA IV向HPA IV的轉換。Perdue等(1989)研究發(fā)現(xiàn)，1995年春墨西哥暴發(fā)的HPA I是由1993年底L PA 1V的HA切割位點的氨基酸發(fā)生替換造成的。這一點也可通過反向遺傳技術得到印證(Horimoto et al., 1994; Subbarao et al., 2003 )。3.3.2神經(jīng)氨酸酶( Neuraminidase, NA ) NA是由片段6編碼的含453個氨基酸殘基的多膚，是位于AN囊膜表面的另一種纖突蛋白，屬于II型糖

30、蛋白，即氨基端在囊膜內(nèi)而梭基端在囊膜外。NA的一級結構包括氨基端胞漿尾、非極性跨膜區(qū)、柄部和頭部序列，這些結構各自具有不同的功能(Gong et al., 2007;李向忠等，2005)。NA具有亞型特異性，能誘導機體產(chǎn)生特異性抗體，該抗體及其抑制劑能抑制AIV的復制(Gubareva et al., 2000 )。 NA具有重要的生物學功能。NA具有酶活性，能催化裂解宿主細胞表面的唾液酸殘基，利于子代病毒從宿主細胞表面的釋放，防止病毒聚集，促進病毒穿過覆蓋在呼吸道上皮細胞的瓤液而擴散(Goto et al., 1998 )。另外NA還能能使病毒移動到正確的位點與HA受體結合，提高病毒感染宿主

31、細胞的效率(Suzuki et al.,2005; Ohuchi et al., 2006 )。最近的研究，推測NA還能加速機體內(nèi)IgA的清除，破壞勃膜IgA的生成和介導巨噬細胞對感染流感病毒受體的吞噬作用(McCullers etal., 2003; Watanabe et al., 2004 )，但這些還需進一步研究。 NA柄部的長度與AIV的致病力密切相關。NA的柄部使其頭部遠離病毒囊膜，利于NA活性的發(fā)揮，若柄部較短，NA的活性中心太靠近病毒囊膜，使底物不能進入，不利于子代病毒釋放(李向忠，2005)。研究表明，柄部氨基酸非常不保守，不同亞型和同亞型毒株的差異較大，在62-82間變化，

32、因此，柄部的長短會影響AIV的致病力。通過反向遺傳技術研究表明，在柄部插入氨基酸后可使NA的活性降低20%;當NA柄長在0-52個氨基酸變化時，病毒在組織培養(yǎng)的復制能力無變化，然而在雞胚中，柄部越長，病毒復制越好，NA無莖，則病毒只局限在呼吸器官復制(Castrucci et al., 1993 )。研究表明，NA柄部長度還可平衡HA的功能(Baigentet al., 2001)。 除了NA的柄部外，其他區(qū)域也同樣影響病毒毒力。NA的胞內(nèi)區(qū)雖然不是病毒復制所必須的，但其可影響病毒粒子的組裝和出芽，改變粒子形狀，影響NA蛋白的表達量和穩(wěn)定性，從而影響病毒的毒力。跨膜區(qū)通過影響NA蛋白的輸出而影

33、響病毒粒子的出芽和釋放。而頭部是活性中心，任何一個氨基酸的突變都會影響到NA的活性。總之，NA也是影響AIV毒力的關鍵因子之一。 NA柄部長度對適合培養(yǎng)病毒的組織范圍起決定性作用。Luo等研究發(fā)現(xiàn)，缺失NA柄部的病毒在組織培養(yǎng)中具有活力，但在雞胚接種或滴鼻感染小鼠試驗中沒有活力，故而推測，一定長度的NA柄部是其在雞胚中進行有效復制是必須的。3.3.3非結構蛋白(Non-structural Protein, NS ) AIV片段8編碼NS 1和NS2蛋白，NS 1和NS2大量存在于感染的細胞內(nèi)，NS 1主要在核內(nèi)，NS2主要在胞漿內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，NS 1蛋白是A型流感病毒唯一的非結構蛋白，是一個

34、具有多種活性的調(diào)控因子。NS 1蛋白僅存在于病毒感染的細胞內(nèi)，且在感染的早期，大量存在于細胞核中，而在感染的晚期，NS 1蛋白也可出現(xiàn)于細胞漿中，且能刺激機體產(chǎn)生抗NS1蛋白的抗體(Krug et al., 2003 )。N52又稱為核運輸?shù)鞍?Nuclear export protein, NEP )主要在晚期大量合成，它能與M1蛋白相互作用促進RNP在胞核和胞漿之間的運輸(ONeill et al., 1998; Neumann et al., 2000;Lommer et al., 2002; Iwatsuki et al., 2004)。 NS 1蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，在調(diào)節(jié)流感病

35、毒的致病性及毒力方面發(fā)揮著重要的作用。如果說HA和NA是在AIV感染過程中調(diào)節(jié)其毒力，而NS 1蛋白是在細胞水平上調(diào)節(jié)AIV毒力，決定了AIV對宿主細胞破壞能力。NS 1蛋白從宿主和病毒兩個方面來調(diào)節(jié)病毒的致病性和毒力。在宿主方面，NS 1蛋白可通過抑制宿主細胞蛋白的合成、誘導細胞凋亡以及拮抗干擾素的產(chǎn)生等方式調(diào)節(jié)機體的抗病毒反應，間接地發(fā)揮其增強病毒致病性的功能;另一方面，NS 1蛋白可通過增強病毒mRNA的翻譯來提高病毒的復制，直接增強AIV抵抗宿主的抗病毒反應的能力。 NS 1蛋白通過其RNA結合域和效應區(qū)及個別位點氨基酸的突變或缺失來發(fā)揮其重要功能。3.3.4基質蛋白(Matrix P

36、roteins, M ) AIV片段7可編碼基質蛋白M1和M2M1是病毒顆粒中含量最豐富的蛋白質，是病毒的主要結構蛋白，具有型的特異性，其抗原性的差異是流感病毒分型的依據(jù)之一。X一射線晶體結構表明，M1蛋白能結合病毒RNA和囊膜，具有穩(wěn)定病毒形態(tài)，并對核衣殼的形成具有重要作用(Sha et al., 1997 )。研究表明，M1蛋白能調(diào)節(jié)病毒轉錄酶的活性，還與核糖核蛋白復合體(RNP)相互作用控制轉錄，從而在病毒感染過程中可發(fā)揮一連貫的調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)核糖核蛋白輸出、抑制病毒基因轉錄以及其在病毒出芽過程中所起的關鍵作用。研究證實了M1蛋白可與宿主細胞膜上的蛋白激酶c受體發(fā)生相互作用，催化了M

37、1蛋白的磷酸化，進而在病毒復制及感染中起作用。 M2蛋白只存在于A型流感病毒中，是一種非糖基化的蛋白，由AIV片段7轉錄的第2個小mRNA翻譯。該蛋白以四聚體形式，形成一個質子通道，來調(diào)控高爾基體內(nèi)的pH及酸化病毒粒子內(nèi)環(huán)境(Czabotar et al., 2004;朱建國等，2004;鄭麗舒等，2006;萬春和等，2007)。 M2蛋白具有獨特的調(diào)控病毒毒力的機制。 M2蛋白作為一種離子泵，能降低并維持細胞內(nèi)含體的pH值。當病毒顆粒被細胞攝取而進入內(nèi)涵體時，M2蛋白的離子通道活性增強，使離子進入病毒顆粒內(nèi)，導致pH降低。這樣就使得血凝素( HA)-M 1間的連接鍵被破壞，病毒顆粒打開，使H

38、A環(huán)區(qū)卷曲螺旋，其分子內(nèi)的融合膚移位，使病毒和內(nèi)涵體膜相互靠近并最終發(fā)生融合。當pH降到一定程度時，M2蛋白發(fā)揮活性，終止pH下降，并使HA融合膚段暴露，這樣可使HA與內(nèi)涵體膜融合，并將RNP釋放到胞質中，同時酸性內(nèi)涵體中的H+利用M2離子通道進入病毒顆粒內(nèi)部，導致不同的病毒蛋白發(fā)生解離;M1蛋白的聚集作用被破壞，RNP從M1蛋白復合體上解離，并釋放到細胞質中，并通過轉運到細胞核中，病毒RNA以ATP依賴的形式進入細胞核進行轉錄和翻譯(Duong et al., 2005; Kass etal., 2005; Wu et al., 2005)。3.3.5核蛋白(Nucleoprotein, N

39、P)及聚合酶(Polymerase) NP由AIV片段5編碼，是病毒粒子的主要結構蛋白，具有種群和型特異性。研究表明，NP與病毒的RNA及多聚酶共同裝配成RNP復合體(Marion et al.,1997)，通過NP與RNA、其它病毒蛋白成分(Avalos et al., 1997)及感染細胞上某些大分子之間的相互作用，影響病毒的轉錄、復制、裝配及轉運功能，而病毒的復制與轉錄直接關系到對宿主的侵害，是病毒感染與致病的重要因素(Sidhartha et al.,1998)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在病毒的RNA合成過程中，NP對病毒從轉錄模式轉換成復制模式具有重要的作用，體內(nèi)和體外病毒感染試驗均證明，缺

40、乏可溶性的NP蛋白，病毒不能從轉錄向復制模式轉換(Biswas et al., 1998 )。因此推測，NP蛋白可通過這種模式的轉換來實現(xiàn)其對病毒致病性的調(diào)控。 AIV的聚合酶由PB2, PB1和PA組成，其中PB2能識別來自宿主細胞mRNA的帶帽子結構(7mGpppGpNm)的引物，發(fā)動RNA的轉錄，并在轉錄過程中切除mRNAS，端帽子結構。研究發(fā)現(xiàn)，PB2的627位氨基酸的種類與AIV的致病力相關。若627位為谷氨酸(Glu)，則致病力弱，若為賴氨酸(L ys)則致病力強。因此，在HA裂解序列相同的前提下，PB2的627位單個氨基酸的變化(Glu-Lys)可以使HSN 1 A IV對小鼠的

41、毒力從弱到很強地變化(Hatta et al:, 2001)。近年來，發(fā)現(xiàn)了AIV的第11種功能蛋白，稱為PB 1-F2蛋白，該蛋白是由PB 1+ 1閱讀框編碼的87個氨基酸殘基，也稱為絮膚(Junk peptides)，大量存在于細胞線粒體中。PB 1-F2能誘導細胞凋亡，推測是由于PB 1-F2損害細胞內(nèi)部的線粒體，殺死免疫細胞(單核細胞)，從而使機體無法對流感感染作出反應并抵抗病毒攻擊。PB 1-F2的發(fā)現(xiàn)給流感病毒感染及不同亞型在不同宿主表現(xiàn)的毒力差異提供又一種解釋方式或研究思路(Chen et al., 2001)。3.4禽流感病毒宿主特異的分子基礎 在自然界中，AIV不僅感染禽類，

42、還感染哺乳動物，甚至通過中間宿主(豬)或直接感染人類，但這種感染能力具有局限性，要經(jīng)過變異而獲得對特定宿主的感染力，這說明了AIV具有宿主特異性。這種宿主特異性由病毒和宿主兩方面共同決定的。3.4.1宿主受體 AIV感染細胞的第一關是HA蛋白受體識別并與宿主細胞受體結合，使病毒吸附在細胞表面，并在受體介導下進入細胞內(nèi)繁殖和復制，因此，宿主受體是決定病毒宿主特異性和組織嗜性的決定因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，AN的受體是宿主細胞表面糖蛋白的糖鏈末端的唾液酸殘基。唾液酸主要以2-3或2-6糖昔鍵連接于糖鏈末端的半乳糖基上，不同種屬的動物體，其連接鍵型也不同。研究發(fā)現(xiàn)，禽類胃腸道上皮細胞表面含有唾液酸a 2,

43、3半乳糖的唾液酸寡糖(SAa 2,3Gal );人呼吸道上皮細胞表面主要含有唾液酸a 2,6半乳糖的唾液酸寡糖(SAa 2 ,6Gal );海豹、鯨肺組織上皮細胞表面存在SAa 2,3Gal;豬呼吸道上皮細胞表面兼有SAa 2,3Gal和SAa2,6Gal(蔣露芳等，2005)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)AN優(yōu)先結合于SAa 2,3Gal;人流感病毒則優(yōu)先結合于SAa 2, 6Gal;海豹、鯨流感病毒優(yōu)先識別SAa 2,3Gal;豬流感病毒對SAa2,3Gal和SAa2,6Gal均能結合。這些說明了唾液酸一半乳糖基連接鍵型是決定流感病毒識別受體能力的關鍵因素之一。3.4.2 HA蛋白 HA蛋白能與宿

44、主細胞受體特異性結合，是決定宿主特異性的關鍵因素。病毒的受體結合部位位于頭部，HA 1在此區(qū)折疊而形成小的凹陷，呈淺口袋狀，正適合裝入宿主細胞受體即糖鏈末端的唾液酸分子。研究發(fā)現(xiàn)，HA蛋白受體結合位點及其附近氨基酸的變異決定其對宿主細胞表面唾液酸SAa 2,3Gal和SAa 2,6Gal的受體結合特異性。人與禽流感病毒受體的差異與HA蛋白第226位氨基酸密切相關，若第226位氨基酸殘基為Gln，則具有SAa2,3Gal受體結合特異性，若為Leu則具有SAa2,6Gal受體結合特異性，如果第226位氨基酸殘基為Met，則同時對SAa2,3Ga1和SAa2,6Ga1均具有相同的結合能力。研究發(fā)現(xiàn)，

45、毒株A/Hongkong/156/97 (HSN 1) HA第226位氨基酸為Met，可能是導致該毒株感染人的另一個重要原因。Suzuki等(2001)發(fā)現(xiàn)，HA蛋白第226、228位氨基酸對受體結合特異性很重要，如果僅有第226位氨基酸由Leu置換為Gln，則優(yōu)先識別NeuAca2,3Ga1，而對NeuGca 2,3Ga1識別力低;如果第226位氨基酸由Leu置換為Gln，同時第228位氨基酸Ser置換為Gly，則對NeuAca 2,3Ga1和NeuGca2,3Ga1識別能力相近。Vines等(1998)也發(fā)現(xiàn)，HA蛋白226位Ixu-Gln及228位Ser-Gly，可使人的H3亞型流感病毒

46、感染鴨，并能在鴨腸道繁殖，同時改變其血凝活性。因此，第226位或228位氨基酸的變異可能是流感病毒在不同宿主間傳播的一個重要機制。另外，HA受體連接位點周圍的碳水化合物殘基可以調(diào)節(jié)HA與唾液酸間的親和性(Matrosovich et al., 2000 )。3.4.3宿主受體對HA受體特異性的選擇 研究發(fā)現(xiàn)，所有經(jīng)MDCK細胞培養(yǎng)的人流感病毒表現(xiàn)出嚴格的受體結合特異性，即與SAa2,6Ga1受體強親和力結合，與SAa2,3Ga1受體結合很弱;所有經(jīng)雞胚培養(yǎng)的人類流感病毒對SAa2,3Ga1受體的親和力增加(Gambaryan et al., 1997;1999)。禽流感病毒在豬體內(nèi)的連續(xù)復制，

47、其受體特異性向SAa2,6Ga1轉變，這可能導致AIV獲得與人細胞表面受體有效結合的能力，從而可不需基因重組就能感染人。因此，AIV具有獲得有效結合人細胞表面受體的潛力，這一點值得重視。3.4.4其他分子機制 NA莖部的長度也是決定AIV宿主特異性的因素之一。Matrosovich等(1999)通過對GenBank中不同禽類毒株HA和NA序列比較，發(fā)現(xiàn)NA莖區(qū)氨基酸缺失與HA額外的糖基化位點是H5, H7亞型禽流感一個重要特征，并且可能是AIV從水禽適應到陸禽過程中所必須。Banks等(2001)在對1999年意大利H7N 1亞型HPA IV研究中也發(fā)現(xiàn)，NA蛋白莖區(qū)的第54-75位缺失了22

48、個氨基酸殘基，這可能是導致流感病毒由野水鴨H7N1亞型毒株適應于雞的原因所在。另外，NA亞型在哺乳動物中存在一定的分布規(guī)律，如人、豬流感病毒多為N1, N2，馬流感病毒多為N7, N8，這說明NA對AIV感染宿主也有一定的影響(Horimoto et al., 2001) Scholtissek等認為，NP磷酸化能增強流感病毒的增殖能力，而這種磷酸化是由宿主細胞來完成的，不同的宿主磷酸化能力不同，從而影響了流感病毒感染宿主的范圍。 Subb等(1993)研究發(fā)現(xiàn)，若PB2第627位氨基酸由Glu替換成切s，則AIV獲得了在哺乳動物細胞(如MDCK)增殖能力。同時也發(fā)現(xiàn)，所有AIV的627位氨基

49、酸均為Glu，而所有人流感病毒此位點的氨基酸均為Lys o Amonsin等(2006) 對6例虎一禽流感病毒進行序列分析發(fā)現(xiàn)，PB2蛋白的第627位均被置換為Lys,可能是AIV對宿主選擇而發(fā)生的特異性改變。因而，PB2第627位氨基酸在決定流感病毒的宿主范圍中起著重要作用。另外，AIV的其它基因產(chǎn)物(PB1, PA, M 1,M2, NS1, NS2)在決定宿主特異性方面也可能起作用。許多動物的血清中存在著與HA受體競爭的競爭抑制劑，這也是影響宿主特異性的另一個重要的因素。4禽流感的預防與治療4.1研制中的流感疫苗同其他的病毒性疾病一樣，流感的防治尚無特別有效的方法。當今，接種流感疫苗仍然被認為是預防流感發(fā)生與傳播的最佳方法。而接種疫苗的個體，要看個體本身