Real_timePCR技術(shù)在食物中毒副溶血性弧菌快速檢測中.

1、2010年第10卷第11期論著細菌性食物中毒是常見的突發(fā)公共衛(wèi)生事件，食物中毒事 件病原菌的快速檢測 是疾病預防控制工作的重要內(nèi)容 。實時熒 光定量PCR技術(shù)（Real-time PCR在 PCR反應體系中加入熒 光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR過程，最后通 過標準曲線對未知模板進行定量分析1,具有靈敏度高、特異性強的技術(shù)特點， 近年來在生物因子導致的突發(fā)公共衛(wèi)生事件病原學診斷中得到廣泛應用。將傳統(tǒng)的微生物檢驗技術(shù)與Real-time PCR技術(shù)聯(lián)合應用于病原微生物檢測工 作,有利于分子生物學技術(shù)的實際應用和推廣?，F(xiàn)就一起食物中毒事件處 理中應 用Real-time PCR技術(shù)快速

2、檢測副溶血性弧菌的結(jié)果報告如下。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器M INI OPT ICON 實時熒光定量 PCR儀（美國BIORAD公司；VIT EK 2-COM PACT全自動細菌鑒定藥敏分 析儀及GN細菌生化鑒定卡（法國生物梅 里埃公司。1.1.2培養(yǎng)基及試劑CHROM agar弧菌顯色分離培養(yǎng)基（鄭州安圖公司，營養(yǎng)肉 湯、3.5%氯化鈉堿性胨水、哥倫比亞血瓊 脂平板、革蘭氏染色液（北京陸橋公 司、氧化酶試劑（美國BD公司。副溶血弧菌Real-time PCR檢測試劑盒（廣州中 山達安基因生物公司。以上試劑均在有效期內(nèi)使用。1.1.3樣本來源2008年9月16日23時，接柳州市食源性

3、疾 監(jiān)測哨點醫(yī)院一柳 州市第三人民醫(yī)院報告：柳州鐵路運輸學校 有20多名學生食用同學自北海市家中帶 來的海蝦和貝類后26h發(fā)生惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉癥狀陸續(xù)到該院就診，懷 疑細菌性食物中毒。柳州市疾病預防控制中心突發(fā)事件應急處理小組及時開展了現(xiàn)場流調(diào)，因為沒有剩余食物，未采到食剩的海蝦 貝類,僅對4位住院學生采集肛拭 子送實驗室檢驗食源性致病菌。1.2方法1.2.1樣本處理 根據(jù)流調(diào)結(jié)果和患者發(fā)病前共同進食的食物特點和發(fā)病癥狀，對肛拭子開展副溶血性弧菌檢測。121.1增菌前樣本處理 將肛拭子樣本置3.5%氯化鈉堿性 胨水中用微型振蕩器 振蕩30s洗脫肛拭子上附著糞便樣本與 增菌培養(yǎng)基混勻,從中

4、取約0.5ml置4C冰 箱保存。此為增菌前 樣本液,4份增菌前樣本液編號為080916a、080916b、 080916c、 080916d。1.2.1.2樣本增菌液制備 參照WS/T271-20072分別用3.5%氯化鈉堿性胨水對 樣本增菌6h后制得樣本增菌液，采用Real-time PCR技術(shù)和細菌培養(yǎng)分離與儀器鑒 定試驗技術(shù)同時 進行檢測。4份增菌后的樣本增菌液編號為 080916A、080916B、080916C、080916D。1.2.2Real-time PCR 檢測試驗1.2.2.1核酸提取 取每份增菌前樣本液和樣本增菌液各 50卩加入副溶血弧菌熒 光定量PCR檢驗試劑盒配套的核

5、酸提 取試劑50卩l(xiāng)混勻置100C裂解10min后, 12000轉(zhuǎn)/min分高 速離心5min,取上清液2卩作為模板用于Real-time PCR檢測 副 溶血性弧菌核酸。1.2.2.2Real-time PCR檢測副溶血性弧菌核酸采用M INIReal-time PCR技術(shù)在食物中毒副溶血性弧菌快速檢測中的應用陳柳軍，秦景新,鄒碧,余鈞池,蒙曉輝摘要：目的介紹實時熒光定量PCR(Real-timePCR技術(shù)快速食物中毒檢測的應 用。方法運用Real-time PCR檢驗技術(shù)對增菌前后的食物中毒事件樣本檢測副溶 血性弧菌的保守基因片段。結(jié)果Real-time PCR檢驗技術(shù)對增 菌后的樣本檢測

6、到 的副溶血性弧菌核酸的熒光強度均高于增菌前的樣本，證實樣本增菌后目標菌生長 繁殖,樣本中存 在具有生物學活性感染力的副溶血性弧菌。結(jié)論在食物中毒致病 菌的篩查確證工作中，與傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)相 結(jié)合的Real-time PCR技術(shù)值得應 用和推廣。關(guān)鍵詞:細菌性食物中毒；實時熒光定量PCR ;快速診斷中圖分類號：R155.3+1文獻標識碼:A文章編號：1009-9727(2010 11-1308-02Applicati on of real-time PCR in rapid diag no sis of pathoge ns of food pois oning. CHEN Liu-jun

7、 , QIN Jing-xin , ZOU Bi , et al. (Liuzhou Municipal Center for Disease Con trol a nd Preve ntion , Liuzhou 545007, Gua ngxi , P.R.Chi naAbstract :Aim To in troduce the real -time PCR tech no logy for rapid diag no sis of food pois oning pathoge ns. Methods Real-time PCR tech no logy was employed fo

8、r rapid detect ion food pois oning bacteria before and after bacterium en richme nt and amplificati on of gene fragme nts of Vibrio parahaemolyticus. Results The fluoresce nee in ten sity of real-time PCR tech no logy higher in rapid detect ion of Vibrio parahaemolyticus after bacterium en richme nt

9、 tha n before bacterium en richme nt. Con clusi ons Real-time PCR tech no logy is suiable for rapid diag no sis of food pois oning pathoge ns.Key words :Bacterial food pois oning , Real-time PCR , Pathoge ns , Rapid diag no sis基金項目：廣西衛(wèi)生廳立項課題(項目編號:Z2008383作者單位：柳州市疾病預防控制中心，廣西柳州545007作者簡介:陳柳軍(1966 ,漢族,

10、醫(yī)學學士 ,主管技師,主要從事微生物檢驗和實 驗室管理工作1308中國熱帶醫(yī)學2010年第10卷第11期CHINA TROPICAL M EDICINEVol.10No.11Novem ber 2010OPT ICON實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增和結(jié)果分析處理。據(jù)試劑盒使用說明書設置PCR條件:反應體系為25卩I，其中Real-time PCR反應液17.0卩I , T aq聚合酶3.0卩l(xiāng)模板2.0卩l(xiāng) , ddH 2O 3.0。循環(huán)條件為94C變性3min后，93C 30s , 55C 45s擴增40個循環(huán)。儀器檢測和分析標記熒光。1.2.3細菌培養(yǎng)分離與儀器鑒定試驗1.2.3.1細

11、菌培養(yǎng)分離 取樣本增菌液接種CHROM agar弧菌顯色分離培養(yǎng)基，36.5C培養(yǎng)20h后挑取培養(yǎng)基上紫紅色可疑 目的菌落接種哥倫比亞血瓊脂平板純 培養(yǎng),36.5C培養(yǎng)20h后取平板上培養(yǎng)物做革蘭氏染色鏡檢,同時做氧化酶試驗。1.2.3.2菌懸液制備 分別來自4份樣本的可疑菌落在哥倫比 亞血瓊脂平板上純培養(yǎng) 物革蘭氏染色鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性短小桿菌，氧化酶試驗均為陽性。取培養(yǎng) 物與0.85%NaCI配成0.5麥氏單位菌懸液填充 GN細菌生化鑒定卡,用VIT EK 2 COM PACT全自動細菌鑒定藥敏分析儀檢測鑒定 。2結(jié)果2.1實時熒光定量 PCR檢測結(jié)果 M INI OPT ICON實時

12、熒光 定量PCR儀在上樣2h后對4份增菌前樣本液和4份樣本增菌 液的檢測結(jié)果熒光強度曲線圖均顯示檢出副溶血弧菌DNA，但樣本增菌后的熒光強度明顯高于樣本增菌前（樣本增菌前后Real time PCR檢測結(jié)果熒光強度曲線見圖1 , Ct值則相反,說明樣本增菌后其中 存在的副溶血性弧菌有生長繁殖現(xiàn)象，從而證明樣本中存在具有生物學活性感染力 的副溶血性弧菌。圖14份樣本增菌前后Real time PCR檢測結(jié)果熒光強度曲線2.2細菌培養(yǎng)分離與儀器鑒定試驗結(jié)果 填充菌液后GN細菌生化鑒定卡置VITEK 2 COM PACT全自動細菌鑒定藥敏分 析儀檢測箱中,儀器按程序開展檢測工 作。上機4h后細菌鑒定

13、 儀報告檢測結(jié)果，4份樣本均檢出副溶血性弧菌，%id為 99% （很好的鑒定。2.34份肛拭子檢驗結(jié)果報告：均檢出副溶血性弧菌3討論雖然本次事件調(diào)查沒有剩余食物檢驗結(jié)果的旁證，只有疑似食物中毒患者的肛 拭子樣本檢出副溶血性弧菌，但根據(jù)食物中毒流行病學特點、臨床癥狀、副溶血 性弧菌的生物學特性等，可以判斷該事件是一起食用了副溶血性弧菌污染的海產(chǎn)品 引起的食物中毒。副溶血性弧菌是主要的食源性致病菌之一，其引發(fā)的食物中毒在南方地區(qū)經(jīng)常發(fā)生。傳統(tǒng)的細菌鑒定方法存在中間環(huán)節(jié)多、速度 慢、準確性差、時效性明顯不能滿足檢測快速及時要求的缺陷3,如食品污染副溶血性弧菌檢測鑒定通常需要經(jīng)過增菌、選擇性分離、目的

14、菌純培養(yǎng)、生化 試驗和血清凝集試驗鑒定 確認等步驟，操作繁瑣,耗時一般為57d ,甚至更長時 間。使用全自動細菌鑒定儀檢測鑒定細菌，縮短了生化試驗時間，但該儀器需根據(jù) 細菌革蘭氏染色鏡檢和氧化酶試驗結(jié)果選擇儀器配套生化鑒定卡開展以生化反應結(jié)果為依據(jù)的細菌鑒定工作，無法節(jié)省目的菌分純培養(yǎng)的一系列實驗工作，對食品污 染副溶血性弧菌檢測鑒定約需23d。 Real-time PCR檢驗技術(shù)對食品 污染副溶血 性弧菌的鑒定，由于特殊的檢測工作原理，無需針對細菌純培養(yǎng)物進行鑒定，樣本采 集后34h內(nèi)就能檢測出樣 本是否存在副溶血性弧菌的典型基因片段。但由于PCR技術(shù)主要針對生物因子核酸片段檢測而言，檢測結(jié)

15、果得不到可以進行 活體保 存的病原體開展研究工作4,從而無法確定檢測到的核酸片段是否來源于具有生 物學活性和感染力的病原菌，對于證實感染食源性致病菌引發(fā)食物中毒不能直接舉 證,因此檢驗結(jié)果有時不能作為公共衛(wèi)生突發(fā)事件病原學診斷依據(jù)。為了證實樣本中確實存在具有生物活性感染 力的致病菌，必須將Real-time PCR技術(shù)與傳 統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)相結(jié)合，通過適當 的增菌方式繁殖樣本中的檢測目的菌后，對增菌 前后的樣本同 時運用Real-time PCR技術(shù)檢測目的菌核酸。由于核酸擴增指 數(shù)期 取決于PCR模板的相對量，原始模板越多，達到指數(shù)擴增期所需的擴增循環(huán)周期數(shù) (Ct值越少5,如果目的菌增菌后

16、的 核酸模板在PCR達到指數(shù)循環(huán)時的Ct值低于 增菌前的核酸模板在PCR達到指數(shù)循環(huán)時的Ct值，表明增菌后的核酸原始模板量 高于增菌前的核酸原始模板量，即細菌通過增菌得到增 殖,則可以證實該病原體是具 有生物活性的病原菌。本次食物中毒事件處理，由于流行病學調(diào)查結(jié)果傾向于副溶血性弧菌是導致本 次事件發(fā)生的主要致病微生物，因此實驗室檢測忽略其他食源性致病菌的檢測。在流行病學證據(jù)很難支持判斷引發(fā)事件的病原生物因子范疇時，應加大食源性致病 生物因子的檢測范圍,而Real-time PCR檢測技術(shù)操作手續(xù)簡單、診斷時間耗時 短、靈敏度高、特異性強的先進技術(shù)優(yōu)勢表現(xiàn)更加明顯。因此，在食物中毒致 病菌的篩查確證工作中,與傳統(tǒng)微生物檢驗技術(shù)相結(jié)合的Real-time PCR技術(shù)值得 應用和推廣。參考文獻：1趙煥英，包金鳳實時熒光定量PCR技術(shù)的原理及其應用研究進 展J .中國 組織化