免疫組織化學(xué)技術(shù)進(jìn)展及應(yīng)用

1、 免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫組織化學(xué)技術(shù)是利用抗原與抗體的特異性結(jié)合，并利用酶作用于底物，發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)顯色，借助顯微鏡觀察著色部位，從而鑒定組織或細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和化學(xué)性質(zhì)的技術(shù)?？乖嚎乖菏且活愒诤线m條件下，能激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的效應(yīng)物質(zhì)（包括抗體和效應(yīng)細(xì)胞）在體內(nèi)或體外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。其兩種性能a免疫源性b反應(yīng)源性抗原決定簇抗原決定簇：又稱抗原表位，決定抗原的特異性，是與相應(yīng)抗體或淋巴細(xì)胞抗原識別受體相結(jié)合的部位，是決定和控制抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)?？贵w抗體：機(jī)體受到抗原刺激后，通過體液免疫應(yīng)答，B淋巴細(xì)胞活化、增殖、分化成為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞

2、合成并分泌的僅與該抗原發(fā)生特異性反應(yīng)的球蛋白（凝集素、調(diào)理素、沉淀素）。 抗體大部分位于r區(qū)帶。r球蛋白并非都有抗原活性。免疫球蛋白是包括了抗體和化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體相同或相似，但卻無抗體活性的異常球蛋白 抗原抗體的結(jié)合具有高度的特異性，是物理化學(xué)吸附現(xiàn)象，抗原抗體復(fù)合物在一定的條件下可以解離。 1966年NaKane建立了免疫酶標(biāo)記技術(shù)，之后這門技術(shù)發(fā)展迅速，從直接酶標(biāo)法發(fā)展到間接酶標(biāo)法，在這期間，由于所用標(biāo)記物的不同或標(biāo)記方法的不同，由此衍化出的方法多達(dá)二十種以上。 用以做標(biāo)記的物質(zhì)：生物素、地高辛、膠體金，熒光素、酶、同位素等。其中用于標(biāo)記的酶有辣根酶、堿磷酶、葡萄糖氧化酶等等。 根據(jù)酶標(biāo)記的

3、對象的不同： 直接酶標(biāo)法：將酶直接標(biāo)記在特異性的抗體上。 間接酶標(biāo)法：將酶標(biāo)記在特異性抗體之外的其他參與反應(yīng)的物質(zhì)上。 根據(jù)酶在反應(yīng)過程中扮演的角色不同： 酶標(biāo)抗體法 抗原抗體酶標(biāo)二抗顯色 非標(biāo)記抗體酶法 抗原抗體抗酶抗體酶顯色 如：PAP法、APAAP法 那么，現(xiàn)在又根據(jù)免疫組化方法中是否有生物素的參與，我們又把免疫組化試劑分為生物素檢測系統(tǒng)和非生物素檢測系統(tǒng) 其實(shí)，現(xiàn)在的多數(shù)的免疫組化方法，是多種技術(shù)的有機(jī)的融合，它吸取了各種免疫組化理論基礎(chǔ)的優(yōu)點(diǎn)，使免疫組化技術(shù)更趨向于成熟和穩(wěn)定，更方便于廣泛的運(yùn)用。 作為一個(gè)高水平的技術(shù)員，而不僅僅是一個(gè)操作工，應(yīng)該認(rèn)真學(xué)習(xí)弄通免疫組化技術(shù)的理論和原理

4、，才能在實(shí)際工作中從容應(yīng)對隨時(shí)出現(xiàn)的問題，做到以不變應(yīng)萬變。 到目前為止，最廣泛的用于病理組織學(xué)診斷和臨床科研的免疫組化方法是我們今天重點(diǎn)介紹的SP法和Elivision法,這兩種方法所用的標(biāo)記酶均為過氧化物酶（Peroxidase） 1：SP法 2：Elivision法 主要是利用了生物素（biotin）與鏈霉菌抗生物素蛋白（S-avidin）之間具有的高度的親合力。 生物素和抗生物素蛋白是自然界中具有最強(qiáng)結(jié)合力的物質(zhì)之一，并且它們同時(shí)和抗體或酶交聯(lián)，并不影響它們的生物學(xué)活性。而SP法正是利用了他們的這一特性，同時(shí)，每個(gè)S-avidin分子具有的四個(gè)亞單位，這種特殊的結(jié)構(gòu)使的抗原抗體結(jié)合的信

5、號可以有效的呈多級放大，便于我們的鏡下觀察，有利于我們作出陽性的判斷。這就是我們常說的三步法。 主要操作步驟如下：a) 在組織切片或細(xì)胞片上加入特異性的一抗b) 其次，加入生物素標(biāo)記的二抗c) 隨后，加入與過氧化物酶交聯(lián)的鏈抗生物素蛋白（即所謂的三抗）。最后DAB顯色被檢測抗原特異性一抗生物素化二抗抗生物素蛋白-HRPDAB顯色 是應(yīng)用了多聚物技術(shù)的最新一代免疫組化非生物素檢測系統(tǒng)，它利用高分子葡聚糖或有機(jī)單位小分子直接將二抗的免疫球蛋白與過氧化物酶聯(lián)結(jié)成多聚體形式。使每一個(gè)抗體分子與多個(gè)酶分子相連，直接放大了抗原抗體結(jié)合的信號，替代了傳統(tǒng)SP法中的二抗三抗。這就是所謂的二步法。 主要操作步驟

6、如下：a）在組織切片或細(xì)胞片上加入特異性的一抗b）第二步，加入二抗過氧化物酶多聚體。DAB顯色。特異性一抗被檢測抗原二抗-HRP多聚物DAB顯色 SP三步法的產(chǎn)生和建立遠(yuǎn)早于Elivision二步法，是經(jīng)過多年的實(shí)踐并得到不斷完善的染色方法，它靈敏度高，特異性強(qiáng)，價(jià)格相對低廉，用于病理診斷及科研多年，在各級規(guī)模醫(yī)院中被廣泛應(yīng)用，得到了普遍的認(rèn)可。正是由于這種方法的建立，發(fā)展和壯大了免疫組化技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的運(yùn)用范圍。使免疫組化技術(shù)得以廣泛的普及。 但不可避免的是它也存在著很多的缺點(diǎn)，比如：操作步驟較煩瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長；另一方面，由于它運(yùn)用了生物素-鏈抗生物素蛋白系統(tǒng)，而人體組織中，特別是肝、腎腦

7、等組織中都有較高的內(nèi)源性生物素，加上實(shí)驗(yàn)過程中所必需的抗原修復(fù)也可導(dǎo)致內(nèi)源性生物素的激活，最終使得非特異性的背景著色在某些組織中顯得尤為突出，從而影響結(jié)果的判斷。 而Elivision二步法是90年代中期興起的一種新的免疫組化檢測系統(tǒng)，由于這種方法舍棄了傳統(tǒng)的生物素-抗生物素系統(tǒng)，直接將二抗和過氧化物酶通過載體聯(lián)合，形成一個(gè)同樣可呈多級放大的多聚物，不僅降低了由于內(nèi)源性生物素所導(dǎo)致的背景著色，而且減少了操作步驟，具有簡單、快速、敏感等優(yōu)點(diǎn)，使免疫組化技術(shù)趨向于簡單化、方便化，是免疫組化技術(shù)的又一次飛躍， 更高的敏感度，更好的染色效果逐漸被病理技術(shù)工作者所認(rèn)可。同時(shí)操作的簡單化，減少了煩瑣的操作

8、過程中所帶來的染色結(jié)果的偏差和影響，更有利于免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化。 SP法 靈敏度高，特異性強(qiáng) 信號放大效果好 價(jià)格相對低廉 操作步驟較煩瑣，實(shí)驗(yàn)時(shí)間長 不能防止內(nèi)源性生物素的干擾 Elivision法 靈敏度高，特異性強(qiáng) 信號放大效果好 價(jià)格相對偏高 操作步驟簡單，實(shí)驗(yàn)時(shí)間短 可以防止內(nèi)源性生物素的干擾 隨著免疫組化技術(shù)的不斷普及和發(fā)展，更多的基因蛋白檢測抗體的問世，還有它日益在臨床診斷治療中的廣泛的運(yùn)用，向我們提出了更高的要求，不僅要作到快速準(zhǔn)確，定性定量，還要向高質(zhì)量高標(biāo)準(zhǔn)方向發(fā)展，使免疫組化染色檢測走向更高的質(zhì)量控制階段，提高結(jié)果的可信度、穩(wěn)定性、可重復(fù)性，提高實(shí)驗(yàn)室之間的重現(xiàn)性 。敏

9、度靈 而免疫組化的自動化無疑又將使我們的免疫組化技術(shù)向前發(fā)展一步。由于全封閉自動化控制替代了傳統(tǒng)的手工操作，確保每批染色結(jié)果的一致性和重現(xiàn)性，極大地減少了人工操作中出現(xiàn)誤差的幾率，因此，在不久的將來，它將推動免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。 在常規(guī)的病理診斷中，大多數(shù)病例是可以在普通的HE切片上作出明確的形態(tài)學(xué)診斷的，但也有約5-10%的特殊病例需要應(yīng)用免疫組化染色來解決這一難題，特別是某些病例還需作出詳細(xì)的分型以指導(dǎo)臨床的治療，以及預(yù)后的判斷。 與病理診斷相伴隨的是，更多的基因蛋白檢測抗體的不斷問世，免疫組化技術(shù)在腫瘤及其它疾病的病理、病因等諸多方面的研究也在不斷走向深入，有力地促進(jìn)了各學(xué)科領(lǐng)域的進(jìn)展

10、，在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著不可忽視的作用。 歸納以下幾條： 1：腫瘤良惡性的判斷 2：腫瘤的分類和分型 3：指導(dǎo)腫瘤的臨床治療及預(yù)后判斷 4：顯示組織中的特殊成分 5：病原體的檢測 6：用于腫瘤及其它疾病的組織學(xué)研究。 ER PR CerbB2：ER PR陽性的乳腺腫瘤患者大多對內(nèi)分泌治療有效，緩解率高，復(fù)發(fā)率低，預(yù)后好。即使ER/PR中只有一項(xiàng)陽性的患者，其預(yù)后也好于兩項(xiàng)全陰性的患者。CerbB2基因過度表達(dá)和擴(kuò)增見于多種腫瘤，與腫瘤的分化程度和分級有密切關(guān)系，是腫瘤預(yù)后的參考指標(biāo)，ER PR CerbB2三者同時(shí)陽性表達(dá)的患者進(jìn)行三本氧胺治療無效。ER PR陰性，CerbB2陽性的患者可用基因靶

11、向藥物赫賽汀治療 P53100ER100PR100Her-2100 胃腸道間質(zhì)瘤CD117陽性患者可用基因靶向藥物格列威進(jìn)行治療。 EGFR（上皮生長因子受體）：表達(dá)于多種正常組織，特別是復(fù)層上皮和鱗狀上皮的基底層。乳腺癌病人EGFR的過度表達(dá)，預(yù)示其生存期短，激素療效差。西妥昔作為一種單抗抗腫瘤藥物是EGFR的抑制劑，它可以結(jié)合腫瘤細(xì)胞EGFR位點(diǎn)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖旁路，抑制腫瘤生長并促其凋亡。 VEGF（血管內(nèi)皮生長因子）：在體內(nèi)可誘導(dǎo)血管新生。作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，增加血管通透性。在腫瘤組織的血管形成中發(fā)揮重要作用。與腫瘤的生長，浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 1：組織的前期處

12、理是做好免疫：組織的前期處理是做好免疫組化染色的保證。如固定及時(shí)組化染色的保證。如固定及時(shí)與否、固定充分與否、脫水透與否、固定充分與否、脫水透明過分與否等，這些因素可使明過分與否等，這些因素可使組織結(jié)構(gòu)不清晰，抗原彌散，組織結(jié)構(gòu)不清晰，抗原彌散，造成假陰性或假陽性。脫片。造成假陰性或假陽性。脫片。 2：載玻片需防脫片處理。：載玻片需防脫片處理。 3：切片需：切片需4微米，裱貼牢固，微米，裱貼牢固，沒有氣泡，烤片充分沒有氣泡，烤片充分 4：脫蠟、脫二甲苯以及酒精等：脫蠟、脫二甲苯以及酒精等每一個(gè)步驟，要徹底干凈。每一個(gè)步驟，要徹底干凈。 5：熟悉免疫組化步驟及每一步：熟悉免疫組化步驟及每一步的意義所在的意義所在 6：注意一抗、二抗、所用標(biāo)記：注意一抗、二抗、所用標(biāo)記酶及顯色劑是否相互匹配。酶及顯色劑是否相互匹配。 7：抗體為高濃度的原液時(shí)，有：抗體為高濃度的原液時(shí)，有必要對抗體的稀釋度及反應(yīng)時(shí)必要對抗體的稀釋度及反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行摸索。間進(jìn)行摸索。 8：根據(jù)免疫組化方法的不同，：根據(jù)免疫組化方法的不同，考慮相關(guān)因素的干擾?？紤]相關(guān)因素的干擾。 9：操作過程注意不要干片。：操作過程注意不要干片。 10：滴加抗體特別是一抗時(shí)，：滴加抗體特別是一抗時(shí)，手、眼、心一致，認(rèn)真核對，手、眼、心