單克隆抗體藥物關鍵技術分析

1、單克隆抗體藥物關鍵技術分析1. 高通量的動物細胞表達技術方面，從表達體系來看，近年來，人們不斷發(fā)展和完善了許多抗體分子的表達體系，如：細菌、酵母、昆蟲 細胞、哺乳動物細胞、植物細胞表達系統(tǒng)和體外翻譯系統(tǒng) 等。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)具有活性高、穩(wěn)定性好等重要優(yōu)點，已成為抗體等生物技術產(chǎn)品最重要的系統(tǒng)。2007年銷售額排名前列的6類生物技術藥物中，有 5類是由動物 細胞表達生產(chǎn)（腫瘤治療抗體類、抗TNF-a抗體類、EPO類、B干擾素類、凝血因子類），僅胰島素類藥物是由大 腸桿菌和酵母表達的。歐美國家哺乳動物細胞表達產(chǎn)品種類占60%-70% 市場份額占65%以上。另一方面，從抗體制備規(guī)模、速度和功能來

2、看，高通量抗體制備技術的發(fā)展十分重要。哺乳動物細胞表達生物 技術產(chǎn)品大規(guī)模高效培養(yǎng)技術是生物醫(yī)藥產(chǎn)品主要的生產(chǎn) 方式和關鍵“瓶頸”技術。目前，國際上該項技術發(fā)展較 快，已趨成熟，以默克公司為代表的流加培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達 10,000L以上，以貝爾公司為代表的灌流培養(yǎng)生產(chǎn)規(guī)模達200L以上，蛋白表達濃度為 0.5-2g/L ;我國在該技術領域起步較晚，基礎較差，但近年來經(jīng)過努力，已經(jīng)實現(xiàn)了該 項技術的突破。2. 人源化抗體的構(gòu)建及優(yōu)化技術隨著免疫學和分子生物學技術的發(fā)展以及抗體基因結(jié) 構(gòu)的闡明，DNA重組技術開始用于抗體的改造。抗體藥物已 經(jīng)進入基因工程抗體時代。基因工程抗體具有以下優(yōu)點： 降低人體

3、對異種抗體的排斥反應；減小抗體的分子 量，利于其穿透血管壁，進入病灶的核心部位；根據(jù)需 要，制備新型抗體；采用多種表達方式，大量表達抗體 分子，降低生產(chǎn)成本。(1)表面重塑抗體對鼠抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的 原則是僅替換與人抗體 SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體 活性并兼顧減少異源性基礎上選用與人抗體表面殘基相似 的氨基酸替換；另外，所替換的區(qū)段不應過多，對于影響 側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗 體互補決定區(qū)(CDR構(gòu)象的殘基盡量不替換。我國也已經(jīng) 開始這方面工作的嘗試。(2)重構(gòu)抗體由異源抗體中與抗原結(jié)合相關的殘基與人抗體重新拼 接構(gòu)建的，包括 CDF區(qū)移

4、植，部分 CDR移植和特定決定區(qū) (SDR轉(zhuǎn)移。我國在這方面工作已經(jīng)取得進展，如北京天 廣實，回而生公司都在開展這方面工作。3. 全人源化抗體的構(gòu)建及優(yōu)化技術全人源化抗體即抗體的輕重鏈都是來源于人的抗體， 是治療性抗體的發(fā)展趨勢。目前獲得全人源化抗體方法有 抗體庫篩選技術，如鏈置換、基因工程小鼠制備全人抗 體。目前比較成熟的是抗體庫篩選技術：抗體庫篩選技術 主要包括噬菌體抗體庫、合成抗體庫和核糖體展示技術。(1)噬菌體抗體庫技術1985年，Smith第一次將外源基因插入絲狀噬菌體fl的基因川，使目的基因編碼的多肽以融合蛋白的形式展示 在噬菌體表面，從而創(chuàng)建了噬菌體展示技術。20世紀90年代初，

5、人們認識到了噬菌體展示技術在篩選上的巨大潛 力，并把它應用于基因工程抗體的制備中，建立了噬菌體 抗體庫技術，即用已知抗原從較大的抗體庫中篩選出目的 抗體。該技術在人源性抗體的生產(chǎn)、抗體性能改造和抗體 基因研究等方面具有較大的實用價值。與傳統(tǒng)的雜交瘤技術相比，噬菌體抗體庫技術具有明 顯的優(yōu)越性，即操作簡單、穩(wěn)定有效、篩選容量大、生產(chǎn) 成本低等。(2)核糖體展示技術目前抗體庫技術還受 2方面的因素影響：從未經(jīng)免 疫動物的抗體庫獲得的抗體親和力不高；受外源基因轉(zhuǎn) 化率的限制，抗體庫的庫容不足以涵蓋某種動物的抗體多 樣性。大容量抗體庫是獲得高親和力抗體和針對稀有抗原 抗體的關鍵。核糖體展示技術避開了上

6、述不足，可制備大 容量抗體庫。該技術依賴于 mRNA核糖體和抗體蛋白(或 多肽)通過非共價結(jié)合形成三聯(lián)復合體，在無細胞體系中 完成轉(zhuǎn)錄和翻譯，實現(xiàn)了基因型和表型的偶聯(lián)，翻譯出來 的抗體可用抗原進行篩選，由于不經(jīng)過體內(nèi)轉(zhuǎn)化，構(gòu)建的 抗體庫庫容可達到甚至超過 1011。利用核糖體展示技術可以 獲得特異的、高親和力的抗體。 基因工程小鼠技術基因工程小鼠技術包括人外周血淋巴細胞一嚴重聯(lián)合 免疫缺陷小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠和轉(zhuǎn)染色體小鼠制備人抗體技 術。前者制備人抗體仍存在不少問題，如抗原免疫后難以產(chǎn)生抗體，無靶向性等；后兩者始于 20世紀末，技術難度 較大，但可制備完整分子、高親和力的全人抗體。轉(zhuǎn)基因小鼠技術用于制備全人抗體時，具有功效高、靶親和力強的優(yōu)點。但也存在一些缺陷，即該技術生成的 抗體具有不完全的人序列和鼠糖基化模式。由于轉(zhuǎn)基因小鼠不能攜帶完整人抗體基因，限制了一 系列免疫球蛋白的制備。Tomizuka等首先建立并以染色體為載體成