微生物檢測(cè)手段及注意事項(xiàng)

1、微生物檢測(cè)手段及注意事項(xiàng)微生物的檢測(cè)，無(wú)論在理論研究還是在生產(chǎn)實(shí)踐中都具有重要的意義，本文對(duì)生長(zhǎng)量測(cè)定法、微生物計(jì)數(shù)法、生理指標(biāo)法和商業(yè)化快速微生物檢測(cè)簡(jiǎn)要介紹了利用微生物重量，體積，大小，生理代謝物等指標(biāo)的二十余種常用的檢測(cè)方法，簡(jiǎn)要介紹了這些方法的原理，應(yīng)用范圍和優(yōu)缺點(diǎn)。一個(gè)微生物細(xì)胞在合適的外界條件下，不斷的吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并按自己的代謝方式進(jìn)行新陳代謝。如果同化作用的速度超過(guò)了異化作用，則其原生質(zhì)的總量（重量，體積，大小）就不斷增加，于是出現(xiàn)了個(gè)體的生長(zhǎng)現(xiàn)象。如果這是一種平衡生長(zhǎng)，即各細(xì)胞組分是按恰當(dāng)?shù)谋壤鲩L(zhǎng)時(shí)，則達(dá)到一定程度后就會(huì)發(fā)生繁殖，從而引起個(gè)體數(shù)目的增加，這時(shí)，原有的個(gè)體已經(jīng)

2、發(fā)展成一個(gè)群體。隨著群體中各個(gè)個(gè)體的進(jìn)一步生長(zhǎng)，就引起了這一群體的生長(zhǎng)，這可從其體積、重量、密度或濃度作指標(biāo)來(lái)衡量。微生物的生長(zhǎng)不同于其他生物的生長(zhǎng)，微生物的個(gè)體生長(zhǎng)在科研上有一定困難，通常情況下也沒(méi)有實(shí)際意義。微生物是以量取勝的，因此，微生物的生長(zhǎng)通常指群體的擴(kuò)增。微生物的生長(zhǎng)繁殖是其在內(nèi)外各種環(huán)境因素相互作用下的綜合反映。因此生長(zhǎng)繁殖情況就可作為研究各種生理生化和遺傳等問(wèn)題的重要指標(biāo)，同時(shí)，微生物在生產(chǎn)實(shí)踐上的各種應(yīng)用或是對(duì)致病，霉腐微生物的防治都和他們的生長(zhǎng)抑制緊密相關(guān)。所以有必要介紹一下微生物生長(zhǎng)情況的檢測(cè)方法。既然生長(zhǎng)意味著原生質(zhì)含量的增加，所以測(cè)定的方法也都直接或間接的以次為根據(jù)，

3、而測(cè)定繁殖則都要建立在計(jì)數(shù)這一基礎(chǔ)上。微生物生長(zhǎng)的衡量，可以從其重量，體積，密度，濃度，做指標(biāo)來(lái)進(jìn)行衡量。1.微生物計(jì)量法1.1體積測(cè)量法又稱(chēng)測(cè)菌絲濃度法，通過(guò)測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是，取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10 mL）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如5 min）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有

4、一定偏差。稱(chēng)干重法可用離心或過(guò)濾法測(cè)定。一般干重為濕重的1020%。在離心法中，將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌15次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在105或100下烘干，或采用紅外線烘干，也可在80或40下真空干燥，干燥后稱(chēng)重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在40下進(jìn)行真空干燥。稱(chēng)干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（Activity Dry Yeast, ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。1.3比濁法微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高

5、。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如使用UNICO公司的紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600 nm處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。1.4菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，或是利用一只一端開(kāi)口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開(kāi)口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度

6、，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng)。2.微生物計(jì)數(shù)法2.1血球計(jì)數(shù)板法血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。2.2染色計(jì)數(shù)法為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)

7、數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧?，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。2.3比例計(jì)數(shù)法將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。2.4液體稀釋法對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋?zhuān)鶕?jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（M

8、ost Probable Number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。2.5平板菌落計(jì)數(shù)法這是一種最常用的活菌計(jì)數(shù)法。將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)∫欢w積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9 cm的平板上出現(xiàn)50500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。2.6試劑紙?jiān)?/p>

9、平板計(jì)數(shù)法的基礎(chǔ)上，發(fā)展了小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。2.7膜過(guò)濾法用特殊的濾膜過(guò)濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。3.間接測(cè)定法微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含

10、糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。因此可利用生理指標(biāo)等間接參數(shù)來(lái)測(cè)定生物量。3.1測(cè)定含氮量大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過(guò)氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)?，收集在呼吸?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。3.2測(cè)定含碳量將少量（干重0.22.0 mg）生物材料混入1 mL水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100下加熱30分鐘后

11、冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。還原糖測(cè)定法還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過(guò)還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。3.4氨基氮的測(cè)定離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)

12、數(shù)刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。3.5其他生理物質(zhì)的測(cè)定P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)，都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。4.商業(yè)化快速微生物檢測(cè)法微生物的檢測(cè)，其發(fā)展方向是快速，準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，自動(dòng)化，當(dāng)前很多生物制品公司利用傳統(tǒng)微生物檢測(cè)原理，結(jié)合不

13、同的檢測(cè)方法，設(shè)計(jì)了形式各異的微生物檢測(cè)儀器設(shè)備，正逐步廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)和科學(xué)研究領(lǐng)域。例如：4.1試劑盒，培養(yǎng)基等手段抗干擾培養(yǎng)基和微生物數(shù)量快速檢測(cè)技術(shù)結(jié)合解決了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測(cè)系統(tǒng)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。如：抗干擾微生物培養(yǎng)基，新型生化鑒定管，微生物計(jì)數(shù)卡，環(huán)境質(zhì)量檢測(cè)試劑盒等，可方便的用于多項(xiàng)檢測(cè)。4.2借助新型先進(jìn)儀器BACTOMETER全自動(dòng)各類(lèi)總菌數(shù)及快速細(xì)菌檢測(cè)系統(tǒng)可以數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得監(jiān)測(cè)結(jié)果，樣本顏色及光學(xué)特征都不影響讀數(shù)，對(duì)酵母和霉菌檢測(cè)同樣高度敏感原理是利用電阻抗法（Impedance Technology）將待測(cè)樣本與培養(yǎng)

14、基置于反應(yīng)試劑盒內(nèi)，底部有一對(duì)不銹鋼電極，測(cè)定因微生物生長(zhǎng)而產(chǎn)生阻抗改變。如微生物生長(zhǎng)時(shí)可將培養(yǎng)基中的大分子營(yíng)養(yǎng)物經(jīng)代謝轉(zhuǎn)變?yōu)榛钴S小分子，電阻抗法可測(cè)試這種微弱變化，從而比傳統(tǒng)平板法更快速監(jiān)測(cè)微生物的存在及數(shù)量。測(cè)定項(xiàng)目包括總生菌數(shù)，酵母菌，大腸桿菌群，霉菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。微生物OD值是反映菌體生長(zhǎng)狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)，OD是Optical Density（光密度）的縮寫(xiě)，表示被檢測(cè)物吸收掉的光密度。通常400700 nm都是微生物測(cè)定的范圍，需要紫外分光光度計(jì)測(cè)最大吸收波長(zhǎng)。用得最多的是：505 nm測(cè)菌絲菌體、560 nm測(cè)酵母、600 nm測(cè)細(xì)菌。用測(cè)OD方法

15、畫(huà)微生物生長(zhǎng)曲線時(shí)，同一株菌的起始培養(yǎng)濃度可以準(zhǔn)備多管（根據(jù)檢測(cè)點(diǎn)的需要，如需檢測(cè)10個(gè)點(diǎn)，就準(zhǔn)備10管），然后每個(gè)點(diǎn)取一管出來(lái)測(cè)OD值就行了。一般測(cè)菌體密度的OD的波長(zhǎng)范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經(jīng)屬于可見(jiàn)光區(qū)（200 nm400 nm為紫外光區(qū)，400 nm800 nm為可見(jiàn)光區(qū)）?？瞻兹缬盟觯枰x心洗滌菌體；空白如用不接種的培養(yǎng)基做就不需要洗滌，但是不接種的培養(yǎng)基要和接種的同時(shí)培養(yǎng)以求條件一致，最后注意一般OD值在控制在0.10.4最好，在這個(gè)區(qū)內(nèi)的值就可靠，如果OD大于1.0，一般要稀釋后再測(cè)，因?yàn)镺D太大，分光光度計(jì)的靈敏度就會(huì)顯著降低。一般

16、都測(cè)吸光值，而且最好是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，保持發(fā)酵液或菌體的稀釋倍數(shù)一致，吸光值與稀釋倍數(shù)不一定成正比，可保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)有可比性。且取值的時(shí)候要連續(xù)讀數(shù)，重復(fù)3次的數(shù)最好。另，用分光光度計(jì)測(cè)微生物的OD值為什么要把波長(zhǎng)設(shè)為600 nm這個(gè)波長(zhǎng)其實(shí)只是針對(duì)濁度，而分光光度計(jì)在600 nm處對(duì)濁度的反應(yīng)比較靈敏。測(cè)吸收峰的實(shí)際意義并不大，比如LB搖瓶培養(yǎng)過(guò)夜的大腸桿菌，其實(shí)在400多納米處的吸收最大，但那很可能是培養(yǎng)液的吸收峰。部分發(fā)酵產(chǎn)品配方和工藝(二)纖維素酶菌種：黑曲霉GD-6。種子培養(yǎng)基：麩皮2.0%，葡萄糖3.0%，(NH4)2SO40.15%，pH 5.56.0，2830，培養(yǎng)40 h。發(fā)

17、酵培養(yǎng)基：酵母膏1.0%，蛋白胨0.2%，(NH4)2HPO40.2%，K2HPO40.02%，KH2PO40.08%，MgSO40.09%，pH 5.56.0，2830，培養(yǎng)140 h。黃原膠菌種：黃單孢菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%，酵母粉0.05%，豆粕粉0.02%，無(wú)機(jī)鹽適量。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，罐壓0.5公斤，最高通風(fēng)量1:0.5/分，pH在7.0左右，28,發(fā)酵周期72 h，發(fā)酵液最高粘度14600 mPas左右。蟲(chóng)草多糖發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0%，黃豆餅粉4.0%，酵母膏0.5%，KH2PO40.25%，MgSO40.15%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，

18、攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.5/分，罐壓0.5公斤，培養(yǎng)4572小時(shí)。細(xì)菌纖維素菌種：AcetobacterxylinumNUST4。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.4%，蔗糖2.2%，蛋白胨1.6%，醋酸0.24%，Na2HPO43.5%，KH2PO40.1%，MgSO40.6%，F(xiàn)eSO40.0015%，pH 6.0。Mg2+最適添加量為6 g/L;0.015 g/L Fe2+時(shí)纖維素產(chǎn)量達(dá)最大；添加0.003 g/L煙酸、0.02 g/L生物素和20 mL/L乙醇時(shí)纖維素產(chǎn)量達(dá)9.87 g/L。菌種：木醋桿菌1.1812。發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖5.0%，蛋白胨1.5%，檸檬酸0.2%，Na2HP

19、O40.2%，KH2PO40.2%，MgSO40.03%，乙醇1%。培養(yǎng)條件：pH 6.8，溫度28，培養(yǎng)周期6。細(xì)菌纖維素產(chǎn)量干重為2 g/L。發(fā)酵完畢后過(guò)濾收集粗纖維，再用4% NaOH溶液沖洗，去離子水和0.5%乙酸反復(fù)沖洗，即獲細(xì)菌纖維素。頭孢菌素菌種：頂頭孢霉。種子培養(yǎng)基：玉米漿，蔗糖，葡萄糖，DL-蛋氨酸，豆油，CaCO3，pH 6.56.6。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米漿，淀粉，糊精，蛋氨酸，葡萄糖，豆油，CaCO3，MgSO4，(NH4)2S04，F(xiàn)eSO4，MnSO4，ZnSO4，CuSO4，pH 6.06.1。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，罐壓0.5公斤，最高通風(fēng)量

20、1:1/分，pH在6左右，周期150小時(shí)。螺旋霉素菌種：螺旋霉素鏈霉菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，罐壓0.5公斤，最高通風(fēng)量1:1/分，發(fā)酵周期130小時(shí)左右。根據(jù)螺旋霉素生物合成的研究結(jié)果，短鏈脂肪酸是合成螺旋霉素的前體，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵培養(yǎng)48 h后添加0.5%濃度的乙醇，能夠提高其發(fā)酵效價(jià)10%左右。加入豆油能較大幅度地提高螺旋霉素的發(fā)酵效價(jià)。在培養(yǎng)48 h時(shí)加入較在基礎(chǔ)料中加入更能提高螺旋霉素發(fā)酵效價(jià)，豆油的濃度以1%為好。利福霉素菌種：地中海諾卡氏菌。培養(yǎng)基：葡萄糖10%，液化淀粉2%，黃豆餅粉1%，蛋白胨1%，魚(yú)粉0.5%，各種無(wú)機(jī)鹽適量。發(fā)酵參考環(huán)境：510

21、0噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，罐壓0.5公斤，最高通風(fēng)量1:1/分，發(fā)酵周期130小時(shí)左右。紅霉素菌種：紅色鏈霉菌。培養(yǎng)基A：液化淀粉4%，葡萄糖4%，黃豆餅粉4%，正丙醇1%，無(wú)機(jī)鹽適量。培養(yǎng)基B：黃豆餅粉4，葡萄糖4，淀粉4，糊精2%，CaCO30.6，(NH4)2SO40.15%，KH2PO40.02，NaC1 0.2%，MgSO40.02%。發(fā)酵參考環(huán)境：10100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，最高通風(fēng)量1:1/分，pH自然，28，周期160小時(shí)。潔霉素菌種：鏈霉菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉2.5%，玉米漿0.6%，(NH4)2SO40.5%，NaNO34%，NaCl 0.6%，CaCO30

22、.9%，玉米淀粉2.5%，葡萄糖3%，KH2PO40.07%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.5/分，罐壓0.7公斤，pH 6.57，培養(yǎng)溫度：060 h，31；60130 h，30；130 h至放罐31。發(fā)酵液初期粘度最大到130 mPas，發(fā)酵周期150小時(shí)。土霉素培養(yǎng)基：黃豆餅粉3%，玉米漿0.65%，淀粉8%，(NH4)2SO41.2%，NaCl 0.2%，CaCO31.1%，KH2PO40.015%，每罐外加CoCl2510 g/噸。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.7/分，罐壓0.7公斤。環(huán)孢素培養(yǎng)基：葡萄糖2%，面粉4

23、%，干酪素0.61.2%，NaNO30.15%，KH2PO40.2%，KCl 0.05%，MgSO40.005%，CaCO30.2%。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.7/分，罐壓0.7公斤，pH 6.5，發(fā)酵時(shí)間4天左右，溫度25度左右。其中通氣和培養(yǎng)溫度對(duì)CyA的生物合成量影響非常大。納他霉素菌種：褐黃孢鏈霉菌。培養(yǎng)基：大豆蛋白胨l.8%，酵母粉0.45%，葡萄糖3.6%，pH 7.5。發(fā)酵時(shí)間96 h左右。慶大霉素菌種：慶大小單孢菌。培養(yǎng)基：淀粉4%，玉米粉2%，黃豆餅粉3%，蛋白胨0.3%，(NH4)2SO40.1%，CaCO30.5%，每罐外加CoCl2

24、810 g/噸。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:1/分，罐壓0.5公斤，pH 7.58.0，發(fā)酵周期80小時(shí)。金霉素菌種：金色鏈霉菌。培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：玉米淀粉8.5%，花生粉1.5%，黃豆粉2.5%，淀粉酶(酶活力2000 IU/mL) 0.004%，NaCl 0.25%，(NH4)2SO40.5%，CaCO30.7%，蛋白胨1.0%，酵母粉0.2%，MgSO40.025%，豆油4.0 mL/100mL。在溫度290.5，發(fā)酵培養(yǎng)166 h。小諾霉素菌種:棘孢小單孢種子培養(yǎng)基：黃豆餅粉l.5%，葡萄糖0.1%，玉米粉2%，魚(yú)粉0.2%，淀粉4%，pH 7.5。發(fā)酵

25、培養(yǎng)基：葡萄糖0.5%，淀粉4%，玉米粉1.5%，熱榨黃豆餅粉2.5%，蛋白胨0.2%，硫酸銨0.05%，pH7.2。四環(huán)素培養(yǎng)基主要成分：液化淀粉，玉米漿，黃豆粉，KH2PO4，每罐外加二巰基苯并噻唑和NaBr。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速140轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.7/分，罐壓0.7公斤，pH 6.0左右。部分發(fā)酵產(chǎn)品配方和工藝(一)赤霉素發(fā)酵1060噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速115轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:1/分，培養(yǎng)溫度大多采用2932。培養(yǎng)基的起始pH值控制在5.5左右，而將發(fā)酵過(guò)程的pH值維持在3.54.5之間為宜。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，豆餅粉1.5%，淀粉1.0%，KH2PO40.1%

26、，(NH4)2SO40.05%，MgSO40.1%，自然pH值。發(fā)酵培養(yǎng)基：豆餅粉0.9%淀粉7.0%，葡萄糖1.0%，KH2PO40.15%，MgSO40.08%，-淀粉酶0.003%，pH 5.05.5發(fā)酵周期130小時(shí)阿維菌素：種子培養(yǎng)基：淀粉3.0%，豆餅粉2.0%，酵母粉0.2%，CoCl26H2O 0.5 ppm，pH 7.07.2。發(fā)酵培養(yǎng)基：淀粉5.0%，玉米粉l.0%，酵母粉l.0%，豆餅粉1.0%，CaCO30.2%，CoCl26H2O 0.5 ppm，pH 7.07.2。妥布霉素發(fā)酵菌種：黑暗鏈霉菌。發(fā)酵培養(yǎng)基：黃豆餅粉2.5%，葡萄糖1.0%，玉米粉1.0%，玉米淀粉1

27、.5%，(NH4)2SO40.5%，魚(yú)粉0.4%；MgS040.6%，油1.0%，ZnSO40.05%，CaCO30.6%，溫度37，發(fā)酵時(shí)間112 h左右。氫化可的松 菌種：藍(lán)色犁頭霉(AS365) 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖1.0%，酵母浸膏0.23%，玉米漿1.5%，硫酸銨0.5%，pH 6.46.5。28培養(yǎng)24 h，投入0.25%的RSA（醋酯化合物：17-羥基孕甾-4-烯-3,20-二酮-21-醋酸酯，RSA），轉(zhuǎn)化3642 h。寧南霉素菌種：諾爾斯鏈霉菌西昌變種孢子斜面培養(yǎng)基：可溶性淀粉2%，蔗糖1.0%，硝酸鉀1.0%，K2HPO40.5%，MgSO40.5%，NaCl 0.5%，Ca

28、CO30.5%，硫酸亞鐵0.01%，瓊脂2.0%，滅菌前pH 7.27.4。種子培養(yǎng)基：玉米粉2.0%，黃豆餅粉3.0%，酵母粉0.01%，K2HPO40.01%，MgSO40.0025%，NaCl 0.02%，CaCO30.03%，初始pH 7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉2.0%，淀粉1.0%，花生餅粉3.5%，酵母粉0.05%，K2HPO40.02%，MgSO40.05%，(NH4)2SO40.25%，CaCO30.5%，初始pH 7.0。發(fā)酵48 h達(dá)到發(fā)酵高峰。多抗霉素發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉1.5%，豆餅粉2.0%，飴糖2.0%，KH2PO40.1%，NaCl 0.1%，CaCO30.3%，p

29、H 6.5。10接種量，28，120h。BT該菌生長(zhǎng)的最適pH在7.07.2，弱堿性條件有利于芽泡及晶體的形成；增加培養(yǎng)基中糖含量顯著提高菌體的生長(zhǎng)量，但對(duì)芽孢及晶體的形成均有一定影響；高通氣量有利于菌的生長(zhǎng)，并可縮短發(fā)酵周期，但后期通氣量過(guò)大影響芽孢及晶體形成。該菌發(fā)酵的最佳工藝條件為：控制發(fā)酵溫度在30；發(fā)酵前期(包括延遲期、加速期、對(duì)數(shù)期)：pH控制在7.0，采用達(dá)1:2.0 v/(vmin)的大通氣量，達(dá)1:2.0 v/(vmin)，為菌的生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境，盡可能提高菌數(shù)(高于7.51010/mL)；發(fā)酵后期(減速期、恒定期)：不控pH，并適當(dāng)減小通氣旦到1:0.5、1:1.0 v/

30、(vmin)，更有利于菌體向芽孢及伴孢晶體轉(zhuǎn)化(98以上)。液體培養(yǎng)基：I號(hào)培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，pH 7.2；II號(hào)培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.5%，葡萄糖1.0%，pH7.2。衣康酸菌種：土曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.2/分，罐壓0.7公斤，pH 4.0左右。培養(yǎng)基：葡萄糖14%，米糠0.3%，各種無(wú)機(jī)鹽適量。發(fā)酵周期90小時(shí)。曲酸菌種：黃曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:0.2/分，罐壓0.7公斤，pH 4.0左右。培養(yǎng)基：主要成分為液化淀粉14%，各

31、種無(wú)機(jī)鹽適量。發(fā)酵周期130小時(shí)。菌種：米曲霉。利用豆渣的發(fā)酵培養(yǎng)基：豆渣80%，麩皮24%，酵母膏1.2%，MgSO47H2O 0.16%，pH自然；30發(fā)酵培養(yǎng)，56 d菌體生長(zhǎng)量和曲酸產(chǎn)量最大。利用黃漿水發(fā)酵培養(yǎng)基為：葡萄糖12%，酵母膏0.5，MgSO47H2O 0.05%，K2HPO40.05%，黃漿水100%，pH為6.0。30發(fā)酵培養(yǎng)，56 d菌體生長(zhǎng)量和曲酸產(chǎn)量最大。檸檬酸菌種：黑曲霉。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:1/分，罐壓0.7公斤，pH在3左右；培養(yǎng)基主要成分為液化淀粉14%，各種無(wú)機(jī)鹽適量，產(chǎn)酸溫度為3436，發(fā)酵周期90小時(shí)。谷氨酸菌種

32、：谷氨酸棒桿菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:1/分，罐壓0.7公斤，pH在7.0左右；培養(yǎng)基主要成分：葡萄糖13%，MgSO47H2O 0.08%，KH2PO40.08%，玉米漿3%9%，糖蜜0.5%1%，豆?jié)?%5%，KCl 0.1%，發(fā)酵周期30小時(shí)。賴(lài)氨酸菌種：谷氨酸棒桿菌。發(fā)酵參考環(huán)境：5100噸罐，攪拌轉(zhuǎn)速100轉(zhuǎn)/分，通風(fēng)量1:1/分，罐壓0.7公斤，pH在7.0左右。種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，(NH4)2SO40.4%，MgSO47H2O 40 mg，玉米漿2.0%，尿素0.1%，CaCO33.0%，乙酸銨0.1%，K2HPO40.15%，豆?jié)?

33、.86%，pH 7.27.4，115高壓滅菌15 min。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖15.0%，(NH4)2SO43.5%，MgSO47H2O 20 mg，玉米漿2.5%，乙酸銨0.9%，生物素20 g，K2HPO40.15%，豆?jié)?.6%，pH7.27.4。115高壓滅菌15 min。堿性蛋白酶菌種：芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基I：可溶性淀粉1%，蛋白胨0.5%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，CaCl20.1%，pH中性，121滅菌25 min。發(fā)酵培養(yǎng)基II：玉米粉2%，豆餅粉3%，麩皮3%，Na2HPO40.4%，KH2PO40.03%，ZnCl20.1%，pH 8.0，121滅菌25 min。發(fā)酵培養(yǎng)基III：黃豆餅粉5%，玉米粉5%，麩皮2.5%，KH2PO40.03%，Na2HPO40.4%，Na2CO30.1%，自然pH。在36下通風(fēng)培養(yǎng)，前期通風(fēng)1:0.15，后期通風(fēng)1:0.2，培養(yǎng)40 h左右。低溫堿性蛋白酶菌種：黃海黃桿菌。發(fā)酵培養(yǎng)基I：豆餅粉(水解液，加0.5% NaOH，121水解30 min，冷卻、過(guò)濾) 4.5%、玉米漿6%，Na2HP