第八章雙水相萃取技術(shù)-2012

1、第八章第八章 雙水相萃取技術(shù)雙水相萃取技術(shù)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 1896年，荷蘭微生物學(xué)家年，荷蘭微生物學(xué)家Beijerinck發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)聚合物聚合物的不相容性的不相容性:把明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶把明膠與瓊脂或明膠與可溶性淀粉溶液混合時(shí)，得到一種不透明的混合溶液，靜置后液混合時(shí)，得到一種不透明的混合溶液，靜置后分為兩相，上相含有大部分水，下相含有大部分分為兩相，上相含有大部分水，下相含有大部分瓊脂（或淀粉），而兩相的主要成分都是水瓊脂（或淀粉），而兩相的主要成分都是水. 1955年，瑞典倫德大學(xué)的年，瑞典倫德大學(xué)的Albertsson首次利用雙首次利用雙水相技術(shù)從單細(xì)胞藻類中分離淀粉核

2、，從此開(kāi)創(chuàng)水相技術(shù)從單細(xì)胞藻類中分離淀粉核，從此開(kāi)創(chuàng)了了雙水相分配技術(shù)雙水相分配技術(shù)。 1979年德國(guó)年德國(guó)GBF的的Kula和和Kroner等等3人將雙水人將雙水相體系用于提取酶和蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)酶的提取過(guò)相體系用于提取酶和蛋白質(zhì)，使胞內(nèi)酶的提取過(guò)程大為改善。程大為改善。 一、基本概念及分類一、基本概念及分類 雙水相系統(tǒng)雙水相系統(tǒng):某些親水性高某些親水性高分子聚合物的水溶液超過(guò)一分子聚合物的水溶液超過(guò)一定濃度后可形成兩個(gè)不相混定濃度后可形成兩個(gè)不相混溶的水相。溶的水相。 聚合物聚合物-聚合物聚合物-水系統(tǒng)水系統(tǒng):聚合聚合物分子的空間阻礙作用使相物分子的空間阻礙作用使相互間無(wú)法滲透互間無(wú)法滲透

3、。 聚合物聚合物-無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽-水系統(tǒng)水系統(tǒng):鹽析鹽析作用。作用。為什么會(huì)形成雙水相？為什么會(huì)形成雙水相？ 聚合物之間的不相容性聚合物之間的不相容性:聚合物分子的空間阻礙作聚合物分子的空間阻礙作用使相互間無(wú)法滲透，從而在一定條件下分為兩用使相互間無(wú)法滲透，從而在一定條件下分為兩相。相。 只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合只要兩種聚合物水溶液的水溶性有所差異，混合時(shí)就可發(fā)生相分離，并且水溶性差別越大，相分時(shí)就可發(fā)生相分離，并且水溶性差別越大，相分離傾向也就越大。離傾向也就越大。 某些聚合物的溶液在與某些某些聚合物的溶液在與某些無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽等低分子質(zhì)量等低分子質(zhì)量化合物的溶液相混時(shí)，只要濃

4、度達(dá)到一定值，也化合物的溶液相混時(shí)，只要濃度達(dá)到一定值，也會(huì)產(chǎn)生兩相。其形成機(jī)理是由于會(huì)產(chǎn)生兩相。其形成機(jī)理是由于鹽析鹽析作用。作用。 雙水相系統(tǒng)分類雙水相系統(tǒng)分類 雙聚合物體系雙聚合物體系：聚乙二醇：聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)/葡聚糖（葡聚糖（dextran，Dx）；）；聚丙二醇（聚丙二醇（polypropylene glycol）/聚乙聚乙二醇；甲基纖維素（二醇；甲基纖維素（methylcellulose）/葡葡聚糖等。聚糖等。 聚合物和無(wú)機(jī)鹽體系聚合物和無(wú)機(jī)鹽體系：PEG/磷酸鉀（略作磷酸鉀（略作KPi）、）、PEG/磷酸銨、磷酸銨、PEG/硫酸鈉等硫酸鈉

5、等 類型類型形成上相的聚合物形成上相的聚合物形成下相的聚合物形成下相的聚合物非離子型聚合物非離子型聚合物/ /非離子型聚合物非離子型聚合物聚乙二醇聚乙二醇聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚聚乙烯醇、葡聚糖、聚蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮乙烯吡咯烷酮聚丙二醇聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、甲基聚丙二醇、羥丙基葡聚糖、甲基聚丙二醇、羥丙基葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮聚乙烯吡咯烷酮羥丙基葡聚糖羥丙基葡聚糖葡聚糖葡聚糖聚蔗糖聚蔗糖葡聚糖葡聚糖乙基羥基纖維素乙基羥基纖維素葡聚糖葡聚糖甲基纖維素甲基纖維素羥丙基葡聚糖、葡聚糖羥丙基葡聚糖、葡聚糖高分子電解質(zhì)高分子電解質(zhì)/ /非離子型聚合物非離子

6、型聚合物羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽聚乙二醇聚乙二醇高分子電解質(zhì)高分子電解質(zhì)/ /高分子電解質(zhì)高分子電解質(zhì)葡聚糖硫酸鈉葡聚糖硫酸鈉羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉羧甲基纖維素鈉非離子型聚合物非離子型聚合物/ /低分子量化合物低分子量化合物葡聚糖葡聚糖丙醇丙醇非離子型聚合物非離子型聚合物/ /無(wú)機(jī)鹽無(wú)機(jī)鹽聚乙二醇聚乙二醇磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸磷酸鉀、硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、酒石酸鉀鈉、甲酸鈉鈉、酒石酸鉀鈉、甲酸鈉與一般的水與一般的水-有機(jī)溶劑體系相比較有什么不同？有機(jī)溶劑體系相比較有什么不同？ 雙水相體系中兩相的雙水相體系中兩相的性質(zhì)差別（如密

7、度和性質(zhì)差別（如密度和折射率等）較小折射率等）較小。由于折射率的差別甚小，。由于折射率的差別甚小，有時(shí)甚至都難于發(fā)現(xiàn)它們的相界面。兩相有時(shí)甚至都難于發(fā)現(xiàn)它們的相界面。兩相間的間的界面張力也很小界面張力也很小，僅為，僅為10-510-4 N/m（一般體系為（一般體系為10-3210-2 N/m）。）。 三、雙水相萃取技術(shù)的基本特點(diǎn)三、雙水相萃取技術(shù)的基本特點(diǎn) 兩相的性質(zhì)差別（如密度和折射率等）較小兩相的性質(zhì)差別（如密度和折射率等）較小 兩相間的界面張力也很小兩相間的界面張力也很小 （一）條件溫和，體系具有生物親和性（一）條件溫和，體系具有生物親和性（二）所需溶液少，操作方便（二）所需溶液少，操作

8、方便（三）分離迅速，步驟簡(jiǎn)便（三）分離迅速，步驟簡(jiǎn)便（四）操作易于控制（四）操作易于控制（五）可簡(jiǎn)化分離步驟（五）可簡(jiǎn)化分離步驟 （六）能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化（六）能進(jìn)行萃取性的生物轉(zhuǎn)化（七）親和萃?。ㄓH和分配）可大大提高分配系數(shù)和（七）親和萃?。ㄓH和分配）可大大提高分配系數(shù)和萃取專一性萃取專一性 （八）易于工藝的連續(xù)化生產(chǎn)（八）易于工藝的連續(xù)化生產(chǎn) 第二節(jié)第二節(jié) 雙水相分配原理及其理論基礎(chǔ)雙水相分配原理及其理論基礎(chǔ) 一、雙水相系統(tǒng)分配原理一、雙水相系統(tǒng)分配原理 是否會(huì)形成雙水相，取決于混合是否會(huì)形成雙水相，取決于混合熵增熵增和和分子間作分子間作用力用力兩個(gè)因素。兩個(gè)因素。 混合混合是自發(fā)的熵

9、增過(guò)程，而分子間相互作用力則是自發(fā)的熵增過(guò)程，而分子間相互作用力則隨分子量的變大而增強(qiáng)。隨分子量的變大而增強(qiáng)。 當(dāng)兩種高分子聚合物之間當(dāng)兩種高分子聚合物之間互不相溶互不相溶時(shí)，由于相對(duì)時(shí)，由于相對(duì)分子質(zhì)量較大，分子間的分子質(zhì)量較大，分子間的相互排斥作用相互排斥作用與混合過(guò)與混合過(guò)程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的程的熵增加相比占主導(dǎo)地位，一種聚合物分子的周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平周圍將聚集同種分子而排斥異種分子，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，即形成富含兩種不同聚合物的兩相。衡時(shí)，即形成富含兩種不同聚合物的兩相。 上、下相的組成取決于兩種聚合物（如上、下相的組成取決于兩種聚合物（如PEG

10、/Dx）的）的加入量加入量以及其以及其分子質(zhì)量分子質(zhì)量的大小。的大小。 當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、當(dāng)物質(zhì)進(jìn)入雙水相體系后，由于表面性質(zhì)、電荷作用和各種作用力（如憎水鍵、氫鍵電荷作用和各種作用力（如憎水鍵、氫鍵和離子鍵等）的存在和環(huán)境的影響，使和離子鍵等）的存在和環(huán)境的影響，使其其在上、下相中的濃度不同在上、下相中的濃度不同。 分配系數(shù)分配系數(shù) K不同而分離不同而分離相圖相圖 雙水相形成條件和定量雙水相形成條件和定量關(guān)系可用相圖表示關(guān)系可用相圖表示。 雙結(jié)點(diǎn)線雙結(jié)點(diǎn)線：把均相區(qū)和：把均相區(qū)和兩相區(qū)域分隔開(kāi)兩相區(qū)域分隔開(kāi)。 系線系線：連接雙結(jié)點(diǎn)線上：連接雙結(jié)點(diǎn)線上兩點(diǎn)的直線。兩點(diǎn)的直線

11、。 臨界點(diǎn)臨界點(diǎn)：當(dāng)系線長(zhǎng)度趨：當(dāng)系線長(zhǎng)度趨向于零時(shí)，即在圖中的向于零時(shí)，即在圖中的K點(diǎn)，兩相差別消失，點(diǎn)，兩相差別消失，任何溶質(zhì)在兩相中的分任何溶質(zhì)在兩相中的分配系數(shù)均為配系數(shù)均為1，成為單，成為單相體系。相體系。KPi質(zhì)量分?jǐn)?shù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)/%PEG質(zhì)質(zhì)量量分分?jǐn)?shù)數(shù)/%MTBMVVBT均相區(qū)均相區(qū)兩相區(qū)兩相區(qū)系線系線 在同一條系線上的各在同一條系線上的各點(diǎn)分成的兩相具有點(diǎn)分成的兩相具有相相同的組成同的組成，但，但體積比體積比不同。不同。 當(dāng)上下兩相間密度差當(dāng)上下兩相間密度差小時(shí)，兩相的體積近小時(shí)，兩相的體積近似服從杠桿規(guī)則似服從杠桿規(guī)則。MTBMVVBT按表格重復(fù)操作PEG400 0.700g

12、H2O 0.5ml (NH4)2SO4混和 H2O 0.3/0.5ml渾濁記錄(NH4)2SO4 ml數(shù)混均繪制相圖實(shí)驗(yàn)操作澄清旋渦器繪制相圖PEG400% (NH4)2SO4%二、雙水相中的分配平衡二、雙水相中的分配平衡 溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用溶質(zhì)在雙水相中的分配系數(shù)也用K=cT/cB表示。表示。 分配系數(shù)是各種相互作用的和分配系數(shù)是各種相互作用的和. lnKP=lnKE+lnKS+lnKA 總分配系數(shù)總分配系數(shù)KP: lnKE、lnKS、lnKA分別為靜電作分別為靜電作用、疏水作用、親和作用對(duì)溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻(xiàn)。用、疏水作用、親和作用對(duì)溶質(zhì)分配系數(shù)的貢獻(xiàn)。 在系線上各點(diǎn)處系統(tǒng)的在系線

13、上各點(diǎn)處系統(tǒng)的總濃度不同總濃度不同，但均分成，但均分成組組成相同成相同而而體積不同體積不同的兩相，在同一條系線上的不的兩相，在同一條系線上的不同點(diǎn)，物質(zhì)的分配系數(shù)相同。同點(diǎn)，物質(zhì)的分配系數(shù)相同。 （一）靜電作用（一）靜電作用 lnK=lnKo+FZ/RT Ko為溶質(zhì)靜電荷為零時(shí)的分配系數(shù)；為溶質(zhì)靜電荷為零時(shí)的分配系數(shù)；F為法拉第為法拉第常數(shù)；常數(shù)；Z為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)；為溶質(zhì)的靜電荷數(shù)；為相間電位差。為相間電位差。 荷電解質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成荷電解質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與溶質(zhì)的凈電荷數(shù)成正比正比. 分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無(wú)機(jī)鹽而異分配系數(shù)與靜電荷數(shù)的關(guān)系因無(wú)機(jī)鹽而異,同一雙同一雙

14、水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的水相系統(tǒng)中添加不同的鹽產(chǎn)生的相間電位相間電位不同不同 帶帶負(fù)電荷負(fù)電荷的蛋白質(zhì)在雙水相種的分配系數(shù)的蛋白質(zhì)在雙水相種的分配系數(shù)K : K+ Na+ NH4+ Li+ (C4H9)4N+ ClO4- SCN- I- Br- Cl- CH3CO2- F- H2PO4- HPO42- （二）疏水作用（二）疏水作用 一般情況下，蛋白質(zhì)的表面均存在疏水區(qū)，疏水一般情況下，蛋白質(zhì)的表面均存在疏水區(qū)，疏水區(qū)所占比表面越大，其疏水性越強(qiáng)。不同組分由區(qū)所占比表面越大，其疏水性越強(qiáng)。不同組分由于其表面疏水性的差異使得其各自在上下相中產(chǎn)于其表面疏水性的差異使得其各自在上下相中產(chǎn)生相應(yīng)的分

15、配平衡。生相應(yīng)的分配平衡。 lnKsHF(RH +B) HF為相間的疏水性差，也稱為相間的疏水性差，也稱疏水性因子疏水性因子；RH為為氨基酸的相對(duì)疏水性；氨基酸的相對(duì)疏水性；B為比例常數(shù)。為比例常數(shù)。 lnKo=HFHFS HFS蛋白質(zhì)的表面疏水性蛋白質(zhì)的表面疏水性.（pH=pI時(shí)時(shí)） lnK0HF(HFS+HFS) HFS為鹽濃度增加引起的為鹽濃度增加引起的HFS值增量。值增量。 lnKHF(HFS+HFS)+ FZ/RT （三）界面張力作用（三）界面張力作用 非電解質(zhì)型溶質(zhì)在液體中的界面張力的存在使它非電解質(zhì)型溶質(zhì)在液體中的界面張力的存在使它呈不均勻分布，并聚集在雙水相體系中具有較低呈不均

16、勻分布，并聚集在雙水相體系中具有較低能量的一相中。能量的一相中。 非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)與非電解質(zhì)型溶質(zhì)的分配系數(shù)與相間表面自由能差相間表面自由能差及及溶質(zhì)的分子量溶質(zhì)的分子量有關(guān)有關(guān) lnKP=-E/kT-M /RT 溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與其分子量呈線性關(guān)系溶質(zhì)的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)與其分子量呈線性關(guān)系 同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變同一溶質(zhì)的分配系數(shù)隨雙水相系統(tǒng)的不同而改變 （四）親和作用（四）親和作用 通過(guò)一定的方法，將配基連接在雙水相的成通過(guò)一定的方法，將配基連接在雙水相的成相物質(zhì)分子上，就構(gòu)成了具有親和性質(zhì)的雙相物質(zhì)分子上，就構(gòu)成了具有親和性質(zhì)的雙水相體系，形成對(duì)被分配物質(zhì)的

17、親和作用，水相體系，形成對(duì)被分配物質(zhì)的親和作用，調(diào)節(jié)待提取物在兩相中的分配，從而提高其調(diào)節(jié)待提取物在兩相中的分配，從而提高其分離效果分離效果 過(guò)渡金屬離子過(guò)渡金屬離子:Cu2、Ni2、Fe2、Zn2、Co2等是常用的親和配基等是常用的親和配基 作用機(jī)理作用機(jī)理:配位鍵力、配位鍵力、-鍵及靜電作用力鍵及靜電作用力 四、影響物質(zhì)分配平衡的因素四、影響物質(zhì)分配平衡的因素 除了靜電作用、疏水作用及界面張力等各除了靜電作用、疏水作用及界面張力等各種相互作用因素外，影響物質(zhì)在雙水相系種相互作用因素外，影響物質(zhì)在雙水相系統(tǒng)中分配的因素主要還有統(tǒng)中分配的因素主要還有: 雙水相系統(tǒng)的聚合物組成雙水相系統(tǒng)的聚合物

18、組成(包括聚合物類型、包括聚合物類型、平均分子量平均分子量) 鹽類鹽類(包括離子的類型和濃度、離子強(qiáng)度、包括離子的類型和濃度、離子強(qiáng)度、pH值值) 溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)溶質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)(包括分子量、等電點(diǎn)包括分子量、等電點(diǎn)) 體系的溫度等。體系的溫度等。 （一）雙水相中聚合物組成（一）雙水相中聚合物組成當(dāng)兩種不同濃度的聚合物與聚合物或者聚合物與無(wú)當(dāng)兩種不同濃度的聚合物與聚合物或者聚合物與無(wú)機(jī)鹽以不同的濃度混合時(shí)，可能存在機(jī)鹽以不同的濃度混合時(shí)，可能存在三種情況三種情況： a、完全混溶性、完全混溶性(勻相溶液勻相溶液)；b、物理的不相溶性、物理的不相溶性(相分離相分離)；c、復(fù)雜的凝聚、復(fù)雜的凝

19、聚(相分離，聚合物聚集在相分離，聚合物聚集在同一相中，純?nèi)軇┩幌嘀?，純?nèi)軇?水聚集在另一相中水聚集在另一相中) 當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時(shí)，當(dāng)這兩種聚合物是離子化合物并帶有相反電荷時(shí)，它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。它們互相吸引并發(fā)生復(fù)雜的凝聚。 不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性 水溶液中水溶液中聚合物的疏水性聚合物的疏水性按下列按下列次序遞增次序遞增： 葡萄糖硫酸鹽葡萄糖硫酸鹽甲基葡萄糖甲基葡萄糖葡萄糖葡萄糖羥丙級(jí)葡萄羥丙級(jí)葡萄糖糖甲基纖維素甲基纖維素聚乙烯醇聚乙烯醇聚乙二醇聚乙二醇聚丙三醇。聚丙三醇。 （二）成相聚合物分子量（二）

20、成相聚合物分子量 同一聚合物的同一聚合物的疏水性疏水性隨隨分子量分子量的增大而增的增大而增大。大。 對(duì)于對(duì)于PEG/Dextran所形成的雙水相體系中，所形成的雙水相體系中，若降低若降低PEG相對(duì)分子質(zhì)量，則生物分子分相對(duì)分子質(zhì)量，則生物分子分配于富含配于富含PEG的上相中，使分配系數(shù)增大；的上相中，使分配系數(shù)增大；而降低而降低Dextran相對(duì)分子質(zhì)量，則分配系數(shù)相對(duì)分子質(zhì)量，則分配系數(shù)減小。減小。 對(duì)于同種聚合物而言，其疏水性隨相對(duì)分對(duì)于同種聚合物而言，其疏水性隨相對(duì)分子質(zhì)量增加而增加子質(zhì)量增加而增加 若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對(duì)于若想在上相獲得較高的蛋白質(zhì)收率，對(duì)于PEG聚合物，應(yīng)

21、聚合物，應(yīng)(? )它的平均相對(duì)分子質(zhì)它的平均相對(duì)分子質(zhì)量。量。（三）成相聚合物的濃度（三）成相聚合物的濃度 聚合物分相的最低濃度為聚合物分相的最低濃度為臨界點(diǎn)臨界點(diǎn)，系線系線的的長(zhǎng)度為零長(zhǎng)度為零,此時(shí)分配系數(shù)為此時(shí)分配系數(shù)為1，即組分均勻的，即組分均勻的分配于上下相分配于上下相. 隨著成相聚合物的總濃度或聚合物隨著成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合鹽混合物的總濃度增大，系線的長(zhǎng)度增加，系統(tǒng)物的總濃度增大，系線的長(zhǎng)度增加，系統(tǒng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，成相聚合物兩相性質(zhì)的差別遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)，成相聚合物兩相性質(zhì)的差別也增大，組分在兩相中的也增大，組分在兩相中的分配系數(shù)改變分配系數(shù)改變。 成相物質(zhì)的總濃度越高，系線越

22、長(zhǎng)，生物成相物質(zhì)的總濃度越高，系線越長(zhǎng)，生物分子越容易分配于其中的某一相分子越容易分配于其中的某一相.其它因素其它因素 1.分配物質(zhì)的分子量分配物質(zhì)的分子量 2.鹽的種類和濃度鹽的種類和濃度 3.pH值影響值影響 4.溫度的影響溫度的影響 5.通氣和攪拌的影響通氣和攪拌的影響 M10-4第三節(jié)第三節(jié) 雙水相萃取操作及設(shè)備雙水相萃取操作及設(shè)備 一、一、 雙水相系統(tǒng)的選擇雙水相系統(tǒng)的選擇:易于兩相的分離易于兩相的分離. 根據(jù)待分離蛋白質(zhì)和共存雜質(zhì)的表面疏水根據(jù)待分離蛋白質(zhì)和共存雜質(zhì)的表面疏水性、分子量、等電點(diǎn)和表面電荷等性質(zhì)上性、分子量、等電點(diǎn)和表面電荷等性質(zhì)上的差別，來(lái)選擇雙水相系統(tǒng)，并確定成相

23、的差別，來(lái)選擇雙水相系統(tǒng)，并確定成相聚合物的分子量及濃度、鹽的濃度、聚合物的分子量及濃度、鹽的濃度、pH值值等因素以確定最佳的萃取系統(tǒng)。等因素以確定最佳的萃取系統(tǒng)。 對(duì)于目標(biāo)蛋白與雜蛋白的對(duì)于目標(biāo)蛋白與雜蛋白的表面疏水性相差表面疏水性相差較大較大的體系，可利用鹽析等作用原理，通的體系，可利用鹽析等作用原理，通過(guò)提高成相系統(tǒng)的濃度，增大雙水相系統(tǒng)過(guò)提高成相系統(tǒng)的濃度，增大雙水相系統(tǒng)的疏水性，達(dá)到目標(biāo)蛋白與雜蛋白的分離。的疏水性，達(dá)到目標(biāo)蛋白與雜蛋白的分離。 對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白的對(duì)于目標(biāo)蛋白質(zhì)與雜蛋白的等電點(diǎn)不同等電點(diǎn)不同的的體系，添加適當(dāng)?shù)柠}，并通過(guò)調(diào)節(jié)系統(tǒng)的體系，添加適當(dāng)?shù)柠}，并通過(guò)調(diào)節(jié)系

24、統(tǒng)的pH值使相間電位差變大，而達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)物值使相間電位差變大，而達(dá)到目標(biāo)產(chǎn)物與雜蛋白的分離。與雜蛋白的分離。 PEG/Dx系統(tǒng)系統(tǒng) 高聚物高聚物/鹽體系鹽體系 新的雙水相體系新的雙水相體系:表面活性劑表面活性劑-表面活性劑表面活性劑-水體系、雙水相膠束體系等體系水體系、雙水相膠束體系等體系 二、雙水相萃取工藝設(shè)計(jì)二、雙水相萃取工藝設(shè)計(jì) 目標(biāo)物應(yīng)滿足以下條件：目標(biāo)物應(yīng)滿足以下條件： 與原料液中的雜質(zhì)應(yīng)分配在不同的相中與原料液中的雜質(zhì)應(yīng)分配在不同的相中 在雙水相體系中的某一相中的分配系數(shù)應(yīng)在雙水相體系中的某一相中的分配系數(shù)應(yīng)相對(duì)較大相對(duì)較大 雙水相系統(tǒng)的上下相應(yīng)易于分離。雙水相系統(tǒng)的上下相應(yīng)易于分

25、離。 工藝流程工藝流程 目的產(chǎn)物的萃取目的產(chǎn)物的萃取 PEG的循環(huán)的循環(huán) 無(wú)機(jī)鹽的循環(huán)。無(wú)機(jī)鹽的循環(huán)。 （一）目的產(chǎn)物的萃取 1.如果目標(biāo)產(chǎn)物在上相中的分配系數(shù)足夠大，則如果目標(biāo)產(chǎn)物在上相中的分配系數(shù)足夠大，則細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物可采用一步或兩步雙水細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物可采用一步或兩步雙水相萃取工藝獲得較高的純化倍數(shù)。相萃取工藝獲得較高的純化倍數(shù)。 一步雙水相萃取一步雙水相萃取是把生物材料懸浮液和雙水相系是把生物材料懸浮液和雙水相系統(tǒng)混合后，分離上下相，其中下相含有大多數(shù)雜統(tǒng)混合后，分離上下相，其中下相含有大多數(shù)雜質(zhì)，而上相再通過(guò)超濾操作進(jìn)行進(jìn)一步的提純目質(zhì)，而上相再通過(guò)超濾操作進(jìn)行進(jìn)一步

26、的提純目標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)高聚物一相可以得到回收。標(biāo)產(chǎn)物，同時(shí)高聚物一相可以得到回收。 在在兩步萃取兩步萃取操作中，把一步萃取體系中的上相分操作中，把一步萃取體系中的上相分離出來(lái)后，再加入鹽使其形成新的雙水相體系，離出來(lái)后，再加入鹽使其形成新的雙水相體系，則富含則富含PEG的上相得到回收，同時(shí)，含有目標(biāo)產(chǎn)的上相得到回收，同時(shí)，含有目標(biāo)產(chǎn)物的鹽相通過(guò)超濾等操作得到分離目標(biāo)，而且可物的鹽相通過(guò)超濾等操作得到分離目標(biāo)，而且可以通過(guò)濃縮可以進(jìn)行回收再利用。以通過(guò)濃縮可以進(jìn)行回收再利用。 PEG/鹽雙水相體系一步或兩步萃取流程示意圖鹽雙水相體系一步或兩步萃取流程示意圖 2.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的萃取 雙水相萃取法可選

27、擇性地使細(xì)胞碎片分配于雙水相系統(tǒng)的下相，而目標(biāo)產(chǎn)物分配于上相，同時(shí)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的部分純化和細(xì)胞碎片的除去，從而節(jié)省利用離心法或膜分離法除碎片的操作過(guò)程。 如果細(xì)胞勻漿液中的目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)較小，則可采用多步雙水相萃取工藝以獲得較高的純化倍數(shù)。 三步雙水相萃取酶的流程示意圖三步雙水相萃取酶的流程示意圖 （二）（二）PEG循環(huán)循環(huán) 在大規(guī)模雙水相萃取過(guò)程中，成相材料的在大規(guī)模雙水相萃取過(guò)程中，成相材料的回收和循環(huán)使用，不僅可以減少?gòu)U水處理回收和循環(huán)使用，不僅可以減少?gòu)U水處理的費(fèi)用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低成本。的費(fèi)用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低成本。 PEG的回收有兩種方法：的回收有兩種方法： 加入鹽使目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入富鹽相來(lái)回收加入鹽使目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入富鹽相來(lái)回收PEG； 將將PEG相通過(guò)離子交換樹(shù)脂，用洗脫劑相通過(guò)離子交換樹(shù)脂，用洗脫劑先洗去先洗去PEG，再洗出蛋白質(zhì)。，再洗出蛋白質(zhì)。（三）無(wú)機(jī)鹽的循環(huán)（三）無(wú)機(jī)鹽的循環(huán) 一種方法使將含磷酸鈉的鹽相冷卻到一種方法使將含磷酸鈉的鹽相冷卻到6，使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機(jī)分離收集；使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機(jī)分離收集； 另一