氧化氮合成酶試劑使用說(shuō)明書【建筑工程類獨(dú)家文檔首發(fā)】

1、氧化氮合成酶試劑使用說(shuō)明書【建筑工程類獨(dú)家文檔首發(fā)】小鼠誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS） ELISA試劑盒使用說(shuō)明書本試劑盒僅供研究使用預(yù)期應(yīng)用ELISA法定量測(cè)定小鼠血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它相關(guān)液體中iNOS含量。實(shí)驗(yàn)原理本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測(cè)定標(biāo)本中iNOS水平。用純化的抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入iNOS生物素化的抗小鼠iNOS抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物 TMB顯 色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的 黃色。顏色的深淺和樣品中的 iNOS呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm波長(zhǎng)下測(cè) 定吸光

2、度（OD值），計(jì)算樣品濃度。試劑盒組成及試劑配制1.酶聯(lián)板：一塊（96孔）2.標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為 80 U/mL，做系 列倍比稀釋后，分別稀釋成 80 U/mL，40 U/mL，20 U/mL，10 U/mL，5 U/mL， 2.5 U/mL，1.25 U/mL，其原液直接作為最高標(biāo)準(zhǔn)濃度，樣品稀釋液直接作 為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 U/mL，臨用前15分鐘內(nèi)配制。如配制40 U/mL標(biāo)準(zhǔn)品：取 0.5ml 80 U/mL 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有 0.5ml樣品稀釋液的Eppendof管中，混勻即可，其余濃

3、度以此類推。3.樣品稀釋液：1×20ml/瓶。4.檢測(cè)稀釋液 A： 1×10ml/瓶。5.檢測(cè)稀釋液B: 1×10ml/瓶。6.檢測(cè)溶液A: 1×120ul/瓶（1: 100）臨用前以檢測(cè)稀釋液 A 1: 100稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100ul ）,實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2mI。女口 1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比 例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制。7. 檢測(cè)溶液B: 1×120ul/瓶（1: 100）臨用前以檢測(cè)稀釋液 B1： 100 稀釋。稀釋方法同檢測(cè)溶液 A。8.底物

4、溶液：1×10ml/ 瓶。9.濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時(shí)每瓶用蒸餾水稀釋 25倍。10. 終止液：1×10ml/ 瓶（2N H2SO4。標(biāo)本的采集及保存1. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清：請(qǐng)離心后收集上清，并將標(biāo)本保存于-20C，且應(yīng)避免 反復(fù)凍融。2.血清：標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置 2小時(shí)或4C過夜后于10結(jié)語(yǔ)：任何一個(gè)人，都要必須養(yǎng)成自學(xué)的習(xí)慣，即使是今天在學(xué)校的學(xué)生，也要養(yǎng)成自學(xué)的習(xí)慣，因?yàn)檫t早總要離開學(xué)校的！自學(xué)，就是一種獨(dú)立學(xué)習(xí)， 獨(dú)立思考的能力。行路，還是要靠行路人自己。努力學(xué)習(xí)，勤奮工作，讓青 春更加光彩。本文由王敏老師編輯整理，感謝大家的支持！00 x g

5、離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。3. 血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20C保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 注：標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。操作步驟實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品 稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul ，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100u

6、l，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37 C反應(yīng)120分鐘。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測(cè)溶液A工作液100ul （取1ul檢測(cè)溶液A加99ul檢測(cè)稀釋液A的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí) 內(nèi)配制），<?xml:namespace prefix = st1 /37C ,60 分鐘。3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。4.每孔加檢測(cè)溶液B工作液（同檢測(cè)A工作液）100ul , 37C, 60分鐘。5.溫育6

7、0分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。6.依序每孔加底物溶液90ul , 37C避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo) 準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度蘭色，后 3-4孔梯度不明顯，即可終止）。7.依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的 加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（0D值）。在加終止液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。注：1. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是最后加底物 溶液及2NH2SO4測(cè)量時(shí)

8、先用此孔調(diào)0D直至零。2.為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時(shí)將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加 上蓋或覆膜。3.未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請(qǐng)于 2-8C保存。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液 A工 作液、檢測(cè)溶液B工作液請(qǐng)依據(jù)所需的量配置使用。請(qǐng)勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液 A工作液或檢測(cè)溶液B工作液。4.建議檢測(cè)樣品時(shí)均設(shè)雙孔測(cè)定，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。洗板方法手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在 實(shí)驗(yàn)臺(tái)上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至 少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。自動(dòng)洗板: 如果有自動(dòng)洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式

9、實(shí)驗(yàn)過程中。特異性本試劑盒可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的小鼠iNOS,且與其它相關(guān)蛋白無(wú)交叉反應(yīng)。計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD直為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半 對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD直由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD直計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD 直代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。注意事項(xiàng)1.洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽(yáng)性。2. 次加樣時(shí)間最好控制在 5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。3.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。4. 如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高， 請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)最后乘以稀 釋倍數(shù)。5. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。6底物請(qǐng)避光保存。檢測(cè)范圍：1.25 U/mL -80 U/mL說(shuō)明1.試劑盒保存：-20C（較長(zhǎng)時(shí)間不用時(shí)）；2-8C（頻繁使用時(shí)）。2 .有效期：6個(gè)月3. 濃洗滌液會(huì)有鹽析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶。4. 剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會(huì)含有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成任何影響。5. 中、英