實驗六 石蠟切片法1

1、實驗六實驗六 石蠟切片法石蠟切片法 包埋、切片和貼片包埋、切片和貼片 石蠟切片法石蠟切片法 o 石蠟切片法是顯微制片技術(shù)中最常用的一種方法，除了石蠟切片法是顯微制片技術(shù)中最常用的一種方法，除了 藻類、菌類、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既藻類、菌類、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既 可制成可制成較薄的切片較薄的切片，使材料各部分都清晰可見，同時也，使材料各部分都清晰可見，同時也 可制成可制成連續(xù)切片連續(xù)切片，觀察材料的動態(tài)發(fā)生及層次，所以，觀察材料的動態(tài)發(fā)生及層次，所以， 它在顯微制片技術(shù)中占有非常重要的地位，必須掌握，它在顯微制片技術(shù)中占有非常重要的地位，必須掌握， 同時也是進行透射

2、電鏡觀察超薄切片的基礎(chǔ)。同時也是進行透射電鏡觀察超薄切片的基礎(chǔ)。 石蠟切片的主要過程石蠟切片的主要過程 o取材取材固定保存固定保存沖洗沖洗脫水脫水 透明透明石蠟透入石蠟透入包埋包埋修修 塊塊切片切片貼片貼片復水復水染色染色 脫水脫水封藏封藏觀察保存觀察保存 o（一）包埋（一）包埋 o（二）修塊、切片、貼片（二）修塊、切片、貼片 o（三）染色、封藏（三）染色、封藏 一、實驗?zāi)康囊弧嶒災(zāi)康?o 掌握動植物材料石蠟切片的方法及要求；掌握動植物材料石蠟切片的方法及要求； o 熟練掌握石蠟切片的關(guān)鍵步驟熟練掌握石蠟切片的關(guān)鍵步驟包埋。包埋。 o 學習旋轉(zhuǎn)切片機的使用方法，熟練掌握石蠟學習旋轉(zhuǎn)切片機的使

3、用方法，熟練掌握石蠟 切片的關(guān)鍵步驟切片的關(guān)鍵步驟切片。切片。 二、實驗材料及用品二、實驗材料及用品 o 實驗材料實驗材料：植物葉片、小鼠肝臟：植物葉片、小鼠肝臟 o 實驗用具實驗用具：載、蓋玻片；溫箱、包埋盒、水盆：載、蓋玻片；溫箱、包埋盒、水盆 等、切片機、毛筆等。等、切片機、毛筆等。 o 實驗藥品實驗藥品：石蠟、蛋白黏貼劑。：石蠟、蛋白黏貼劑。 三、實驗步驟（三、實驗步驟（1） o取材取材（根據(jù)制片目的和要求而定，代表性）；（根據(jù)制片目的和要求而定，代表性）； o殺死和固定殺死和固定： n小鼠利用引頸致死法迅速殺死，取其肝臟，用生理鹽水沖洗干凈后分割成小鼠利用引頸致死法迅速殺死，取其肝臟

4、，用生理鹽水沖洗干凈后分割成 0.51cm0.51cm0.3cm 小塊投入小塊投入Bouins固定液中進行固定；固定液中進行固定； n植物葉片采集后分割成植物葉片采集后分割成11.5c小塊后投入小塊后投入FAA固定液中進行固定；固定液中進行固定； o沖洗沖洗 n小鼠肝臟經(jīng)苦味酸固定液固定后必須使用小鼠肝臟經(jīng)苦味酸固定液固定后必須使用70%或或50%AL進行沖洗；進行沖洗； n植物葉片經(jīng)植物葉片經(jīng)FAA固定液后使用流水進行沖洗固定液后使用流水進行沖洗 o脫水脫水（常用脫水劑：乙醇；脫水原則：低濃度到高濃度）（常用脫水劑：乙醇；脫水原則：低濃度到高濃度）（目的？目的？） n50% 70% 80%

5、95% 100%AL 100%AL n脫水時間：視材料的性質(zhì)、大小而定脫水時間：視材料的性質(zhì)、大小而定 n小鼠肝臟：在各級小鼠肝臟：在各級AL中停留中停留0.5-1h； n植物葉片：在各級植物葉片：在各級AL中停留中停留2-4h； n注意注意：脫水應(yīng)徹底，否則與二甲苯混合后：脫水應(yīng)徹底，否則與二甲苯混合后混濁混濁，必須倒回重脫水；如需過夜，必須倒回重脫水；如需過夜， 則停留在則停留在70%酒精中。酒精中。 三、實驗步驟（三、實驗步驟（2） o透明（置換，透明（置換，作用？作用？） n常用透明劑：二甲苯；常用透明劑：二甲苯； n透明原則：低濃度到高濃度透明原則：低濃度到高濃度 （二甲苯二甲苯+

6、100%酒精酒精 二甲苯二甲苯 二甲苯）二甲苯） n透明時間：小鼠肝臟每級停留透明時間：小鼠肝臟每級停留0.5-1h；植物葉片每級停留；植物葉片每級停留1-3h。 n脫水不凈，用二甲苯透明后，將發(fā)生下列不良后果：脫水不凈，用二甲苯透明后，將發(fā)生下列不良后果： o（1 1）材料：材料內(nèi)仍留有微量水分，二甲苯就進不去，因此石蠟也不能透）材料：材料內(nèi)仍留有微量水分，二甲苯就進不去，因此石蠟也不能透 入，切片后將在蠟片上出現(xiàn)空洞，影響結(jié)果。入，切片后將在蠟片上出現(xiàn)空洞，影響結(jié)果。 o（2 2）切片：切片內(nèi)留有微量水分，在封片以后，就會發(fā)生乳白色的云霧狀）切片：切片內(nèi)留有微量水分，在封片以后，就會發(fā)生乳

7、白色的云霧狀 ，在顯微鏡下觀察時，可見許多密集水珠把組織掩蓋，切片就作廢了。，在顯微鏡下觀察時，可見許多密集水珠把組織掩蓋，切片就作廢了。 o浸蠟浸蠟： n要點：使石蠟完全浸入細胞的每個部分，同時要使石蠟緊密地貼在細胞要點：使石蠟完全浸入細胞的每個部分，同時要使石蠟緊密地貼在細胞 壁的內(nèi)外，成為不可分離的狀態(tài)；壁的內(nèi)外，成為不可分離的狀態(tài)； n原則：低溫原則：低溫 高溫、低濃度高溫、低濃度 高濃度高濃度 三、實驗步驟（三、實驗步驟（3） o包埋：就是將已經(jīng)浸好蠟的材料連用熔化的石蠟一起倒入定形的紙包埋：就是將已經(jīng)浸好蠟的材料連用熔化的石蠟一起倒入定形的紙 盒中，使之凝固。盒中，使之凝固。 n包

8、埋前折紙盒包埋前折紙盒 n包埋時將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，包埋時將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯， 倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速且輕輕地用溫鑷子夾倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速且輕輕地用溫鑷子夾 取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材 料，使之排列整齊。然后輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢平放于水盆料，使之排列整齊。然后輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢平放于水盆 的水面上，待蠟盒內(nèi)的石蠟表面凝固，即可將紙盒向一側(cè)傾斜，使冷水的水

9、面上，待蠟盒內(nèi)的石蠟表面凝固，即可將紙盒向一側(cè)傾斜，使冷水 從一邊浸入紙盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋塊迅速凝固，待石從一邊浸入紙盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋塊迅速凝固，待石 蠟完全凝固（約蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。）后即可取出備用。 包埋過程中易出現(xiàn)的問題及解決辦法包埋過程中易出現(xiàn)的問題及解決辦法 o 問題問題：包埋后的石蠟塊應(yīng)為均勻半透明狀，有時出現(xiàn)白色渾濁：包埋后的石蠟塊應(yīng)為均勻半透明狀，有時出現(xiàn)白色渾濁 結(jié)晶（像雪花一樣）部分，這樣在切片時就有妨礙，不易切出結(jié)晶（像雪花一樣）部分，這樣在切片時就有妨礙，不易切出 薄的切片。薄的切片。 o 原因原因：組織內(nèi)部或石

10、蠟中混有透明劑；組織內(nèi)部或石蠟中混有透明劑；脫水不干凈；脫水不干凈；石石 蠟本身品質(zhì)不良；蠟本身品質(zhì)不良；組織塊移入紙盒時動作太慢，周圍的石蠟組織塊移入紙盒時動作太慢，周圍的石蠟 已成凝固狀態(tài)；已成凝固狀態(tài)；冷卻用水溫度不夠低，石蠟?zāi)烫?。冷卻用水溫度不夠低，石蠟?zāi)烫?o 解決辦法解決辦法：屬于前三個原因者應(yīng)在包埋之前就須注意；屬于后：屬于前三個原因者應(yīng)在包埋之前就須注意；屬于后 二個原因者，可將包埋塊再投入二個原因者，可將包埋塊再投入蠟中熔化后重新包埋，但必蠟中熔化后重新包埋，但必 須注意熔化包埋過的石蠟塊的時間不宜過久。須注意熔化包埋過的石蠟塊的時間不宜過久。 三、實驗步驟（三、實

11、驗步驟（4） o修塊修塊：削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平 面成面成45度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長方度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長方 形，每邊的長度為形，每邊的長度為0.2mm0.3mm ； n修塊的目的：修塊的目的： 1）使切成的蠟帶成一直線，不發(fā)生彎曲；）使切成的蠟帶成一直線，不發(fā)生彎曲； 2）每個切片組織的距離接近，便于鏡檢或作連續(xù)切片。）每個切片組織的距離接近，便于鏡檢或作連續(xù)切片。 n要求要求：組織塊必須組織塊必須 上下平行，上下平行， 但左右的蠟、上下的蠟不要但左右的

12、蠟、上下的蠟不要 太多或太少；正方形或長方形，可各切去一角，以便識別。太多或太少；正方形或長方形，可各切去一角，以便識別。 三、實驗步驟（三、實驗步驟（5） o切片：切片：用鋒利的刀片，將包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，用鋒利的刀片，將包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片， 一般用專門的切片機和切片刀。一般用專門的切片機和切片刀。 o切片機的結(jié)構(gòu)切片機的結(jié)構(gòu)： n控制切片厚薄的微動裝置；控制切片厚薄的微動裝置； n供裝切片刀的夾刀部分；供裝切片刀的夾刀部分； n供裝置組織塊的夾物部分。供裝置組織塊的夾物部分。 o切片機的類型根據(jù)結(jié)構(gòu)分為切片機的類型根據(jù)結(jié)構(gòu)分為： n滑行式切片機滑行式切片機：

13、夾刀部分是滑動的，而夾物部分是固定的，可上：夾刀部分是滑動的，而夾物部分是固定的，可上 下升降；下升降； n旋轉(zhuǎn)式切片機旋轉(zhuǎn)式切片機：夾物部分式上下移動，前后推進，而夾刀部分則：夾物部分式上下移動，前后推進，而夾刀部分則 固定不變。固定不變。 三、實驗步驟（三、實驗步驟（6） o切片的步驟：切片的步驟： n將已經(jīng)修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，并固定好；將已經(jīng)修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，并固定好； n將切片刀安裝在切片機的刀架上，調(diào)節(jié)切片刀的角度為將切片刀安裝在切片機的刀架上，調(diào)節(jié)切片刀的角度為15左右，并固左右，并固 定好；定好； n調(diào)節(jié)切片的厚度：棉花葉片：調(diào)節(jié)切片的厚度：棉花葉片：8-1

14、0um；小鼠肝臟：；小鼠肝臟：6-9um； n調(diào)節(jié)蠟塊與刀口的距離：打開刀架固定鈕，推動刀架，使切片刀刃貼近調(diào)節(jié)蠟塊與刀口的距離：打開刀架固定鈕，推動刀架，使切片刀刃貼近 蠟塊表面（從側(cè)面觀察），再固定刀架；蠟塊表面（從側(cè)面觀察），再固定刀架； n切片：打開停刀軋，開始切片，右手握住手輪柄，順時針方向搖動，每切片：打開停刀軋，開始切片，右手握住手輪柄，順時針方向搖動，每 搖動一圈就切下一片，切下的蠟片粘在刀口上，待第二片切下時就連在搖動一圈就切下一片，切下的蠟片粘在刀口上，待第二片切下時就連在 一起，連續(xù)搖轉(zhuǎn)手輪就可以講切下的蠟片練成一條蠟帶。待蠟帶有一定一起，連續(xù)搖轉(zhuǎn)手輪就可以講切下的蠟片練

15、成一條蠟帶。待蠟帶有一定 長度，左手執(zhí)毛筆，將蠟帶抬起，邊搖邊移動蠟帶。待蠟帶長至長度，左手執(zhí)毛筆，將蠟帶抬起，邊搖邊移動蠟帶。待蠟帶長至20- 30cm，停止搖動，用右手執(zhí)另一支毛筆順刀口方向拔下蠟帶，平放于，停止搖動，用右手執(zhí)另一支毛筆順刀口方向拔下蠟帶，平放于 白紙上，靠刀面較光滑面向下，較皺褶的一面向上。白紙上，靠刀面較光滑面向下，較皺褶的一面向上。 切片注意事項：切片注意事項： o操作時一定要小心，隨時注意關(guān)好停刀軋，以防刀夾突然下降傷操作時一定要小心，隨時注意關(guān)好停刀軋，以防刀夾突然下降傷 及手指，在換蠟塊時，必須先關(guān)停刀軋，才能取下蠟塊；及手指，在換蠟塊時，必須先關(guān)停刀軋，才能取

16、下蠟塊； o切片時不要對著蠟帶講話，要防風，以免將蠟帶吹散；切片時不要對著蠟帶講話，要防風，以免將蠟帶吹散； o根據(jù)材料要求，注意調(diào)節(jié)合適的切片厚度；根據(jù)材料要求，注意調(diào)節(jié)合適的切片厚度； o切片完畢后，將刀取下擦凈，放入盒內(nèi)保存，同時用毛筆清潔切切片完畢后，將刀取下擦凈，放入盒內(nèi)保存，同時用毛筆清潔切 片機各部分，將刀架、夾物器等退回原處固定。片機各部分，將刀架、夾物器等退回原處固定。 切片過程中出現(xiàn)問題的一般原因和補救辦法 ： 一、蠟帶彎曲不直蠟帶彎曲不直 n原因原因：1.蠟塊上下兩邊不平行，或與刀口不平行；蠟塊上下兩邊不平行，或與刀口不平行；2.刀口鋒利不一，局刀口鋒利不一，局 部產(chǎn)生差

17、異；部產(chǎn)生差異；3. 材料未居蠟塊正中央。材料未居蠟塊正中央。 n補救辦法補救辦法： 1.取下臺木，將蠟塊兩邊修平，調(diào)節(jié)夾物部，使兩者平行。取下臺木，將蠟塊兩邊修平，調(diào)節(jié)夾物部，使兩者平行。 2.移動刀片，改用新刀口。移動刀片，改用新刀口。3. 用刀片切去部分石蠟，使材料居中。用刀片切去部分石蠟，使材料居中。 二、切片分離，不能連成帶狀或卷起成圓筒狀。二、切片分離，不能連成帶狀或卷起成圓筒狀。 n原因：原因：1.室溫過低。室溫過低。2.石蠟過硬。石蠟過硬。3.材料邊緣留蠟太少。材料邊緣留蠟太少。4. 刀的角度不刀的角度不 合適。合適。 n補救辦法：補救辦法： 1.在切片機上安一盞電燈加溫。在切

18、片機上安一盞電燈加溫。2.用手指在蠟塊面上磨擦。用手指在蠟塊面上磨擦。 3.重新包埋。重新包埋。4.矯正刀的角度。矯正刀的角度。 三、切片粘附于刀片上，皺褶在一起。三、切片粘附于刀片上，皺褶在一起。 n原因：原因：1.室溫過高。室溫過高。2.石蠟過軟。石蠟過軟。3.刀口上留有一層石蠟。刀口上留有一層石蠟。4.刀口鈍。刀口鈍。 n補救辦法：補救辦法： 1.在早晚涼爽時切。在早晚涼爽時切。2.將蠟塊投入涼水中稍浸。將蠟塊投入涼水中稍浸。3.用二甲苯用二甲苯 拭去石蠟。拭去石蠟。4.磨刀或移動刀口。磨刀或移動刀口。 切片過程中出現(xiàn)問題的一般原因和補救辦法 ： 四、切片縱裂橫波。厚薄不均勻。四、切片縱

19、裂橫波。厚薄不均勻。 n原因：原因：1.刀口有缺口；刀口有缺口；2.石蠟塊中有顆粒及雜質(zhì)；石蠟塊中有顆粒及雜質(zhì)；3.刀口有細纖刀口有細纖 絲或碎屑；絲或碎屑；4.刀和臺木未夾緊；刀和臺木未夾緊；5.組織塊太硬。組織塊太硬。 n補救辦補救辦 法：法： 1.可移動刀片；可移動刀片；2.將顆粒挑去；將顆粒挑去；3.清潔刀口；清潔刀口；4.旋旋 緊螺旋；緊螺旋；5.在水中浸泡。在水中浸泡。 五、材料出現(xiàn)裂隙、破碎或脫落。五、材料出現(xiàn)裂隙、破碎或脫落。 n原因：原因：1.脫水不干凈；脫水不干凈；2.透明劑殘留；透明劑殘留；3.石蠟透入時溫度過高；石蠟透入時溫度過高； 4.材料太硬或太粗。材料太硬或太粗。

20、 n補救辦法：補救辦法： 1.無法補救；無法補救；2.重新包埋；重新包埋；3.無法補救；如由于脫無法補救；如由于脫 水劑，透明劑引起的可改用正丁醇，松油醇等進行脫水和透明；水劑，透明劑引起的可改用正丁醇，松油醇等進行脫水和透明； 4.軟化組織。軟化組織。 三、實驗步驟（三、實驗步驟（7） o貼片：貼片： n要求要求：1）貼附牢固，在染色時不易脫落；）貼附牢固，在染色時不易脫落；2）使皺褶的蠟片伸展平整）使皺褶的蠟片伸展平整 n步驟步驟： n1）在載玻片上涂上蛋白黏貼劑；）在載玻片上涂上蛋白黏貼劑； n2）將已經(jīng)涂好蛋白黏貼劑的載玻片放在紙面上，并滴加數(shù)滴蒸餾水；）將已經(jīng)涂好蛋白黏貼劑的載玻片放

21、在紙面上，并滴加數(shù)滴蒸餾水； n3）用刀片將蠟帶切成許多小段，每段的長度應(yīng)依照蓋玻片的長度為準，）用刀片將蠟帶切成許多小段，每段的長度應(yīng)依照蓋玻片的長度為準， 一般應(yīng)比蓋玻片短約一般應(yīng)比蓋玻片短約1/5-2/5，因蠟片加溫后要伸長，因蠟片加溫后要伸長1/5-2/5，在分段時應(yīng)，在分段時應(yīng) 從蠟片的交界處分開；從蠟片的交界處分開； n4）用毛筆將蠟片輕輕移到載玻片上（必須注意蠟片的光面朝下）；）用毛筆將蠟片輕輕移到載玻片上（必須注意蠟片的光面朝下）； n5）將載玻片平行地放置在酒精燈的上方，微熱，使切片伸展攤平，如）將載玻片平行地放置在酒精燈的上方，微熱，使切片伸展攤平，如 發(fā)現(xiàn)散開，請重新用鑷

22、子排列整齊；發(fā)現(xiàn)散開，請重新用鑷子排列整齊； n6）晾干待用。）晾干待用。 四、實驗結(jié)果四、實驗結(jié)果 o 包埋后的石蠟快應(yīng)為均勻的半透明狀，蠟塊中沒有包埋后的石蠟快應(yīng)為均勻的半透明狀，蠟塊中沒有 氣泡。氣泡。 o 包埋材料擺放的位置是否符合要求？包埋材料擺放的位置是否符合要求？ o 修塊效果修塊效果：每個蠟邊與材料平行，蠟邊的上下左右搖平：每個蠟邊與材料平行，蠟邊的上下左右搖平 行。行。 o 切片效果切片效果：得到厚薄均勻的蠟帶，蠟帶無破損。：得到厚薄均勻的蠟帶，蠟帶無破損。 o 展片效果展片效果：展片后蠟帶或蠟片平整，無氣泡、粘附牢固，：展片后蠟帶或蠟片平整，無氣泡、粘附牢固， 蠟帶略呈透明狀，后續(xù)制片不易脫落。蠟帶略呈透明狀，后續(xù)制片不易脫落。 五、作業(yè)五、作業(yè) o 實驗完畢，每人交包埋塊一個，在紙盒上寫實驗完畢，每人交包埋塊一個，在紙盒上寫 上材料名稱及自己的姓名和日期；上材料名稱及自己的姓名和日期； o 實驗完畢，每人交玻片兩張，用鉛筆在載玻實驗完畢，每人交玻片兩張，用鉛筆在載玻 片上寫上材料名稱及自己的姓名和日期；片上寫上材料名稱及自己的姓名和日期