流式細(xì)胞技術(shù)與圖像處理

1、flow cytometry流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)流式細(xì)胞術(shù) 流式細(xì)胞術(shù)（流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，fcm）是以流式細(xì)胞）是以流式細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞儀為檢測(cè)手段的一項(xiàng)能快速、精確的對(duì)單個(gè)細(xì)胞(或生物學(xué)或生物學(xué)顆粒顆粒)的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。的理化特性進(jìn)行多參數(shù)定量分析和分選的技術(shù)。 原理：原理：以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素以高能量激光照射高速流動(dòng)狀態(tài)下被熒光色素染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的染色的單細(xì)胞或微粒，測(cè)量其產(chǎn)生的散射光和發(fā)射熒光的強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞強(qiáng)度，從而對(duì)細(xì)胞(微粒微粒)的性

2、狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。的性狀進(jìn)行定性、定量分析和分選。流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介流式細(xì)胞儀簡(jiǎn)介 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀（flow cytometerflow cytometer ）是集細(xì)胞與）是集細(xì)胞與分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、分子生物學(xué)、流體力學(xué)、激光技術(shù)、光電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的一種新型高科技儀器。為一體的一種新型高科技儀器。流式細(xì)胞儀特點(diǎn)流式細(xì)胞儀的分類n分析型分析型流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。細(xì)胞樣本分析后最終進(jìn)入廢液桶，不能回收利用。n分選型分選型流式細(xì)胞

3、儀流式細(xì)胞儀既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；既能流式分析，還能對(duì)分析的目的細(xì)胞進(jìn)行分選；進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流進(jìn)樣管道較長(zhǎng)，需要保持無(wú)菌狀態(tài)，所以分選型流式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。式細(xì)胞儀一般只用于分選，不兼單純分析。bd公司產(chǎn)品公司產(chǎn)品 facs calibur雙激光四色，市場(chǎng)覆蓋率最高 facsaria 科研型分選流式細(xì)胞儀facs vantage diva科研型（大型機(jī)）特點(diǎn)：多數(shù)字化適用用各類細(xì)胞分選4路分選beckman coulter流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀epics xl 單激光四色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型cyan三激光九色，分析型fc 5

4、00 單激光或雙激光五色，市場(chǎng)覆蓋率高，分析型gallios 三激光十色，分析型moflo xdp 高端分選型第一節(jié)第一節(jié) 流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)組成結(jié)構(gòu)組成n液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)n光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)n電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)n細(xì)胞分選系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)液流系統(tǒng)n鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)鞘流技術(shù)：根據(jù)層流原理發(fā)展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩展起來(lái)的技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)兩種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)種液體的同軸流動(dòng)，樣本細(xì)胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外胞流位于軸心穩(wěn)定流動(dòng)，外面包裹有鞘液面包裹有鞘液(sheath)。n流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流體動(dòng)力學(xué)聚焦：穩(wěn)定的液流從截面積較大的部分流入流從截面積

5、較大的部分流入截面積較小的部分后，有一截面積較小的部分后，有一個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直個(gè)聚焦收縮作用，細(xì)胞流直徑被約束在徑被約束在10-20um，避免，避免了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)了多個(gè)細(xì)胞重疊進(jìn)入檢測(cè)區(qū)。鞘液鞘液鞘液鞘液細(xì)胞流細(xì)胞流激光照射點(diǎn)激光照射點(diǎn)流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖流體動(dòng)力學(xué)聚焦示意圖液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)進(jìn)樣速率控制進(jìn)樣速率控制 通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并通過改變樣本壓力可以調(diào)節(jié)樣本的進(jìn)樣速率，而這并不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。不是提高樣本流的流速，而是改變了細(xì)胞之間的距離。 高速時(shí)樣本流變寬，單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)高速時(shí)樣本流變寬，單

6、位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)激光照射區(qū)的細(xì)胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。胞數(shù)就增加，這樣會(huì)導(dǎo)致變異系數(shù)增加。光學(xué)系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。激光特點(diǎn)：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)、高能量、小發(fā)射角、高穩(wěn)定性光照。光學(xué)原理光學(xué)原理散射信號(hào)散射信號(hào)與與熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)熒光信號(hào)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。，再回到低能狀態(tài)時(shí)釋放出的光。發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)(熒光波長(zhǎng)熒光波長(zhǎng))emission wavelength激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)excitation wavelengthlongpass shortp

7、ass bandpass460 500 540460 500 540460 500 540光收集系統(tǒng)：濾光片電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：電子數(shù)據(jù)系統(tǒng)構(gòu)成：n光電檢測(cè)器光電檢測(cè)器將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。將光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電子信號(hào)。n前置放大電路前置放大電路將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。將信號(hào)等比例放大，輸出電脈沖信號(hào)。n模數(shù)轉(zhuǎn)換器模數(shù)轉(zhuǎn)換器將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。將模擬的電脈沖信號(hào)轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)。n數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集、分析。光電檢測(cè)器光電檢測(cè)器(photodetector)n光電二極管光電二極管(photodiode)光靈

8、敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（光靈敏度低，測(cè)定強(qiáng)信號(hào)（fsc）；）；n光電倍增管光電倍增管(photomultiplier, pmt)光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（光靈敏度高，測(cè)定弱信號(hào)（ssc, fl1, fl2, fl3, fl4)。pmt前向散射光前向散射光光電二極管光電二極管 光信號(hào)的類型：光信號(hào)的類型：n散射光信號(hào)散射光信號(hào)：與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)，與標(biāo)記熒光素?zé)o關(guān)， 是細(xì)胞的固有參數(shù)。是細(xì)胞的固有參數(shù)。前向散射光前向散射光(forward scatter, fsc);側(cè)向散射光側(cè)向散射光(side scatter, ssc).n熒光信號(hào)熒光信號(hào)自發(fā)熒光自發(fā)熒光 ：微弱：微弱特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出

9、特異熒光：標(biāo)記的熒光素分子發(fā)出 的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。的熒光，比自發(fā)熒光強(qiáng)很多倍。流式細(xì)胞分析的信息流式細(xì)胞分析的信息光信號(hào)檢測(cè)光信號(hào)檢測(cè)流式細(xì)胞的基本信息流式細(xì)胞的基本信息: “形態(tài)形態(tài)”散射光的作用散射光的作用n實(shí)驗(yàn)中，常利用實(shí)驗(yàn)中，常利用fsc和和ssc這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同這兩種參數(shù)的組合，區(qū)分不同的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。的細(xì)胞群體，去除碎片、死細(xì)胞和粘連細(xì)胞的干擾。粒細(xì)胞粒細(xì)胞單核細(xì)胞單核細(xì)胞淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片紅細(xì)胞、死細(xì)胞和碎片流式細(xì)胞的主要信息流式細(xì)胞的主要信息:fluorescencenfl1nfl2nfl3nfl4最常用的標(biāo)記

10、方法是熒光素分子標(biāo)記最常用的標(biāo)記方法是熒光素分子標(biāo)記的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合的抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合nforward scatter (fsc)forward scatter (fsc)nside scatter (ssc)side scatter (ssc)nfl1-fl1-綠色綠色nfl2-fl2-、橙色橙色nfl3-fl3-紅色紅色nfl4-fl4-紅色紅色488fl1bp 530/30515-545nmfitc（綠色，（綠色，520nm520nm）fl2bp 585/42564-606nmpefl3670 lp670nmpe-cy5、percp、pe-cy7（紅色）（紅色）635fl4bp 6

11、61/16653-669nmapc（紅色，（紅色，660nm660nm）流式常見圖形流式常見圖形 (histogram plot)適用于：?jiǎn)螀?shù)分析適用于：?jiǎn)螀?shù)分析dna倍體分析倍體分析抗原表達(dá)分析抗原表達(dá)分析流式常見圖形流式常見圖形 (dot plot)散點(diǎn)圖散點(diǎn)圖偽彩圖偽彩圖 假三維圖和三維圖假三維圖和三維圖ssc-heightfsc-heightcountsssc cd45 cd14 等高圖和密度圖等高圖和密度圖n等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目等高圖：類似于地圖中的等高線，同一條線上的細(xì)胞數(shù)目相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多。相等，越在里面的曲線代表細(xì)胞數(shù)目越多

12、。n密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方密度圖：點(diǎn)密度越大的地方細(xì)胞越多，點(diǎn)密度越小的地方細(xì)胞少。細(xì)胞少。設(shè)門與數(shù)據(jù)分析設(shè)門與數(shù)據(jù)分析n門門(gate，簡(jiǎn)寫，簡(jiǎn)寫g)是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，是流式細(xì)胞術(shù)中的一個(gè)重要術(shù)語(yǔ)，fcm數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。數(shù)據(jù)分析過程實(shí)際上就是選門和設(shè)門的過程。橢圓形橢圓形圓形圓形十字門十字門線性門線性門流式分選流式分選 電荷式電荷式分選分選超聲振動(dòng)器超聲振動(dòng)器(15-100khz)液流充電系統(tǒng)液流充電系統(tǒng)高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板收集裝置收集裝置(流式管、培養(yǎng)板流式管、培養(yǎng)板)lasers斷裂點(diǎn)斷裂點(diǎn)(充電充電)高壓偏轉(zhuǎn)板高壓偏轉(zhuǎn)板第

13、二節(jié)第二節(jié) 流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)的科研應(yīng)用n分析群體細(xì)胞分析群體細(xì)胞n所需時(shí)間短所需時(shí)間短n多參數(shù)分析多參數(shù)分析n定性或定量定性或定量流式應(yīng)用常見范圍流式應(yīng)用常見范圍n細(xì)胞大小細(xì)胞大小n細(xì)胞的顆粒度細(xì)胞的顆粒度n細(xì)胞表面分子：細(xì)胞表面分子：cd 系列等系列等n細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等細(xì)胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細(xì)胞因子等n細(xì)胞核內(nèi)分子：細(xì)胞核內(nèi)分子：p53n細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞功能檢測(cè)：細(xì)胞周期、凋亡、ph、ca+、細(xì)胞活性等、細(xì)胞活性等 樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞 懸液 標(biāo)記熒光抗體檢測(cè)表型測(cè)定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計(jì)學(xué) 分析繼續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處理實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的處

14、理n單細(xì)胞懸液的制備：?jiǎn)渭?xì)胞懸液的制備：胰酶消化胰酶消化n抗體或標(biāo)記分子的染色：抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng)n非特異結(jié)合的去除：非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉洗滌和封閉 封閉：血清和同型抗體封閉：血清和同型抗體細(xì)胞染色細(xì)胞染色n染色要求：染色要求：特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群特異識(shí)別某一群細(xì)胞，有效區(qū)分不同細(xì)胞亞群非特異反應(yīng)水平低非特異反應(yīng)水平低抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本抗體效價(jià)高，用量適用于常規(guī)標(biāo)本n使用特異的單克隆抗體使用特異的單克隆抗體n最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體最好使用熒光直接標(biāo)記的抗體n采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物采用適當(dāng)?shù)年幮詫?duì)照物n抗體最適滴度抗體最適滴度

15、抗體的選擇抗體的選擇n首選直接標(biāo)記抗體首選直接標(biāo)記抗體n熒光分子：熒光分子：pe最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原最強(qiáng)，適用于弱表達(dá)抗原 fitc最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原最便宜，適用于強(qiáng)表達(dá)抗原n間接標(biāo)記：間接標(biāo)記：適用范圍廣適用范圍廣, biotin-avidin不適不適 合弱抗原的檢測(cè)合弱抗原的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)照的設(shè)計(jì)n空白對(duì)照：空白對(duì)照：alln陰性對(duì)照：陰性對(duì)照：評(píng)估非特異反應(yīng)水平，界定陰性范圍 常用同型抗體對(duì)照常用同型抗體對(duì)照 單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（單色分析：設(shè)陰性對(duì)照（或同型抗體對(duì)照或同型抗體對(duì)照） 多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)照多色分析：陰性對(duì)照（或同型對(duì)照），單陽(yáng)性對(duì)

16、照 （用于儀器校正），（用于儀器校正），補(bǔ)償調(diào)整管補(bǔ)償調(diào)整管n陽(yáng)性對(duì)照：確定抗原表達(dá)正常時(shí)的抗原表達(dá)強(qiáng)度和百分含量。（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）（特別在檢測(cè)陰性時(shí)）流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例流式檢測(cè)應(yīng)用實(shí)例n細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)細(xì)胞表面、細(xì)胞內(nèi)分子檢測(cè)n細(xì)胞周期分析細(xì)胞周期分析n細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡分析淋巴細(xì)胞表面抗原分析淋巴細(xì)胞表面抗原分析n樣本來(lái)源樣本來(lái)源新鮮抗凝全血新鮮抗凝全血pbmcn單克隆熒光抗體染色單克隆熒光抗體染色n溶血溶血n洗細(xì)胞洗細(xì)胞n固定固定n上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析淋巴細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)抗原分析n樣本來(lái)源樣本來(lái)源新鮮抗凝全血新鮮抗凝全血pbmcn細(xì)胞表面抗體染色細(xì)胞表面抗體染色n

17、溶血、固定溶血、固定n細(xì)胞打孔細(xì)胞打孔n細(xì)胞內(nèi)抗體染色細(xì)胞內(nèi)抗體染色n上機(jī)檢測(cè)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期分析：細(xì)胞周期分析：g1mg2squiescent cellsg0n處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞處于不同細(xì)胞周期的細(xì)胞dnadna含量不同，含量不同，g g0 0/g/g1 1期細(xì)胞含有期細(xì)胞含有二倍體二倍體量的量的dnadna，g g2 2/m/m期期細(xì)胞含有細(xì)胞含有四倍體四倍體量的量的dnadna，而，而s s期細(xì)胞期細(xì)胞dnadna含量處于含量處于二倍體和四倍體量之間二倍體和四倍體量之間。ndnadna熒光染料能與熒光染料能與dnadna結(jié)合，結(jié)合，dnadna含量的多含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正

18、比，熒光強(qiáng)度少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強(qiáng)度反應(yīng)了反應(yīng)了dnadna吸收熒光分子的多少。通過流吸收熒光分子的多少。通過流式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)式檢測(cè)就能反映細(xì)胞內(nèi)dnadna的含量，區(qū)分的含量，區(qū)分細(xì)胞周期的細(xì)胞周期的g g0 0/g/g1 1期、期、s s期和期和g g2 2/m/m期細(xì)胞比期細(xì)胞比例。例。樣品制備上機(jī)dna dna 流式檢測(cè)的主要指標(biāo)流式檢測(cè)的主要指標(biāo)ndna 含量含量: ploidy：細(xì)胞內(nèi)染色體細(xì)胞內(nèi)染色體dna含量含量 di：測(cè)定標(biāo)本的測(cè)定標(biāo)本的g0/g1期細(xì)胞期細(xì)胞dna含量與同種系正常細(xì)含量與同種系正常細(xì) 胞的胞的g0/g1期細(xì)胞期細(xì)胞dna含量的比值，表示細(xì)胞倍體性含量的比值，表示