L-賴氨酸的生產(chǎn)工藝研究

1、L-賴氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)工藝研究摘 要：L-賴氨酸是人體和動物所不能合成的八種必需氨基酸中最重要的一種。L-賴氨酸是國際市場上發(fā)展前景良好的產(chǎn)品，消費需求每年以7-10%的速度遞增，國內(nèi)年產(chǎn)量則以每年20-30%以上的速度遞增。其廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品 和飼料等領(lǐng)域。目前生產(chǎn)賴氨酸最主要的方法是微生物發(fā)酵法。 本文從賴氨酸的 生產(chǎn)現(xiàn)狀、生產(chǎn)方法，發(fā)酵過程中的代謝調(diào)控以及賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育和生產(chǎn) 賴氨酸的前景展望這幾個方面綜述了賴氨酸生產(chǎn)工藝。關(guān)鍵詞：賴氨酸；發(fā)酵；菌種；展望、八 刖言賴氨酸（Lysine）的化學(xué)名稱為2, 6-二氨基己酸，有L-型（左旋）、D-型（右旋） 和DL型（消旋）三種旋學(xué)異

2、構(gòu)體。賴氨酸是人和動物營養(yǎng)的必需氨基酸之一，不能參加轉(zhuǎn)氨作用。人類和動物可吸收利用的只有L型。它對調(diào)節(jié)體內(nèi)代謝平衡、 提高體內(nèi)對谷類蛋白質(zhì)的吸收、改善人類膳食營養(yǎng)和動物營養(yǎng)、促進生長發(fā)育均 有重要作用。L-賴氨酸主要用于醫(yī)藥、食品和飼料工業(yè)。全球約 9 0%的賴氨酸 用作飼料添加劑，約5%用作食品添加劑，其余5%用作醫(yī)藥中間體。目前，全 球賴氨酸年總需求量約為85萬t/a,年增長率為7%一8%?，F(xiàn)全球賴氨酸總產(chǎn)能約 為80萬t/a,產(chǎn)量較大的是日本味之素公司（26萬t/a）、美國ADM公司、BASF韓國 公司和協(xié)和發(fā)酵工業(yè)公司等。國內(nèi)賴氨酸需求量估計在13萬t/a左右。賴氨酸應(yīng)用 范圍較廣，2

3、003年以后，我國已成為全球最大的賴氨酸生產(chǎn)大國。目前已建成和正在建設(shè)的賴氨酸廠主要有廣西賴氨酸公司、福建大泉賴氨酸有限公司、四川川化味之素有限公司、大成賴氨酸廠、肇東賴氨酸廠等。文章從賴氨酸的生產(chǎn)現(xiàn)狀、 生產(chǎn)方法，發(fā)酵過程中的代謝調(diào)控以及賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育和生產(chǎn)賴氨酸的前 景展望等方面論述了賴氨酸生產(chǎn)工藝的研究進展。1賴氨酸生產(chǎn)現(xiàn)狀L-賴氨酸最初是從蛋白質(zhì)水解物中分離得到的，蛋白質(zhì)水解法一般以動物血 粉為原料，此法最多的特點是工藝流程簡單，但是原料來源很有限，僅適合小規(guī) 模生產(chǎn)。此后又出現(xiàn)了化學(xué)合成法、水解法，酶法。直到 1960年，日本首先采用 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸。微生物發(fā)酵生產(chǎn)氨基

4、酸是人為地解除氨基酸生物合成 的代謝控制機制，使其積累大量所需氨基酸。氨基酸的L-型立體專一性決定了發(fā)酵法生產(chǎn)氨基酸較化學(xué)合成的工藝更簡單、 快捷。我國于20世紀60年代中期開始 進行賴氨酸菌株選育和發(fā)酵的研究， 但因產(chǎn)量較低難以工業(yè)化。直到70年代未80 年代初世界賴氨酸實現(xiàn)工業(yè)化后我國的研究才取得突破。目前，世界約 2/3的賴 氨酸企業(yè)采用發(fā)酵法生產(chǎn)，生產(chǎn)的為L-型賴氨酸，生產(chǎn)工藝巳基本成熟。近年來， 賴氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80萬t賴氨酸通過發(fā)酵生產(chǎn)的方式獲得。2 L-賴氨酸發(fā)酵生產(chǎn)研究2.1生產(chǎn)菌種用于工業(yè)上發(fā)酵生產(chǎn)賴氨酸的菌株主要是棒狀桿菌和短桿菌等的變異株，棒狀桿菌具有

5、極高的經(jīng)濟價值，其中谷氨酸棒狀桿菌應(yīng)用最為廣泛。 此外，賴氨酸 生產(chǎn)還有大腸桿菌、黃色短桿菌、釀酒酵母、乳酸發(fā)酵短桿菌、假絲酵母等。谷 氨酸棒狀桿菌包括其亞種黃色短桿菌亞種乳糖短桿菌鈍齒棒狀桿菌和分枝短桿 菌是賴氨酸工業(yè)生產(chǎn)中最重要的微生物2.2黃色短桿菌產(chǎn)賴氨酸的合成途徑與調(diào)控機制丙氨酸葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸CO2丙酮酸酮戊二酸一亮氨酸*PC乙酥輔酶繳氨酸71 +血酮牛二酸込谷氨酸天冬氨酸半醛廿節(jié)氨葉蛋氨酸*蘇氨酸賴氨酸乙I酸TCA天右氨酸 丙氨酸1 AK天冬氨酰磷酸*反饋抑制由上圖可以得出要想得到高產(chǎn)的生產(chǎn)菌株， 必須從以下幾個方面對菌種進行 控制：切斷代謝支路：選育和應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株，

6、切斷丙氨酸、蘇氨酸的分 支途徑是積累賴氨酸的有效手段。解除反饋抑制：選育抗結(jié)構(gòu)類似物的突變株， 可以得到對AK (天門冬氨酸激酶)反饋抑制脫敏的菌株，代謝調(diào)節(jié)被遺傳性地 解除。設(shè)法增加前體物質(zhì)天門冬氨酸的濃度，以抵消變構(gòu)抑制劑的影響。因此 可以考慮選育丙氨酸缺陷型，抗天門冬氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株。解除代謝互 鎖：賴氨酸與亮氨酸的生物合成之間存在代謝互鎖，因此可以考慮選育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸結(jié)構(gòu)類似物的突變株。2.3發(fā)酵2.3.1發(fā)酵工藝條件以及影響因素組成溫度：前期32C,后期30C。ph值：最適ph值6.5-7.0,控制范圍在ph值 6.5-7.5之間。種齡和接種量：二級種子接種量 2%、

7、種齡8-12h,三級種子接種 量10%、種齡6-8h。供氧：供氧需充足，過高、過低的溶氧對發(fā)酵均不利，表 現(xiàn)為菌體濃度下降、產(chǎn)酸降低，發(fā)酵時間延長，否則生成乳酸。初糖濃度控制 在11%15%,轉(zhuǎn)化率最高。2.3.2發(fā)酵控制發(fā)酵法生產(chǎn)賴氨酸的主要原料為淀粉、糖蜜玉米等淀粉類原料需經(jīng)糖化轉(zhuǎn)化為葡 萄糖后才可用，且發(fā)酵液配方中需再補充生物素；甘蔗廢糖蜜含較高的生物素， 發(fā)酵液配方中無需再補充生物素。主要以淀粉水解液或甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn) 賴氨酸。目前大多數(shù)賴氨酸生產(chǎn)廠家的發(fā)酵操作方式為分批操作，發(fā)酵生產(chǎn)涉及到發(fā)酵液和管路系統(tǒng)的消毒滅菌、營養(yǎng)調(diào)節(jié)、酸堿度調(diào)節(jié)、通風(fēng)量調(diào)節(jié)等一系列復(fù)雜 操作，都由配置的

8、DCS系統(tǒng)完成，完全實現(xiàn)了自動化。A.lqaajSass6等對黃色 短桿菌ATCC21513進行流加方式發(fā)酵，研究表明產(chǎn)酸率可達 110.6g/L。官衡等 對賴氨酸產(chǎn)生菌FB42流加發(fā)酵的全過程進行了分析，結(jié)果顯示在小型反應(yīng)器中 的發(fā)酵水平為81.6 g/L,轉(zhuǎn)化率為41.8%，生產(chǎn)強度為1.16g/(hL)，和分批發(fā)酵 相比分別提高了 45.4%、9.7%和28.4%因此，流加方式發(fā)酵將是賴氨酸發(fā)酵的趨 勢。2.4提取要從成熟的發(fā)酵液中提取賴氨酸，必須對發(fā)酵液進行過濾或離心分離除去菌 體和碳酸鈣。傳統(tǒng)的過濾方法為機械過濾，只能除去大顆粒的固體雜質(zhì)。 將超濾 技術(shù)用于處理賴氨酸發(fā)酵液具有如下優(yōu)

9、點：可以截留發(fā)酵液中的菌體蛋白、懸浮固體等雜質(zhì)，有利于提高下一個工序離子交換中樹脂的使用效率和壽命，減輕后續(xù)工藝廢水處理的壓力，截留住的濾渣含有豐富的菌體蛋白及少量的賴氨酸，可以作為飼料添加劑。曾碧格等采用超濾技術(shù)直接處理賴氨酸的發(fā)酵液，結(jié)果表明： 能夠一步截留未經(jīng)任何處理的賴氨酸發(fā)酵液中的菌體蛋白、固體顆粒等雜質(zhì)，濾渣量約為原料體積的10%,而同等量的發(fā)酵液經(jīng)過離子交換后， 濃廢水量約為該 濾渣的20倍。可見，超濾技術(shù)應(yīng)用在賴氨酸發(fā)酵液處理上，大大減少了后續(xù) 污物處理的壓力，可實現(xiàn)賴氨酸超濾的收率97%以上，并且膜通量的衰減幅度較 小，膜設(shè)備運行良好。全世界絕大多數(shù)賴氨酸生產(chǎn)廠都采用離子交換

10、方法從發(fā)酵成熟液中提取賴 氨酸，然后制成含量在98.5%以上的賴氨酸單鹽酸鹽成品。離子交換樹脂為強酸 陽性離子交換樹脂，洗脫劑為氨水。這一工序的技術(shù)具有以下優(yōu)勢：回收率高； 洗出液中賴氨酸濃度高，減少了濃縮時的蒸汽消耗，降低生產(chǎn)負荷；離子交換樹 脂用量少。國外的離子交換系統(tǒng)大多為模擬移動床式操作系統(tǒng) 9，逆流操作并采 用兩級離子交換單元。第一級離子交換單元可得到純度為97.5%的賴氨酸；第二級使用弱酸陽性離子交換樹脂，除去第一級離子交換后洗水中的無機雜質(zhì)， 可將 賴氨酸最終純度提高到98.5%。模擬移動床式操作系統(tǒng)穩(wěn)定且操作彈性大， 洗脫 液用量少，洗出液賴氨酸質(zhì)量分數(shù)比固定床高，同時樹脂用量

11、是固定床的1/51/8。2.5濃縮和結(jié)晶濃縮工序是能耗最大的過程。我國賴氨酸生產(chǎn)最初用標準式濃縮器， 每噸洗 出液蒸汽消耗為1.1 t，蒸出的氨不回收。賴氨酸濃縮液經(jīng)用鹽酸調(diào)節(jié)pH后成為單鹽酸鹽溶液，在結(jié)晶器中結(jié)晶。我國有的生產(chǎn)廠采用冷凍結(jié)晶的方法， 得到含 2個結(jié)晶水的濕晶，分離的母液返回提取工序。賴氨酸濕晶含有的結(jié)晶水須在干 燥工序中除去。我國多數(shù)賴氨酸廠均采用單層流化床干燥器生產(chǎn)，其中采用德國 Vagon公司的床內(nèi)設(shè)置加熱器的流化床干燥器技術(shù)較為先進。3微生物生產(chǎn)賴氨酸的前景展望我國的賴氨酸工業(yè)技術(shù)發(fā)展至今除生產(chǎn)菌種需繼續(xù)加強研發(fā)外就整體而言 已達到或接近世界先進水平傳統(tǒng)的細胞誘變法產(chǎn)生

12、的工業(yè)生產(chǎn)菌存在著致命的 弱點，即失去特性的子代誘變體會積累5，它將影響菌種功能的發(fā)揮。日本的 JOhnishi等人使用基因重構(gòu)的方法，即用等位基因替換的方法將高產(chǎn)生產(chǎn)菌的高 絲氨酸脫氫酶基因(hom)和天門冬氨酸激酶基因(Lys C)引入野生谷氨酸棒桿菌， 得到了目前世界較高水平的賴氨酸菌種，我國應(yīng)在這方面加快研發(fā)步伐。參考文獻1王選良谷氨酸發(fā)酵J.中國釀造.1986(05):12-202張剛.乳酸細菌一一基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用M.北京：生物醫(yī)藥出版分社， 2007.13劉森芝.谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)菌的研究與開發(fā)J.發(fā)酵科技通訊.2009(04):30-314張剛.乳酸細菌一一基礎(chǔ)、技術(shù)和應(yīng)用M.北京：生物醫(yī)藥出版分社， 2007.1 廉立偉，譚玉晶，劉巍，文強細菌鑒定在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用J.發(fā)酵科技通訊.2004(04):22-23呂陽愛.谷氨酸發(fā)酵過程污染噬菌體的處理J.發(fā)酵科技通 訊.2009(04):25-267邱煒煒，林有波，謝天陽，預(yù)防噬菌體污染的有效方法