流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償——1

1、流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償(一) “熒光補(bǔ)償”指修正熒光滲漏的過程,如從探測器除去除匹配熒光以外的任何熒光信號。要用到線性代數(shù)來計(jì)算，要求了解它的產(chǎn)生原理。圖1顯示在設(shè)置熒光補(bǔ)償中常犯錯誤。大部分的流式用戶不能正確回答圖1中的三個問題。對于問題1的正確答案是“樣本2”。對于問題2，答案中十字門虛線的位置就不正確。最后，第三個問題的正確答案是：“不可能決定哪個圖形中的熒光補(bǔ)償是正確的”，因此其中沒有哪個可以說中正確的。 絕大多數(shù)類型的數(shù)據(jù)分析并不絕對需要正確的熒光補(bǔ)償。此問題的另一個答案是不正確的熒光補(bǔ)償在雙色或三色分析中顯得并不十分重要。然而隨著五色分在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中開展，如果這些個問題持續(xù)下去將會導(dǎo)

2、致實(shí)驗(yàn)失敗。 圖1中還顯示了熒光補(bǔ)償在正確檢測抗原熒光表達(dá)強(qiáng)度中重要影響。熒光補(bǔ)償不足會導(dǎo)致弱陽性群體是假陽性顆粒增多，而過度補(bǔ)償則會丟失弱陽性群體而導(dǎo)致假陰性。自單激光雙色分析出現(xiàn)后此過程變得十分重要。每種熒光素分子都具有自身的光譜發(fā)射范圍。這些發(fā)射光譜之間存在相互疊加，如何才能計(jì)數(shù)多少信號是來自PE而又有多少信號是由FITC引起的呢？這個計(jì)算過程我們稱為“熒光補(bǔ)償”。一步法熒光補(bǔ)償如果一種熒光染料的發(fā)射光可以被兩個含有不同波段的濾光片的探測器檢測到（如，在發(fā)射光譜的不同區(qū)域檢測），那么就能根據(jù)其中一個探測器的信號計(jì)算出另一個探測中有多少信號。這是因?yàn)檫@兩個信號是成比例變化的（如圖3）。這個

3、恒定特性是指我們能夠根據(jù)綠色熒光探測器中的曲線面積（綠色熒光信號）來精確推算出橙色熒光探測器的曲線面積（如：橙色熒光信號）。這兩個值的比值可在沒有FITC以外熒光的情況下計(jì)算得知。用于此目的的樣本被稱為“熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)樣本”或是熒光補(bǔ)償質(zhì)控物，用于精確測定補(bǔ)償值。對于典型的流式細(xì)胞儀來說，F(xiàn)ITC發(fā)射光在橙色探測器中的信號大概是綠色探測器的15%。因此，如果我們從橙色探測器中減少綠色探測器信號的15%，那無論有多少FITC信號存在，經(jīng)校準(zhǔn)后的橙色熒光探測器信號將總為零。這時可在系統(tǒng)中加入PE熒光，橙色熒光探測器經(jīng)扣除了15%的綠色信號后將顯示真正的PE熒光信號，而不用再考慮是否存在FTIC熒光了

4、。這就是“一步法”熒光補(bǔ)償：在第二探測器中修正來自另一熒光的信號。二步法（雙）熒光補(bǔ)償從圖3的熒光譜中可見PE熒光也有部分滲漏至FITC探測器中。通過檢測只染有PE熒光的細(xì)胞來獲知此比例，一般它的數(shù)值是2%左右。這稱之為PE熒光補(bǔ)償校正物。但如果PE熒光出現(xiàn)在FITC探測器中，而同時我們又使用FITC熒光來修正PE探測器中的熒光信號，那這還能有可能來正確修正熒光滲漏來得真正的熒光信號嗎？一個不完整的答案來解釋此問題：在現(xiàn)有n色熒光分析實(shí)驗(yàn)，n是指在儀器上同時檢測不確定的熒光數(shù)量；這個系統(tǒng)的熒光補(bǔ)償功能可以完全解決此問題。實(shí)際上，根據(jù)一些數(shù)學(xué)運(yùn)算是有可能使用這種方法來精確調(diào)節(jié)補(bǔ)償?shù)模ㄗx者可以跳過

5、下一章節(jié)，而不必研究其中原理）。xFn定義為在n探測器中檢測到的來自x熒光的信號。這樣fF1就是指FITC探測器中綠色熒光的信號；pF2是指橙色熒光探測器是PE熒光的信號。Dn是指探測n所檢測到的熒光信號。在此情況下，假設(shè)沒有任可背景熒光信號；背景熒光信號將稍后討論。于是：公式1圖2圖2 ( 左側(cè)) 一個補(bǔ)償調(diào)節(jié)不正確的數(shù)據(jù)仍能被分析。這些圖譜數(shù)據(jù)是外周血經(jīng)CD3FITC和CD4PE或PE同型對照染色檢測的結(jié)果。頂端的圖顯示的是未經(jīng)補(bǔ)償調(diào)節(jié)的數(shù)據(jù)；列圖中顯示了FITC到PE中的補(bǔ)償依次增加后的結(jié)果。十字虛線是依據(jù)未染色樣本（或是經(jīng)兩種熒光的同型對照染色）設(shè)定的來定義陽性細(xì)胞群體。實(shí)線門是依據(jù)單

6、熒光-同型對照染色設(shè)定的。注意在任何一張圖中，不用考慮補(bǔ)償是否正確，都可正確計(jì)算CD3陽性細(xì)胞中表達(dá)CD4（CD3+CD4+）細(xì)胞的數(shù)據(jù)，但必須是基于單熒光-同型對照染色對照上的（左側(cè)）。完全以同型對照來設(shè)定的虛線十字門來統(tǒng)計(jì)將會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。僅在補(bǔ)償調(diào)節(jié)正確的情況下（中間圖）才能夠在CD3+CD4+細(xì)胞中準(zhǔn)確計(jì)算CD4熒光；補(bǔ)償不足時CD4熒光過強(qiáng)而當(dāng)補(bǔ)償過度時出現(xiàn)了陰性群體。所以抗原濃度的檢測對不恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)償設(shè)定將會特別敏感。圖3 FITC和PE熒光發(fā)射光光譜。發(fā)射光（由熒光分受激發(fā)后發(fā)出的光線）是在488nm光源下激發(fā)產(chǎn)生的（氬離子激光器發(fā)射光）。FITC發(fā)射光的峰值大約在515nm，典

7、型的用于收集它的發(fā)射光的濾片是在530nm（深灰色區(qū)域）。PE的發(fā)射光是遠(yuǎn)紅光線，峰值在575nm左右，檢測它的濾片位此峰值中央。注意FITC的發(fā)射光有部分延伸至PE信號收集范圍（B）；通常落在575nm波段的熒光信號約為530nm波段熒光信號的15%。PE的發(fā)射光只有極少部分落在530nm波段中（C），通常它只占575nm波段信號的2%（D）。公式2x熒光在其他探測中的信號將與xFn計(jì)算例（n指代專門收集此熒光的探測器）；這樣，如要知道有多少真正的FITC或PE信號,就需要計(jì)算fF1和pF2。現(xiàn)已知（自圖3）fF1與fF2的比值是衡定的，就如同pF2與pF1一樣，這個衡定比值定義如下：公式3公式4因此，xSn是熒光素x在其探測器熒光信號與探測器n的滲漏系數(shù)。這個值由檢測補(bǔ)償質(zhì)控物來獲得，此時樣本所有熒光只來自于一個熒光素。舉例來說，F(xiàn)ITC熒光補(bǔ)償質(zhì)控物：公式5公式6公式7這樣，F(xiàn)ITC熒光滲漏系數(shù)就是FITC染色樣本在各個探測器中的熒光信號與FITC探測器熒光信號的比值。類似的，PE熒光補(bǔ)償質(zhì)控物計(jì)算如下：公式8注意在公式8中D1和D2與在公式7的值是不同的，因?yàn)楣?中是指PE熒光的檢測值。一旦滲漏系統(tǒng)已知，它們便可用于染色樣本來計(jì)算真正的熒光信號xFn?；叵肷鲜龉?、6：公式9公式10在這兩個公式中還有兩個未知數(shù)(fF1和 pF2)，它們可被解析如下：公