磺酸化磁珠富集魚塘水中的孔雀石綠

1、磺酸化磁珠富集魚塘水中的孔雀石綠g/g ， Langmuir 吸附平衡常數(shù)為 0.375 L/g。1引言孔雀石綠（Malachite green , MG 屬堿性三苯甲烷類染料， 由于抗菌、 抗寄生蟲效力較強且價格便宜， 被廣泛用于池塘水的 水體消毒和防治魚類的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲病。MG易被魚體吸收并迅速代謝為脂溶性的隱色孔雀石綠（LMG，具有致癌、致畸、致突變等副作用。 許多國家都禁止將其用于水產養(yǎng)殖。 因此，嚴格監(jiān)控魚塘水孔雀石綠殘留量對于建立無公害水產養(yǎng) 殖， 保證食用者健康具有重要意義。目前，含MG樣品的前處理一般采用液-液萃取法，然后通過 強陽離子型固相萃取柱富集、凈化。整個過

2、程繁瑣、耗時， 有 機溶劑使用量大。 分散固相萃取方法是近年來發(fā)展較快的樣本前 處理技術，具有快速、簡便、廉價、高效、穩(wěn)定、安全且可直接 用于渾濁樣本的前處理等優(yōu)點。 然而， 分散固相萃取采用的吸附 劑粒徑均為幾十微米， 材料比表面積較小， 且不能在溶液中懸浮。 納米級超順磁性材料因其良好的磁響應性以及溶液分散性， 在分 子生物學、 生物醫(yī)學以及環(huán)境科學等領域得到了廣泛應用。 近年 來，有關表面功能化磁珠在食品安全樣本前處理方面的報道逐漸 增多。本研究將納米至亞微米級磺酸化磁珠應用于水樣中孔雀石 綠的富集， 有效地簡化了孔雀石綠樣本前處理步驟， 縮短了前處 理時間。建立了針對含痕量孔雀石綠魚塘

3、水樣品的分散固相萃取 前處理方法。2實驗方法2.1儀器與試劑Waters 2489高效液色譜儀（ Waters 公司）；磁架（無錫中 德伯爾公司）； FS-1200 超聲波處理器（上海生析超聲儀器 XX 公司）；PSA NANO2590 Zeta電位分析儀（英國馬爾文公司）； JEM-1200EX透射電鏡（日本電子公司）；FTIR Nicolet5700 傅里葉變換紅外光譜儀（美國熱電尼高力公司）；離心機（ Sigma 公司）；純水儀（ Milipore 公司）。孔雀石綠（ MG） , 1- 乙基 - （ 3- 二甲氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC、N-羥基硫代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS ）、

4、FeCI36H2O FeCl24H2O （分析純，Sigma 公司）； 苯乙烯、丙烯酸、對氨基苯磺酸（分析純，上海國藥集團化學試 劑XX公司）；其它試劑均為分析純。實驗用水為超純水。池塘 水，取自當?shù)佤~塘。2.2磁珠的制備方法2.2.1 羧基化磁珠的合成 參照文獻 方法，采用化學共沉淀 法合成超順磁性Fe3O4納米顆粒，再將Fe3O4納米顆粒表面油酸 化，無水乙醇洗滌后用氮氣吹干。 用苯乙烯-環(huán)己烷（10： 1, V/V） 混合液懸浮Fe3O4納米顆粒，超聲5 min，將有機相轉入SDS和 NaHCO溶液懸浮，繼續(xù)超聲15 min，乳化形成微乳液。加K2S2O8 于70 C反應30 min后加

5、入丙烯酸，繼續(xù)反應 10 h。磁架吸附 磁珠， 95%乙醇洗滌磁珠表面至溶液無泡沫產生。? :n ?析化學?n ?39卷?n ?5期?漚萬牡齲夯撬嶧？磁珠富集魚塘水中的孔雀石綠？ : ?2.2.2磺酸化磁珠的合成及預處理取 500 mg 羧基化磁珠（表面羧基密度為 2.5 mmol/g ），分 散于 15 mL 0.1 mol/L 硼酸鹽緩沖液（ pH 5.0 ）中，按磁珠表面 羧基密度與 EDCSulfo-NHS摩爾比為1 : 2 ：2分別加入47.9 mg EDC以及54.3 mg Sulfo-NHS，混合液室溫振蕩反應 0.5 h。磁 架回收磁珠，以 10 mL 0.1 mol/L 硼酸

6、鹽緩沖液（ pH 5.0 ）洗滌 磁珠兩次。將 10 倍于磁珠表面羧基密度的對氨基苯磺酸溶液加 入活化磁珠體系，溶液調至 pH 8.0，室溫下振蕩反應2 h。磁架 回收磁珠，制備好的磺酸化磁珠采用飽和食鹽水浸泡 1 h、3%NaOH 以及3% HCl浸泡洗滌各2 h，最后以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0 ）洗滌磁珠至pH值為中性，并將磁珠重懸于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 7.0 ）中，于4 C保存?zhèn)溆谩?.3磺酸化磁珠富集水體中 MG的檢測流程取10 mL魚塘水，加入適量磺酸化磁珠，振蕩混勻，避光靜置吸附10 min,磁架分離磁珠，以0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液

7、（pH5.0 ）洗滌磁珠一次， 200L洗脫溶劑洗脫磁珠吸附的 MG洗脫液經0.45m 濾膜過濾后直接用高效液相色譜法檢測。流動相為50mmol/L乙酸銨-乙腈緩沖液（4： 6, V/V, pH 4.5 ），洗脫液流 速為 1.0 mL/min； Sunfire C18色譜柱（250 mrW4.6 mm 5 mr）, 柱溫25 C;二極管陣列紫外檢測器，檢測波長618 nm樣品進樣量 20 mL。3結果與討論3.1 磺酸化磁珠的表征 采用微乳法合成的磁珠經透射電鏡分析（圖1 ），粒徑分布大致范圍為70150 nm,大部分磁珠粒徑為100120 nm。圖 1 磁珠電鏡圖Fig1 TEM imag

8、e of magnetic beads 采用 EDC/Sulfo-NHS 法將對氨基苯磺酸基修飾至羧基化磁珠表面, 獲得的磺酸化磁珠 用傅立葉紅外光譜儀掃描分析。其紅外圖譜與羧基化磁珠相比, 在1174 cm1處出現(xiàn)了一個新峰，該峰由磺酸基團中SO鍵的對稱伸縮振動產生, 說明磁珠表面存在磺酸基團。 測得磺酸基修飾 以及羧基修飾磁珠的 Zeta 電位分別為 28.182 和 21.932 mV, 存在一定的差異?；撬峄c羧基相比，具有更低的pKa值?；撬峄黾恿舜胖楸砻娴?Zeta 電位,有利于磁珠在水相中的分散, 同時增強了磁珠對溶液中陽離子物質（如孔雀石綠）的吸附,且 使富集過程不易受溶液

9、pH值以及其它離子的干擾。3.2磺酸化磁珠富集水體中 MG的條件優(yōu)化321 pH值對磁珠富集水體中 MG勺影響 溶液中MG勺電離 度及磁珠表面的Zeta電位是影響磁珠靜電吸附 MG勺重要因素。 因此，溶液的pH值是影響磁珠富集水體中 MG勺主要因素。取經 LC-MS確證不含MG勺魚塘水10 mL分別加入MG至終濃度為0.5g/L。用1 mol/L NaOH或HCI調節(jié)魚塘水分別至 pH 3, 4, 5和6,再分別加入5 mg磁珠富集溶液中的 MG用高效液相色 譜法測定MG勺富集量，計算回收率，結果見表1。從表1可見，在pH 36之間，磺酸化磁珠對水體中MG勻有較好的吸附效率(均大于69.3%)

10、;在pH= 4.0時，吸附效率達到最高82.4%土 5.5%。MG勺 pKa= 6.90，在 pH 4.0 時，MG完全離子化， 帶正電荷；磺酸基的pKa= 0.70，在pH 4.0時，磺酸基的酸式 解離幾乎不受影3.2.2不同洗脫液對回收率的影響 在不含MG勺魚塘水中 添加MG至終濃度為0.5g/L，調節(jié)pH至4.0。用5 mg磺酸化磁珠富集10 mL上述 魚塘水中的MG磁架分離磁珠后，分別用不同體積比的甲醇 -氨 水混合液(90 : 10, 80 : 20, 70 : 30, V/V)及純乙腈4種洗脫 溶劑洗脫磁珠上的 MG洗脫溶劑用量為200L。用不同洗脫溶劑洗脫時的MG回收率見表2。從

11、表2可見，4種洗脫溶劑 對回收率的影響差異不大, 為了便于液相色譜分析, 本研究選擇 純乙腈作為洗脫溶劑。3.3 磺酸化磁珠吸附模式及飽和吸附容量的研究在25 C, pH 4.0的條件下，取2 mg磺酸化磁珠富集10 mL 水體中MG其中MG農度為550g/L。依據(jù)MG濃度及磺酸化磁珠吸附量繪制吸附等溫線（見 圖2）。通過擬合等溫吸附方程分析磺酸化磁珠對MG勺吸附機制，并推算磁珠的飽和吸附容量。圖2磁珠吸附魚塘水中MG勺吸附等溫線Fig 2 Adsorption isotherm of MG on magnetic beads其吸附行為可用 Langmuir 吸附方程描述：Ce/q = 1/

12、（Kqn） + Ce/qm其中，q為吸附達平衡時單位質量磁珠對MG 勺吸附量（g/g ） , Ce為吸附達平衡時MG勺濃度（g/L ） , qm為單位質量磁珠對 MG的最大吸附容量（g/g ） , K為Langmuir吸附平衡常數(shù)（L/g ）。以Ce為橫坐標，Ce/q為縱坐標作圖，可得到一條直 線。擬合得的線性方程為 Y= 0.015X + 0.04，相關系數(shù)R2= 0.9978。說明磁珠對MG的模式為單分子層吸附。根據(jù)等溫吸附 方程推算，磁珠對MG勺飽和吸附容量為66.67g/g , K= 0.375 L/g。3.4水體中MG濃度對磺酸化磁珠吸附回收率的影響， Gao S. Food Che

13、m.,在25 C, pH 4.0的條件下，用5 mg磺酸化磁珠富集10 mL 魚塘水中MG其中MG濃度為0.0510g/L ,用高效液相色譜法測定 MG勺富集量，計算回收率。 不同MG濃度時的回收率見表 3。結果顯示，水體中MG濃度在010g/L 之間吸附回收率無顯著性差異，均大于80。3.5磁珠的重復使用性磁珠的重復使用性在其實際應用中具有重要意義。 本研究考 察了磺酸化磁珠重復使用 5 次的平均回收率。在 25 C， pH 4.0 的條件下，用 5 mg 磺酸化磁珠，富集 10 mL MG濃度為1g/L的魚塘水中的MG使用后的磁珠按2.2.2節(jié)進行活化 預處理并重復使用5次，分別計算5次的

14、MG回收率。結果表明， 經過 5 次使用后，回收率未見明顯下降，均大于 80%。3.6魚塘水實際樣品的測定針對不同疾病，池塘中 MG使用濃度為0.0020.5 mg/L。 取南昌市周邊 48 份魚塘水實際樣品，按 3.2 節(jié)優(yōu)化后的方法富 集其中的MG采用高效液相色譜法檢測 MG含量。其中只有1份 水樣檢出含孔雀石綠，含量為 0.12g/L ,說明本方法可用于實際魚塘水樣品中MG的檢測。References?A1 Yuan J, Liao L, Xiao X, He B2009,113(4) :1377 1383?V A2 Pourreza N, Elhami S. Anal. Chim. A

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21、 acid onto carboxyl surface of magnetic beads with 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl )carbo-diimide ( EDC) /N-hydroxysulfo succinimide (Sulfo-NHS ) method. Those beads were used as dispersive solid phase extraction sorbent, and hence, a high efficient extraction procedure was developed for enriching trace amounts of malachite green ( MG) in fishpond water. Parameters of adsorption and desorption of MG in