酶分子修飾(2)課件

1、1 上節(jié)課主要內(nèi)容回顧上節(jié)課主要內(nèi)容回顧 從酶的生產(chǎn)到酶的改性從酶的生產(chǎn)到酶的改性 酶分子修飾酶分子修飾 所要解決的問(wèn)題和修飾的目標(biāo)所要解決的問(wèn)題和修飾的目標(biāo) 酶分子修飾的種類(lèi)酶分子修飾的種類(lèi) 側(cè)鏈基團(tuán)修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾 2 酶的改性（酶的改性（enzymic improvingenzymic improving）：通過(guò)各種方法：通過(guò)各種方法 使酶的催化特性得以改進(jìn)的技術(shù)過(guò)程。使酶的催化特性得以改進(jìn)的技術(shù)過(guò)程。 酶改性的技術(shù)酶改性的技術(shù) l 酶分子的修飾酶分子的修飾 l 酶固定化酶固定化 l 酶的非水相催化酶的非水相催化 l 酶的定向進(jìn)化酶的定向進(jìn)化 l 3 酶分子修飾酶分子修飾 通過(guò)各種方法使

2、通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變， 從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程從而改變酶的某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程 稱(chēng)為酶分子修飾。稱(chēng)為酶分子修飾。 4 4.1 4.1 概述概述 2 2、酶分子修飾的原因、酶分子修飾的原因 細(xì)胞外穩(wěn)定性差；細(xì)胞外穩(wěn)定性差； 酶活性不夠高；酶活性不夠高； 具有抗原性。具有抗原性。 5 4.1 4.1 概述概述 4 4、酶分子修飾的目的、酶分子修飾的目的 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用范圍。 （7070年代末之后）年代末之后） 提高酶的

3、生物活性（酶活力）。提高酶的生物活性（酶活力）。 增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。 消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能 力）。力）。 產(chǎn)生新的催化能力。產(chǎn)生新的催化能力。 6 4.4 4.4 酶分子的修飾方法酶分子的修飾方法 金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾 大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾 側(cè)鏈基團(tuán)修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾 肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾 酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 7 氨基酸側(cè)鏈基 團(tuán) 修飾劑 Lys（賴(lài)）氨基三硝基苯磺酸，2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、 碘

4、乙酰胺、丹磺酰氯、亞硝酸 Asp、Glu （天冬、谷） 羧基碳化二亞胺 Arg（精）胍基苯乙二醛，1,2環(huán)己二酮、丁二酮 Cys（半胱） 巰基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基馬來(lái)酰亞胺 二硫鍵巰基乙醇、DTT（二硫蘇糖醇） His（組）咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸 Tyr（酪）酚羥基碘、四硝基甲烷 Trp（色）吲哚基N-溴代琥珀酰亞胺 各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑各種氨基酸側(cè)鏈的修飾劑 8 4. 4. 酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾）酶蛋白主鏈修飾（肽鏈有限水解修飾） 利用酶分子利用酶分子主鏈的切斷和連接主鏈的切斷和連接，使酶分子的化學(xué)，使酶分子的化學(xué) 結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的結(jié)構(gòu)及其空

5、間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的 特性和功能的方法。特性和功能的方法。 主鏈的主鏈的切斷切斷修飾修飾 9 1 1）主鏈的切斷引起酶活性中心的破壞，酶將喪失其）主鏈的切斷引起酶活性中心的破壞，酶將喪失其 活性?；钚浴?主要用于主要用于探測(cè)酶活性中心的位置探測(cè)酶活性中心的位置。 2 2）主鏈切斷后仍可維持酶活性中心的空間構(gòu)象，酶）主鏈切斷后仍可維持酶活性中心的空間構(gòu)象，酶 的催化能力保持不變或損失不多，其抗原性等特的催化能力保持不變或損失不多，其抗原性等特 性發(fā)生改變。性發(fā)生改變。 提高提高某些酶特性特別是某些酶特性特別是藥用酶的使用價(jià)值藥用酶的使用價(jià)值。 3 3）主鏈切斷有利于酶活性中心的形成，

6、使酶分子顯）主鏈切斷有利于酶活性中心的形成，使酶分子顯 示其催化功能，使酶活力提高。示其催化功能，使酶活力提高。 酶原酶原酶酶 主鏈的切斷修飾主鏈的切斷修飾 10 胃蛋白酶原 胃蛋白酶 N N端失去端失去4444個(gè)個(gè) 氨基酸殘基氨基酸殘基 HClHCl pH1.5pH1.52 2 自身激活自身激活 a a、胃蛋白酶原的激活、胃蛋白酶原的激活 11 5. 5. 酶組成單位置換修飾酶組成單位置換修飾 氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾：將蛋白酶分子肽鏈上的某一個(gè)：將蛋白酶分子肽鏈上的某一個(gè) 氨基酸換成另一個(gè)氨基酸的修飾方法。氨基酸換成另一個(gè)氨基酸的修飾方法。 核苷酸置換修飾核苷酸置換修飾：將核酸類(lèi)酶核苷

7、酸鏈上的某一：將核酸類(lèi)酶核苷酸鏈上的某一 個(gè)核苷酸換成另一個(gè)核苷酸的修飾方法。個(gè)核苷酸換成另一個(gè)核苷酸的修飾方法。 12 （1 1）酶分子組成單位修飾的作用）酶分子組成單位修飾的作用 通過(guò)修飾可以提高酶活力通過(guò)修飾可以提高酶活力 通過(guò)修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性通過(guò)修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 通過(guò)修飾可以使酶的專(zhuān)一性發(fā)生改變通過(guò)修飾可以使酶的專(zhuān)一性發(fā)生改變 通過(guò)核苷酸置換修飾可獲得各種人造核酸類(lèi)酶。通過(guò)核苷酸置換修飾可獲得各種人造核酸類(lèi)酶。 如：酪氨酸如：酪氨酸-RNA-RNA合成酶合成酶 反應(yīng)：催化酪氨酸與其對(duì)應(yīng)的反應(yīng)：催化酪氨酸與其對(duì)應(yīng)的tRNAtRNA反應(yīng)生成酪反應(yīng)生成酪 氨酰氨酰-tRNA-tR

8、NA 置換：將置換：將5151位的位的蘇氨酸蘇氨酸換為換為脯氨酸脯氨酸 結(jié)果：酶對(duì)結(jié)果：酶對(duì)ATPATP的親和性提高近的親和性提高近100100倍，酶活力倍，酶活力 提高提高2525倍。倍。 如：枯草桿菌的蛋白酶如：枯草桿菌的蛋白酶 反應(yīng)：催化蛋白質(zhì)和多肽水解反應(yīng)：催化蛋白質(zhì)和多肽水解 置換：活性中心上的置換：活性中心上的絲氨酸絲氨酸換成換成半胱氨酸半胱氨酸 結(jié)果：酶對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解活性消失，出結(jié)果：酶對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解活性消失，出 現(xiàn)催化硝基苯酯等底物進(jìn)行水解反應(yīng)的活性?，F(xiàn)催化硝基苯酯等底物進(jìn)行水解反應(yīng)的活性。 采用核苷酸置換修飾技術(shù)將保守核苷酸采用核苷酸置換修飾技術(shù)將保守核苷酸 以外

9、的某個(gè)或某些核苷酸置換，就可以獲得各種以外的某個(gè)或某些核苷酸置換，就可以獲得各種 不同的人造核酸類(lèi)酶。不同的人造核酸類(lèi)酶。 如：如：T T4 4- -溶菌酶溶菌酶 置換：第置換：第3 3位的位的異亮氨酸異亮氨酸換成換成半胱氨酸半胱氨酸，半胱氨，半胱氨 酸可與第酸可與第9797位的半胱氨酸形成位的半胱氨酸形成二硫鍵。二硫鍵。 結(jié)果：酶活力保持不變，但酶對(duì)熱的穩(wěn)定性大結(jié)果：酶活力保持不變，但酶對(duì)熱的穩(wěn)定性大 大提高。大提高。 13 氨基酸置換修飾的方法氨基酸置換修飾的方法 化學(xué)修飾法化學(xué)修飾法 定點(diǎn)突變技術(shù)定點(diǎn)突變技術(shù) 14 （2 2）定點(diǎn)突變技術(shù)在酶分子修飾中的應(yīng)用）定點(diǎn)突變技術(shù)在酶分子修飾中的

10、應(yīng)用 定點(diǎn)突變（定點(diǎn)突變（site directed mutagenesis site directed mutagenesis ）： 指指DNADNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改 變，從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì)變，從而獲得突變基因的操作技術(shù)。是蛋白質(zhì) 工程（工程（protein engineeringprotein engineering）和酶分子組成）和酶分子組成 單位置換修飾中常用的技術(shù)。單位置換修飾中常用的技術(shù)。 15 定點(diǎn)突變技術(shù)用于酶分子修飾的主要過(guò)程定點(diǎn)突變技術(shù)用于酶分子修飾的主要過(guò)程（P148P148） 1. 1. 設(shè)計(jì)新酶分子

11、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)新酶分子結(jié)構(gòu) 設(shè)計(jì)新酶的設(shè)計(jì)新酶的RNARNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的的核苷酸排列次序或酶蛋白的 氨基酸排列次序，確定需置換的核苷酸或氨基酸氨基酸排列次序，確定需置換的核苷酸或氨基酸 及其位置。及其位置。 2. 2. 確定突變基因堿基序列確定突變基因堿基序列 酶酶RNARNA互補(bǔ)原則互補(bǔ)原則DNADNA序列序列 酶蛋白酶蛋白遺傳密碼遺傳密碼mRNA DNAmRNA DNA 3. 3. 獲得突變基因獲得突變基因 寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變。寡核苷酸誘導(dǎo)的定位突變。 4. 4. 獲得新酶獲得新酶 獲得基因體外重組后導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。獲得基因體外重組后導(dǎo)入宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。 16 6. 6.

12、酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 通過(guò)物理修飾，可以了解通過(guò)物理修飾，可以了解不同物理?xiàng)l件不同物理?xiàng)l件下，特下，特 別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端別是在極端條件下（高溫、高壓、高鹽、極端 pHpH值等）由于酶分子值等）由于酶分子空間構(gòu)象空間構(gòu)象的改變而引起酶的改變而引起酶 的特性和功能的變化情況。的特性和功能的變化情況。 特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分特點(diǎn)在于不改變酶的組成單位及其基團(tuán)，酶分 子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的子中的共價(jià)鍵不發(fā)生改變，只是在物理因素的 作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。作用下，副鍵發(fā)生某些變化和重排。 共價(jià)鍵與副鍵共價(jià)鍵與副鍵 17 酶分

13、子修飾的應(yīng)用酶分子修飾的應(yīng)用 理論研究理論研究 醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用醫(yī)學(xué)和工業(yè)應(yīng)用 酶的作用機(jī)制研究酶的作用機(jī)制研究 親和標(biāo)記法和差示標(biāo)記法親和標(biāo)記法和差示標(biāo)記法 有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用 18 酶分子的修飾方法酶分子的修飾方法 金屬離子置換修飾金屬離子置換修飾 大分子結(jié)合修飾大分子結(jié)合修飾 側(cè)鏈基團(tuán)修飾側(cè)鏈基團(tuán)修飾 肽鏈有限水解修飾肽鏈有限水解修飾 氨基酸置換修飾氨基酸置換修飾 酶分子的物理修飾酶分子的物理修飾 氨基的修飾氨基的修飾 羧基的修飾羧基的修飾 巰基的修飾巰基的修飾 精氨酸胍基的修飾精氨酸胍基的修飾 酪氨酸酚基的修飾酪氨酸酚基的修飾 組氨酸咪唑基的修飾組氨酸咪

14、唑基的修飾 色氨酸吲哚基的修飾色氨酸吲哚基的修飾 分子內(nèi)交聯(lián)修飾分子內(nèi)交聯(lián)修飾 19 20 4.6 4.6 酶的定向進(jìn)化酶的定向進(jìn)化 定向進(jìn)化：模擬自然進(jìn)化的過(guò)程，進(jìn)行定向進(jìn)化：模擬自然進(jìn)化的過(guò)程，進(jìn)行人工隨人工隨 機(jī)突變機(jī)突變，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行，并在特定的環(huán)境條件下進(jìn)行選擇選擇，使，使 進(jìn)化朝著進(jìn)化朝著人們所需方向人們所需方向發(fā)展的技術(shù)過(guò)程。發(fā)展的技術(shù)過(guò)程。 定向進(jìn)化定向進(jìn)化 分子定向進(jìn)化分子定向進(jìn)化 細(xì)胞定向進(jìn)化細(xì)胞定向進(jìn)化 酶分子定向進(jìn)化酶分子定向進(jìn)化 蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化蛋白質(zhì)分子定向進(jìn)化 核酸分子定向進(jìn)化核酸分子定向進(jìn)化 微生物細(xì)胞定向進(jìn)化微生物細(xì)胞定向進(jìn)化 植物細(xì)胞定向進(jìn)化植

15、物細(xì)胞定向進(jìn)化 動(dòng)物細(xì)胞定向進(jìn)化動(dòng)物細(xì)胞定向進(jìn)化 21 酶分子的定向進(jìn)化酶分子的定向進(jìn)化（directed evolutiondirected evolution）：）： 模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇），模擬自然進(jìn)化過(guò)程（隨機(jī)突變和自然選擇）， 在在體外體外進(jìn)行酶基因的人工進(jìn)行酶基因的人工隨機(jī)突變隨機(jī)突變，建立突變建立突變 基因文庫(kù)基因文庫(kù)，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，在人工控制條件的特殊環(huán)境下，定定 向選擇向選擇得到具有優(yōu)良催化特性的酶的得到具有優(yōu)良催化特性的酶的突變體突變體的的 技術(shù)過(guò)程。技術(shù)過(guò)程。 屬于蛋白質(zhì)的屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)非合理設(shè)計(jì)，它，它不需事先了解不需事先了解 酶的

16、空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制。 22 適應(yīng)面廣；適應(yīng)面廣； 目的性強(qiáng)；目的性強(qiáng)； 效率高。效率高。 23 以很低的比率向目的基因中以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變隨機(jī)引入突變，構(gòu)建突，構(gòu)建突 變庫(kù)，憑借變庫(kù)，憑借定向的選擇方法定向的選擇方法，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化，選出所需性質(zhì)的優(yōu)化 酶酶( (或蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)) )，從而排除其他突變體。，從而排除其他突變體。 定向進(jìn)化的定向進(jìn)化的基本規(guī)則基本規(guī)則是是“獲取你所篩選的突變體獲取你所篩選的突變體”。 定向進(jìn)化定向進(jìn)化= =隨機(jī)突變隨機(jī)突變+ +定向選擇定向選擇。 24 4.6.3 4.6.3 酶基因的隨機(jī)突變酶基因的隨機(jī)突變 1 1

17、、易錯(cuò)、易錯(cuò)PCRPCR技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化技術(shù)為代表的無(wú)性進(jìn)化 無(wú)性突變無(wú)性突變：向：向單一酶分子單一酶分子基因內(nèi)隨機(jī)引入突變，基因內(nèi)隨機(jī)引入突變， 制造突變酶庫(kù)以便篩選。制造突變酶庫(kù)以便篩選。 易錯(cuò)易錯(cuò)PCRPCR：從酶的：從酶的單一基因單一基因出發(fā)，在出發(fā)，在改變反應(yīng)條改變反應(yīng)條 件件的情況下進(jìn)行的情況下進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)，使擴(kuò)增得到的基，使擴(kuò)增得到的基 因出現(xiàn)堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù)因出現(xiàn)堿基配對(duì)錯(cuò)誤，從而引起基因突變的技術(shù) 過(guò)程。過(guò)程。 反應(yīng)條件：提高反應(yīng)條件：提高M(jìn)gMg2+ 2+濃度；添加 濃度；添加MnMn2+ 2+；改變四 ；改變四 種底物濃度比等。種底

18、物濃度比等。 25 易錯(cuò)易錯(cuò)PCRPCR技術(shù)技術(shù) 特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，隨機(jī)突變豐富。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，隨機(jī)突變豐富。 缺點(diǎn)：正突變基因少，需多次缺點(diǎn)：正突變基因少，需多次PCRPCR。 注意：控制好基因突變頻率。注意：控制好基因突變頻率。 適用：較小基因的定向進(jìn)化。適用：較小基因的定向進(jìn)化。 26 2 2、DNADNA重排技術(shù)為代表的有性進(jìn)化重排技術(shù)為代表的有性進(jìn)化 又稱(chēng)又稱(chēng)DNADNA改組技術(shù)，有性改組技術(shù)，有性PCRPCR （sexual PCRsexual PCR）。從正突變基因文庫(kù)中分離得到的）。從正突變基因文庫(kù)中分離得到的 同源同源DNADNA，用酶切割成隨機(jī)片段，經(jīng)過(guò)不加引物的，用酶切割

19、成隨機(jī)片段，經(jīng)過(guò)不加引物的 多次多次PCRPCR循環(huán)，使循環(huán)，使DNADNA的堿基序列重新排布而引起基的堿基序列重新排布而引起基 因突變的技術(shù)過(guò)程。因突變的技術(shù)過(guò)程。 27 28 DNADNA改組技術(shù)改組技術(shù) 特點(diǎn)：正突變頻率高，進(jìn)化速度快。特點(diǎn)：正突變頻率高，進(jìn)化速度快。 注意：需多次進(jìn)行。注意：需多次進(jìn)行。 29 3 3、基因家族之間的同源重組、基因家族之間的同源重組 從自然界中存在的基因家族出發(fā)，從自然界中存在的基因家族出發(fā)， 利用它們之間的同源順序進(jìn)行利用它們之間的同源順序進(jìn)行DNADNA改組實(shí)現(xiàn)同改組實(shí)現(xiàn)同 源重組。源重組。 如：如：StemmerStemmer等從等從4 4種微生物

20、種微生物中選擇編碼頭孢中選擇編碼頭孢 菌素酶的菌素酶的4 4個(gè)同源基因個(gè)同源基因，對(duì)它們進(jìn)行單獨(dú)進(jìn)化或，對(duì)它們進(jìn)行單獨(dú)進(jìn)化或 同源重組進(jìn)化。結(jié)果對(duì)同源重組進(jìn)化。結(jié)果對(duì)單基因進(jìn)化單基因進(jìn)化得到的突變酶得到的突變酶 中，對(duì)頭孢羥羧氧胺的抗性最高的中，對(duì)頭孢羥羧氧胺的抗性最高的增加了增加了8 8倍倍， 而用而用家族同源重組進(jìn)化家族同源重組進(jìn)化的方法使抗性比其中兩種的方法使抗性比其中兩種 微生物來(lái)源的天然酶提高微生物來(lái)源的天然酶提高270270倍倍，比另外兩種酶，比另外兩種酶 提高了提高了540540倍倍。 30 雜合酶：把來(lái)自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是雜合酶：把來(lái)自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元或是 整個(gè)酶

21、分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需整個(gè)酶分子進(jìn)行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需 性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。 31 定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過(guò)定向進(jìn)化中，突變具有隨機(jī)性，但通過(guò) ，加之控制實(shí)驗(yàn)條件，加之控制實(shí)驗(yàn)條件， 限定突變種類(lèi)，限定突變種類(lèi)， 降低突變率，縮小突變庫(kù)的容量，降低突變率，縮小突變庫(kù)的容量， 這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一這不僅減少了工作量，更重要的是加快了酶在某一 方向的進(jìn)化速度。方向的進(jìn)化速度。 。另有。另有 一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見(jiàn)光信號(hào)的一些其他的篩選方法，如加入能產(chǎn)生可見(jiàn)光信號(hào)的 底物或利用綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。底物或利用

22、綠色熒光蛋白的熒光性質(zhì)等。 32 1 1、突變基因文庫(kù)的構(gòu)建、突變基因文庫(kù)的構(gòu)建 定義：將各種不同定義：將各種不同突變基因突變基因與與載體重組載體重組，再轉(zhuǎn)入，再轉(zhuǎn)入 適宜的細(xì)胞或包裝成重組適宜的細(xì)胞或包裝成重組噬菌體的技術(shù)過(guò)程。噬菌體的技術(shù)過(guò)程。 質(zhì)量要求：文庫(kù)質(zhì)量要求：文庫(kù)包容性包容性和文庫(kù)和文庫(kù)完整性完整性 過(guò)程：過(guò)程： l載體選擇載體選擇 l基因重組基因重組 l形成基因文庫(kù)形成基因文庫(kù) 質(zhì)粒質(zhì)粒 噬菌體噬菌體DNADNA 黏粒載體黏粒載體 噬菌粒載體噬菌粒載體 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo) 33 2 2、突變基因的篩選、突變基因的篩選 （1 1）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定）定向選擇環(huán)境條件的設(shè)定 （

23、2 2）高通量篩選技術(shù)）高通量篩選技術(shù) l平板篩選技術(shù)平板篩選技術(shù) l熒光篩選法熒光篩選法 l噬菌體表面展示法噬菌體表面展示法 l酵母細(xì)胞表面展示法酵母細(xì)胞表面展示法 34 舉例舉例 例例1 1：定向進(jìn)化提高枯草芽孢桿菌脂肪酶的活力：定向進(jìn)化提高枯草芽孢桿菌脂肪酶的活力 例例2 2：大腸桿菌堿性磷酸酶的體外定向進(jìn)化研究：大腸桿菌堿性磷酸酶的體外定向進(jìn)化研究 例例3 3：采用易錯(cuò)：采用易錯(cuò)PCRPCR對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶對(duì)粘質(zhì)沙雷氏菌幾丁質(zhì)酶C C進(jìn)行進(jìn)行 定向進(jìn)化定向進(jìn)化 35 酶酶性質(zhì)性質(zhì)突變方法突變方法 枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶E E有機(jī)相活性有機(jī)相活性/ /穩(wěn)定性穩(wěn)定性易錯(cuò)易錯(cuò)PC

24、RPCR -內(nèi)酰胺酶內(nèi)酰胺酶總活力總活力/ /底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性DNADNA改組改組 枯草桿菌蛋白酶枯草桿菌蛋白酶BPNBPN穩(wěn)定性穩(wěn)定性 盒式誘變盒式誘變 對(duì)硝基苯酯酶對(duì)硝基苯酯酶底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性/ /有機(jī)相活性有機(jī)相活性易錯(cuò)易錯(cuò)PCR/DNAPCR/DNA改組改組 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性盒式誘變盒式誘變 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性DNADNA改組改組 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白熒光熒光DNADNA改組改組 核酶核酶底物專(zhuān)一性底物專(zhuān)一性易錯(cuò)易錯(cuò)PCR/DNAPCR/DNA改組改組 天冬氨酸酶天冬氨酸酶活性與穩(wěn)定性活性與穩(wěn)定性隨機(jī)隨機(jī)/ /定位

25、誘變定位誘變 藥物和疫苗藥物和疫苗活性活性/ /專(zhuān)一性專(zhuān)一性/ /最佳表達(dá)最佳表達(dá)DNADNA改組改組 36 4.7 4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157P152-157） 在在酶學(xué)研究酶學(xué)研究方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 在在醫(yī)藥醫(yī)藥方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 在在工業(yè)工業(yè)方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 在在抗體酶抗體酶研究開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用研究開(kāi)發(fā)方面的應(yīng)用 在在核酸類(lèi)酶核酸類(lèi)酶人工改造方面的應(yīng)用人工改造方面的應(yīng)用 在在有機(jī)介質(zhì)酶催化有機(jī)介質(zhì)酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用反應(yīng)中的應(yīng)用 37 4.7 4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157P152-157） 1 1、在、在酶學(xué)研究酶學(xué)研

26、究方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 l酶活性中心的研究酶活性中心的研究 l酶的空間結(jié)構(gòu)研究酶的空間結(jié)構(gòu)研究 l酶的作用機(jī)制研究酶的作用機(jī)制研究 38 4.7 4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157P152-157） 2 2、在、在醫(yī)藥醫(yī)藥方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 l降低或者消除酶的抗原性降低或者消除酶的抗原性 l增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性（半衰期）增強(qiáng)醫(yī)藥用酶的穩(wěn)定性（半衰期） 39 4.7 4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（酶分子修飾的應(yīng)用（P152-157P152-157） 3 3、在、在工業(yè)工業(yè)方面的應(yīng)用方面的應(yīng)用 l提高工業(yè)用酶的催化效率提高工業(yè)用酶的催化效率 l提高工業(yè)用酶的穩(wěn)定性提高工業(yè)用酶的穩(wěn)定性 l改變酶的動(dòng)力學(xué)特性改變酶的動(dòng)力學(xué)特性 40 4.7 4.7 酶分子修飾的應(yīng)用（酶分子修飾的