糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化逆轉(zhuǎn)可能性的研究

1、DOC格式論文，方便您的復(fù)制修改刪減糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化逆轉(zhuǎn)可能性的研究（作者：?jiǎn)挝唬亨]編：）作者：方開(kāi)云 婁晶磊 肖瑛 石明雋 桂華珍 郭兵 張國(guó)忠【摘要】 目的 動(dòng)態(tài)觀察u擬平滑肌肌動(dòng)蛋白（u擬SMA和 目以鈣 黏素（E擬cadherin ）在糖尿?。―M大鼠腎組織中的表達(dá)，探討糖 尿病腎?。―N大鼠腎臟纖維化逆轉(zhuǎn)的可能性。方法 選擇SD大鼠隨 機(jī)分為正常對(duì)照組、DM組和胰島素治療組，鏈脲佐菌素（STZ誘發(fā) 大鼠DM正常對(duì)照組和DM組按病程分為2、4、& 12、16、20和24 w組，胰島素治療組從第13周起用胰島素控制血糖至正常水平，分 為16、20和24 w組。檢測(cè)各組血糖、24

2、h尿蛋白、血肌酐（Scr） 和腎臟指數(shù)（Rl）; PAS染色光鏡觀察腎臟病理改變；免疫組化檢測(cè) 腎皮質(zhì)u擬SMA和纖連蛋白（FN的表達(dá)；Western印跡檢測(cè)腎皮質(zhì) u擬SMA和E擬cadherin蛋白表達(dá)量；RTIPCR檢測(cè)腎皮質(zhì)u擬SMA 和FN mRN水平。結(jié)果DM組大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI均較 正常對(duì)照組明顯升高（Pv 0.05,P V 0.01 ），胰島素治療組上述指標(biāo)均 較DM組顯著降低（Pv 0.05,P V 0.01 ）。正常大鼠u擬SMA只在血管 壁表達(dá)，DM組2 w開(kāi)始有少量間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)有陽(yáng)性染色，隨病程進(jìn)展間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性染色增多；8w時(shí)腎小球系膜細(xì)胞胞漿內(nèi)見(jiàn)

3、陽(yáng)性表 達(dá)；從16 w開(kāi)始在DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞可見(jiàn)a擬SMA蛋白陽(yáng)性表 達(dá)，胰島素治療組未見(jiàn)表達(dá)；DM組腎皮質(zhì)a擬SMA和FN蛋白與mRNA 表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著增多（PV 0.01 ）,胰島素治療組則顯著低于DM（Pv0.01 ）； DM組取匕adherin蛋白的表達(dá)水平較正常對(duì)照 組顯著降低（Pv0.01 ）,而胰島素治療組顯著高于 DM組（Pv0.01 ）。 結(jié)論 控制血糖可使DN大鼠腎臟一定程度的纖維化逆轉(zhuǎn)，其機(jī)制可能 與腎臟固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變被抑制或反轉(zhuǎn)有關(guān)?！娟P(guān)鍵詞】a擬平滑肌肌動(dòng)蛋白；E；丿:鈣黏素；糖尿病腎病；大鼠【Abstract Objective To dynami

4、c observe the expressions of a ftismooth muscle actin（a 擬、SMA） and E扌以cadherintoinvestigatethe possibility of renal fibrosis reverse indiabetic nephropathy rats. Methods Streptozotocin 擬 induced diabetic rats were randomly divided into 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24 w and 16, 20, 24 wtreatment groups.The t

5、reatment groups were treated with in suli n to con trol blood glucose to no rmal level beginning from the 13 th week. Normal controlgroups wereselected in age擬matching points respectively. Blood glucose,24 h urine prote in, serum creati nine (Scr), renal in dex(RI)of rats were measured. PAS sta inin

6、g was used to observe the renal pathological cha nges. Immun ohistochemicalsta ining,Western blott ing and RT SaPCR were employed to determ ine theexpressionsof a 扌以SMA, E扌以cadherin and fibronectin(FN).Results Comparedwith control group and insulin 拎；treated rats, blood glucose, 24 h urinary protein

7、 excretion,Scr, and RI werein creased remarkably in diabetic rats (Pv 0.05, P v 0.01). I ndiabetic rats, interstitial,mesangial cells and tubulestainings of a 擬SMA were seen at the 2, 8 and 16 th week respectively. The a 擬SMA and FN protein and mRNAwere sig ni fica ntlyupH regulatedin diabetic rats,

8、 whiledowA regulated in the in sulin擬 treated diabetic rats (Pv0.01). The expression of E擬cadherin protein in the cortex was contraryto the expressionof a 擬SMA. ConclusionsRenalfibrosis at early stage in diabetic nephropathy rats can be reversed whe n blood glucose was con trolled and the mecha nism

9、 mayinvoIve in blocking or reversing the phenotypic transition of renal reside nt cells.【Key wordsa 擬SMA;E擬cadherin; Diabetic nephropathy; Rat糖尿病腎病(DN是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要病因，腎小管 擬間質(zhì) 纖維化是DN重要的病理改變。過(guò)去認(rèn)為腎臟纖維化是不可逆轉(zhuǎn)的， 近年研究表明，部分腎臟纖維化可以逆轉(zhuǎn)1, 2,但DN腎臟纖維化 是否可以逆轉(zhuǎn)及其機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。腎臟纖維化的基本病理改變是細(xì)胞外基質(zhì)(ECM的過(guò)度沉積，進(jìn)而取代了腎臟固有細(xì)胞，破壞 腎臟正

10、常結(jié)構(gòu)。a擬平滑肌肌動(dòng)蛋白(a擬SMA是成纖維細(xì)胞活化和 肌成纖維細(xì)胞(MFB)的標(biāo)志性蛋白，因此我們通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察a 擬SMA E擬鈣黏素(E擬.cadherin)和纖連蛋白(FN)在糖尿病(DM發(fā)展過(guò)程及 胰島素治療后大鼠腎皮質(zhì)中的表達(dá)，初步探討 DN腎臟纖維化逆轉(zhuǎn)的 可能性及其機(jī)制。1材料與方法1.1動(dòng)物SD大鼠，清潔級(jí)，雄性，體重180200 g,由上海西普爾 擬比凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供許可證號(hào)：Scxy (滬)200取10002。1.2 主要試劑 鏈脲佐菌素(STZ Sigma)，兔抗大鼠Ecadherin、FN多克隆抗體、小鼠抗大鼠a擬SMA和B擬actin單克隆抗體、羊抗 兔或小鼠

11、IgG擬HRP(Santa Cruz )、SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒、ECM試劑盒(武漢博士德)；EZ Spin Column RNA Purification Kit(BBI ) ， RevertAidTM FirstStrand cDNA Synthesis Kit(Ferme ntas)，Taq 酶(TaKaRa，a tSMA 卩“和 擬 act in 引物合 成(上海生工)。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 動(dòng)物模型及分組大鼠隨機(jī)分成正常對(duì)照組、DM組和胰島素治療組。正常對(duì)照組和 DM組又分為2、4、8、12、16、20和24 w組(n=6)，DM組予以尾靜脈注射STZ 55 mg/kg

12、，72 h后測(cè)血糖，血糖 16.7 mmol/L者入選。正常對(duì)照組注射同體積的 STZ溶媒。胰島素 治療組從第13周開(kāi)始皮下注射精蛋白鋅胰島素，實(shí)行個(gè)體化劑量， 以血糖控制在47 mmol/L,尿糖陰性為準(zhǔn)分為16、20和24 w組(n=6)。 所有大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。于處死前1d用代謝籠收集 24 h尿測(cè)尿蛋白；股動(dòng)脈取血測(cè)血糖、血肌酐（Scr）;處死大鼠，取 雙腎，分別于4%多聚甲醛固定及-80 C保存。132 生化指標(biāo)測(cè)定氧化酶法測(cè)血清葡萄糖，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)尿蛋 白,苦味酸法測(cè)Scr,均按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作（四川邁克科技有限責(zé)任 公司）。133 腎組織病理檢查 多聚甲醛固定之腎組

13、織制成 3卩m厚的石 蠟切片，行PAS染色，光鏡觀察腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。以腎重（ mg 與體重（g）比值作為腎臟指數(shù)（RI）。1.3.4 免疫組化石蠟切片脫蠟水化，經(jīng)微波熱修復(fù)抗原及5%BSA寸 閉后，分別加入u擬SMA（ 1 : 200）和FN抗體（1 : 100），4C孵育過(guò) 夜。加入生物素化二抗，室溫下孵育 30 min ;滴加SABC式劑；DAB 顯色。PBS代替一抗，作陰性對(duì)照。雙盲觀察染色切片，每張切片隨 機(jī)取10個(gè)不重復(fù)高倍（400倍）視野,計(jì)數(shù)細(xì)胞的陽(yáng)性染色，取均值表 示久ttiSMA的表達(dá)。FN的表達(dá)程度則參考郭兵等3方法計(jì)數(shù)，以 10個(gè)高倍視野的陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)取均值。1.3.5

14、Western印跡 取-80 C保存的腎皮質(zhì)100 mg加裂解液勻漿， 離心取上清測(cè)定蛋白含量，每泳道加 160卩g蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS：PAGE 垂直凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至 PVDF膜。5%兌脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗膜后分別加u擬SMA抗體（1 : 400）和E以cadherin （1 : 200） 4C 孵育過(guò)夜；加相應(yīng)二抗室溫孵育 2 h，ECL試劑曝光顯影。用抗體剝脫液剝脫抗體后，按同樣的方法與B 擬act in抗體（1 : 300）孵育。 凝膠成像系統(tǒng)（ChmioDox,Bio擬Rad）和Quantity One軟件進(jìn)行圖像分 析。以B擬act in蛋白條帶作內(nèi)參照，結(jié)果用靶蛋白

15、/ B擬act in比值 表示。136 RT 擬PCR按 EZ Spin Column RNA Purification Kit 說(shuō)明提 取總RNA核酸蛋白分析儀檢測(cè)含量，RNA勺吸光度（A）260 nm/280 nm比值均在1.92.0，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA PCR的引物序列、退火溫 度及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度見(jiàn)表1。PCF產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成 像系統(tǒng)掃描分析。結(jié)果用靶基因/ B擬act in比值表示。表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件引物序列片段長(zhǎng)度（bp）退火溫度C）循環(huán)數(shù)a擬SMA上游5 擬 CTCTGGTGTGTGACAATGGTCC 2565840 下游FN 上 游擬 cgaagc

16、tcgttatagaagGagtg擬 GCAAGCCTGAACCTGAAGaGACC 4466240上游 5擬 CCTGGTGTCCTGATCATTGCaTC B 擬 actin擬 GAAATCGTGCGTGACATTAAG49057.340 下游 5擬 ctagaagcatttgcgGTgga1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以x士 s表示，采用SPSS11.5軟件，組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，作單因素方差分析。2結(jié)果2.1生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 如表2所示DM組各時(shí)點(diǎn)的血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI較正常對(duì)照組明顯升高（Pv0.05,P v0.01 ），胰島素治 療組上述各指標(biāo)比相應(yīng)時(shí)點(diǎn) DM組明顯下降（

17、Pv0.01 ），與對(duì)照組相 比差異無(wú)顯著性（P 0.05）。2.2腎組織病理變化PAS染色（圖1）見(jiàn)正常大鼠腎小球及腎小管 結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整 ，間質(zhì)中未見(jiàn)炎癥 細(xì)胞浸潤(rùn)。DM組大鼠4 w后可見(jiàn)腎小球系膜區(qū)擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì) 胞變性，部分腎小管腔內(nèi)有細(xì)胞和管型，管腔擴(kuò)張，上皮細(xì)胞萎縮，間 質(zhì)有較多細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管基底膜不規(guī)則增厚，腎小管擬間質(zhì)PAS陽(yáng) 性染色物明顯增多。胰島素治療組大鼠腎臟病變均有不同程度改善，腎小球系膜區(qū)和腎小管擬間質(zhì)PAS染色陽(yáng)性物質(zhì)明顯減少，腎小管上 皮細(xì)胞病變明顯改善。2.3免疫組化結(jié)果 見(jiàn)表3。圖2示正常大鼠口擬SMA只在血管壁表 達(dá)。DM

18、組2 w開(kāi)始有少量間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)有陽(yáng)性染色，隨病程進(jìn)展 間質(zhì)細(xì)胞陽(yáng)性染色增多；8w時(shí)腎小球系膜細(xì)胞胞漿內(nèi)見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)； 16 w時(shí)部分糖尿病大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)。胰島 素治療組均未見(jiàn)間質(zhì)細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)a 擬SMA圖3示正常對(duì)照組大鼠腎小管基底膜及腎小球 FN呈線性表達(dá)， 腎間質(zhì)無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，糖尿病組大鼠腎小球及腎小管 擬間質(zhì)FN表達(dá)從 2 w開(kāi)始逐漸增多，12 w后持續(xù)在較高水平，主要表達(dá)在腎小管周?chē)?腎間質(zhì)和腎小球系膜區(qū)，胰島素治療組大鼠腎組織內(nèi)FN表達(dá)明顯減少。2.4 Western印跡結(jié)果 見(jiàn)表4和圖4。正常對(duì)照組大鼠腎皮質(zhì)有a 擬SMA表達(dá)，DM組

19、大鼠2 w其表達(dá)開(kāi)始增加，并隨病程的延長(zhǎng)而逐漸 增多（Pv 0.05 ）， 12 w時(shí)達(dá)咼峰，以后一直處于較咼水平。胰島素 治療組的表達(dá)則明顯下降（Pv 0.05 ） ,24 w時(shí)幾乎恢復(fù)到正常對(duì)照 組水平。DM組大鼠E擬cadherin蛋白表達(dá)顯著低于正常對(duì)照組（P V 0.05），胰島素治療組的表達(dá)則明顯較 DM組增加（PV 0.05 ）。2.5 u擬SMA和FN mRNA表達(dá)水平 見(jiàn)表5和圖5。正常對(duì)照組可檢 測(cè)到兩者mRNA各時(shí)點(diǎn)DM組兩者的mRN冰平較正常對(duì)照組顯著增 加（PV 0.05 ）,且隨病程延長(zhǎng)呈遞增趨勢(shì)，16 w后維持在較高水平。 胰島素治療組的mRNA匕同時(shí)點(diǎn)DM組明顯

20、下降（Pv 0.05 ）,與正常對(duì) 照組比較差異無(wú)顯著性。表2各組大鼠血糖、24 h尿蛋白、Scr、RI 與正常對(duì)照組比較：1） PV0.05 , 2） PV0.01 ；與同時(shí)點(diǎn)DM組比較： 3） P V 0.01 ;下表同表3各組大鼠腎皮質(zhì)口擬SMA和FN免疫組化陽(yáng) 性表達(dá)程度表4各組大鼠腎皮質(zhì)a擬.SMA和ED：cadherin蛋白表達(dá)相 對(duì)水平（靶蛋白/ B擬act in灰度比值）與正常對(duì)照組比較：1） P V 0.05 ；與同時(shí)點(diǎn)DM組比較：2） P V 0.05，下表同表5各組大鼠腎 皮質(zhì)a擬SMA和FN mRNA表達(dá)相對(duì)水平3 討論在正常組織中，ECM的產(chǎn)生和降解處于一個(gè)平衡狀態(tài)，

21、這種平衡主 要由ECM勺降解酶類(lèi)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs、組織型纖溶酶原激 活物等調(diào)節(jié)。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，基質(zhì)降解酶可以減輕腎臟纖維化，延緩 腎功能惡化。然而近年研究結(jié)果卻相反，女口MMP2在體外可誘發(fā)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化（EMT4，過(guò)度表達(dá)MMP2的轉(zhuǎn)基因鼠，發(fā)生小 管肥大、小球硬化和小管擬間質(zhì)纖維化5。以往也認(rèn)為纖維蛋白溶 解酶可以通過(guò)降解基質(zhì)蛋白而保護(hù)腎臟， 可是在纖溶酶原基因敲出小 鼠中，將小鼠進(jìn)行輸尿管結(jié)扎后并未發(fā)現(xiàn)纖維化加重；同時(shí)，還在小 鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)膠原沉積減少6。因此相關(guān)實(shí)驗(yàn)提示，基質(zhì)降解酶是否 有利于腎臟纖維化的逆轉(zhuǎn)仍然存在爭(zhēng)議。腎臟固有細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、系膜細(xì)胞、上皮細(xì)胞等，

22、這些細(xì)胞 在各種損傷因素的刺激下，發(fā)生MFB轉(zhuǎn)變，最終成為分泌基質(zhì)蛋白的 效應(yīng)細(xì)胞乙8，效應(yīng)細(xì)胞不僅能合成分泌 ECM還能分泌蛋白酶 抑制子、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)，以旁分泌的方式募集鄰近細(xì)胞，放大 致纖維化的效應(yīng)。因此，已經(jīng)發(fā)生表型改變的細(xì)胞能否回到其正常表 型是腎臟纖維化逆轉(zhuǎn)的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)從2 w開(kāi)始DM組大鼠口擬SMA表達(dá)即顯著增加，免疫組化染色顯示，DM大鼠2 w時(shí)腎間質(zhì)細(xì)胞胞漿內(nèi)有陽(yáng)性染色，8 w可見(jiàn)部分 腎小球系膜細(xì)胞胞漿陽(yáng)性染色，16 w時(shí)部分DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞 胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，并隨病程延長(zhǎng)細(xì)胞陽(yáng)性染色增多，提示在DM大鼠腎組織中有成纖維細(xì)胞活化和系膜細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞向M

23、FB細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。同時(shí)我們還觀察到隨著 DM的發(fā)展，腎小球系膜區(qū)和 腎小管間質(zhì)區(qū)FN增多，與MFB增加相一致，提示DM大鼠腎臟ECM成 分FN沉積增多可能來(lái)源于MFB在胰島素治療組，F(xiàn)N和u擬SMAg白和mRN表達(dá)顯著減少，通過(guò)免 疫組化我們觀察到口擬SMA只表達(dá)于血管，說(shuō)明MFB減少，提示胰島 素控制血糖后可能通過(guò)抑制或逆轉(zhuǎn)腎臟固有細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化， 從而減 少了 FN等ECM勺生成，減輕腎臟病理改變。Yang 9、Zesiberg 10等的研究提示肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）】17可以誘導(dǎo)發(fā)生EMT的細(xì)胞再轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ?xì)胞(MET,提出至少在早期移出或阻斷致病因子，EMT

24、是可以逆轉(zhuǎn)的。本實(shí)驗(yàn)中DM大鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)a 擬SMA勺陽(yáng)性表達(dá)在 16 w,而胰島素治療組從13 w開(kāi)始治療，提示胰島素控制血糖可能 在早期阻斷或逆轉(zhuǎn)了高糖刺激下腎小管上皮細(xì)胞的EMTE擬cadherin是上皮細(xì)胞產(chǎn)生的也是上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，起著 維持細(xì)胞連接和極性的重要作用。本組DM大鼠的E擬cadherin較正常對(duì)照組顯著減少，而胰島素治療組則較同時(shí)點(diǎn)DM顯著增加，提示了增多的Ecadherin有可能來(lái)源于腎小管上皮細(xì)胞增多，而增多的 上皮細(xì)胞有可能是MFB通過(guò)MET或 EMT被阻止而使腎小管上皮細(xì)胞維 持原有表型的機(jī)制轉(zhuǎn)變而來(lái)。雖然DN腎臟纖維化的機(jī)制尚未闡明，其纖維化

25、的逆轉(zhuǎn)亦取決于許多 因素，胰島素治療也并不能完全防止 DM病人進(jìn)展為終末期腎衰竭， 但本結(jié)果提示DN經(jīng)胰島素治療后，一定程度的腎臟纖維化可被逆轉(zhuǎn)， 而這種逆轉(zhuǎn)可能與腎臟固有細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 Boffa JJ,Ying L,Placier S， et al.Regression of renalvascular and glomerular fibrosis:role of angiotensinIIreceptor an tag onism and metalloprote in ases J.J Am SocNephrol，2003;14(13):1132 擬44.2 Ada

26、mczakM, Gross ML AmanrK,et al.Reversal of glomerularlesi onsinvo Ivescoord in atedrestructuri ngof glomerularmicrovasculatureJ.J Am Soc Nephrol,2004;15(12):3063擬72.3 郭兵，肖瑛，萬(wàn)昌武，等.糖尿病大鼠腎小管 TGF慎3 1和MAPK1/3表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察J.中國(guó)病理生理雜志,2004 ;20(9):1681 擬 5.4 ChengS, Lovett DH.Gelatinase A (MMp)；2) is necessary and sufficie nt for renal tubular cell epithelial 拎;mese nchymal transformation J.Am J Pathol,2003 ； 162(6) : 1937擬49.5 Che ng S,Pollock AS ， Mahimkar R,et al.Matrix metalloprote in ase 2 and baseme nt membra nen tegrity : a unifying m