第二章細胞的破碎與分離

1、1 第二章第二章 細胞的破碎與分離細胞的破碎與分離 Cell Disruption and Separation 2 本章內(nèi)容 生物分離過程的一般流程 3 主要內(nèi)容主要內(nèi)容 概述細胞破碎概述細胞破碎 細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成 細胞壁的破碎細胞壁的破碎 方法試劑設(shè)備方法試劑設(shè)備 4 1 概述概述 不同類型的細胞分泌目標產(chǎn)物的類型： l動物細胞多分泌到細胞外培養(yǎng)液 l植物細胞多為胞內(nèi)產(chǎn)物 l微生物（細菌/酵母/真菌）胞內(nèi)、胞外 對于胞內(nèi)產(chǎn)物需要收集菌體或細胞進行破碎。 5 1概述概述 l大多數(shù)情況下，抗生素，胞外酶，一些多糖， 及氨基酸等目標產(chǎn)物存在于發(fā)酵液中。 l有些目標產(chǎn)物

2、存在于生物體中。 l尤其是由基因工程菌產(chǎn)生的大多數(shù)蛋白質(zhì) 是在細胞內(nèi)沉積。 l脂類物質(zhì)和一些抗生素包含在生物體中。 6 1 概述概述 胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代胞外產(chǎn)品：各種胞外酶、胞外多糖、細胞代 謝物如氨基酸、抗生素謝物如氨基酸、抗生素 細胞本身：細胞本身： 單細胞蛋白單細胞蛋白 如面包酵母如面包酵母 胞內(nèi)產(chǎn)品：胞內(nèi)產(chǎn)品： 各種胞內(nèi)酶各種胞內(nèi)酶、基因工程產(chǎn)物、基因工程產(chǎn)物 7 1 概述概述 目標產(chǎn)品位置目標產(chǎn)品位置 8 1.概述概述 細胞破碎細胞破碎 指采用一定的方法，在一定指采用一定的方法，在一定 程度上破壞細胞壁和細胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)程度上破壞細胞壁和細胞膜，設(shè)法使胞內(nèi) 產(chǎn)物

3、最大程度的釋放到液相中，破碎后的產(chǎn)物最大程度的釋放到液相中，破碎后的 細胞漿液經(jīng)固液分離除去細胞碎片后，再細胞漿液經(jīng)固液分離除去細胞碎片后，再 采用不同的分離手段進一步純化。采用不同的分離手段進一步純化。 細胞破碎細胞破碎指選用物理、化學(xué)、酶或機械指選用物理、化學(xué)、酶或機械 的方法來破壞細胞壁或細胞膜。的方法來破壞細胞壁或細胞膜。 9 細胞破碎細胞破碎 本質(zhì)上是一種增溶作用，細胞破碎的阻力來本質(zhì)上是一種增溶作用，細胞破碎的阻力來 自于細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成的差異。自于細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成的差異。 細胞的結(jié)構(gòu)根據(jù)細胞種類而異，動物、植物細胞的結(jié)構(gòu)根據(jù)細胞種類而異，動物、植物 和微生物細胞的結(jié)構(gòu)差異很大

4、。和微生物細胞的結(jié)構(gòu)差異很大。 動物細胞、嗜鹽菌和支原體沒有細胞壁，易于破碎；動物細胞、嗜鹽菌和支原體沒有細胞壁，易于破碎； 植物細胞和微生物細胞有堅固的細胞壁，破碎困難，植物細胞和微生物細胞有堅固的細胞壁，破碎困難， 需用強烈的破碎方法。需用強烈的破碎方法。 10 2細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成細胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成 原核生物原核生物細菌細菌 肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力來自肽聚糖、多糖、磷壁酸，主要阻力來自 于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；革蘭菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖革蘭菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖 真核生物真核生物酵母菌酵母菌 葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)，主要葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)，主要 阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交

5、換的緊密程度和厚度；阻力來自于壁結(jié)構(gòu)交換的緊密程度和厚度；酵母細胞壁結(jié)酵母細胞壁結(jié) 構(gòu)示意圖構(gòu)示意圖 真菌真菌 多糖、蛋白質(zhì)、脂類、葡聚糖、幾丁質(zhì)，主要阻力多糖、蛋白質(zhì)、脂類、葡聚糖、幾丁質(zhì)，主要阻力 來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。來自于壁強度和聚合物網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 11 革蘭菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖革蘭菌細胞壁結(jié)構(gòu)圖 12 酵母細胞壁結(jié)構(gòu)示意圖酵母細胞壁結(jié)構(gòu)示意圖 13 各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成各種微生物細胞壁的結(jié)構(gòu)和組成 微生物的細胞壁都由網(wǎng)狀的高分子聚合物構(gòu)成，破碎的難微生物的細胞壁都由網(wǎng)狀的高分子聚合物構(gòu)成，破碎的難 易程度主要取決于構(gòu)成細胞壁的聚合物的種類及細胞壁的易程度主要取決于構(gòu)成細胞壁的

6、聚合物的種類及細胞壁的 厚度和強度。厚度和強度。 14 植物細胞壁的結(jié)構(gòu)植物細胞壁的結(jié)構(gòu) l對于已生長結(jié)束的植物細胞壁可分為對于已生長結(jié)束的植物細胞壁可分為初生壁和次生壁。初生壁和次生壁。 l初生壁是細胞生長期形成的。初生壁是細胞生長期形成的。初生壁一般較薄初生壁一般較薄(13m)，富有彈，富有彈 性。由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為纖維素、半纖維素和性。由多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成，多糖主要成分為纖維素、半纖維素和 果膠類物質(zhì)。纖維素是長鏈果膠類物質(zhì)。纖維素是長鏈D-葡聚糖，許多這樣的長鏈形成微纖葡聚糖，許多這樣的長鏈形成微纖 絲，構(gòu)成細胞壁的骨架，細胞壁的機械強度主要來自于微纖絲。絲，構(gòu)成細胞壁的

7、骨架，細胞壁的機械強度主要來自于微纖絲。 l某些植物細胞，當(dāng)生長停止后，在細胞質(zhì)和初生細胞壁之間形成某些植物細胞，當(dāng)生長停止后，在細胞質(zhì)和初生細胞壁之間形成 了次生細胞壁。了次生細胞壁。次生壁一般較厚次生壁一般較厚(4m以上以上)，纖維素和半纖維素含，纖維素和半纖維素含 量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則，量比初生壁增加很多，纖維素的微纖絲排列得更緊密和有規(guī)則， 而且存在木質(zhì)素的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬而且存在木質(zhì)素的沉積。因此次生壁的形成提高了細胞壁的堅硬 性，使植物細胞具有很高的機械強度。性，使植物細胞具有很高的機械強度。 15 3 細胞壁的破碎細胞壁的

8、破碎 16 3.1破碎率的評價（三種）破碎率的評價（三種） 破碎率破碎率：被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞被破碎細胞的數(shù)量占原始細胞 數(shù)量的百分比數(shù)。數(shù)量的百分比數(shù)。 Y(%)=(N0-N)/N0100 N0:原始細胞數(shù)量；原始細胞數(shù)量； N：t時間操作后未損害完整細胞數(shù)量；時間操作后未損害完整細胞數(shù)量； 17 1）直接測定法）直接測定法 利用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器可直接計數(shù)完利用顯微鏡或電子微粒計數(shù)器可直接計數(shù)完 整細胞的量。整細胞的量。 染色法染色法 例如，破碎的革蘭氏陽性菌可染色成革蘭氏例如，破碎的革蘭氏陽性菌可染色成革蘭氏 陰性菌的顏色，利用革蘭染色法使未受損害陰性菌的顏色，利用革蘭染色法使

9、未受損害 的酵母細胞呈現(xiàn)紫色，而受損害的酵母細胞的酵母細胞呈現(xiàn)紫色，而受損害的酵母細胞 呈現(xiàn)亮紅色。呈現(xiàn)亮紅色。 18 2)目的產(chǎn)物測定法目的產(chǎn)物測定法 蛋白質(zhì)量或酶的活力蛋白質(zhì)量或酶的活力 細胞破碎后，測定懸浮液中細胞破碎后，測定懸浮液中細胞內(nèi)含細胞內(nèi)含 物物的增量來估算破碎率。的增量來估算破碎率。 通常將破碎后的細胞懸浮液離心，測通常將破碎后的細胞懸浮液離心，測 定上清液中蛋白質(zhì)的含量或酶的活力，定上清液中蛋白質(zhì)的含量或酶的活力， 并與并與100%破碎所獲得的標準值直接比破碎所獲得的標準值直接比 較。較。 19 3)導(dǎo)電率測定法導(dǎo)電率測定法 細胞破碎后，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到細胞破碎后

10、，大量帶電荷的內(nèi)含物被釋放到 水相，使導(dǎo)電率上升。水相，使導(dǎo)電率上升。 20 3.2 細胞破碎的方法細胞破碎的方法 分分 類類作作 用用 機機 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性 機機 械械 法法 珠磨法珠磨法固體剪切作用固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分 子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難 高壓勻漿法高壓勻漿法液體剪切作用液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合 絲狀菌和革蘭氏陽性菌絲狀菌和革蘭氏陽性菌 超聲破碎法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，對酵

11、母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈， 不適合大規(guī)模操作不適合大規(guī)模操作 非非 機機 械械 法法 酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離， 溶酶價格高，通用性差溶酶價格高，通用性差 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法改變細胞膜的滲透性改變細胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較 低，通用性差低，通用性差 滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用 凍結(jié)融化法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)-融化融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較

12、低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物 干燥法干燥法改變細胞膜滲透性改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活 21 1)機械法機械法 珠磨法珠磨法 高壓勻漿法高壓勻漿法 超聲波法超聲波法 22 1)1固體剪切方法固體剪切方法 珠磨法珠磨法 (bead mill) 原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小原理：進入珠磨機的細胞懸浮液與極細的玻璃小 珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm） 一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細胞之間 的互相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。的互

13、相剪切、碰撞，使細胞破碎，釋放出內(nèi)含物。 在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)， 漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量漿液流出從而實現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量 一般采用夾套冷卻的方式帶走。一般采用夾套冷卻的方式帶走。 適于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎，更適合于真菌適于絕大多數(shù)微生物細胞的破碎，更適合于真菌 菌絲和藻類。菌絲和藻類。 23 WSK臥式高效全能珠磨機 ZM系列臥式密閉珠系列臥式密閉珠(砂砂)磨機磨機 24 珠磨法珠磨法 (bead mill) 實驗室規(guī)模的細胞破碎設(shè)備有實驗室規(guī)模的細胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎高速組織搗

14、碎 機、機、 Braun勻漿器；勻漿器； 中試規(guī)模的細胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理；中試規(guī)模的細胞破碎可采用膠質(zhì)磨處理； 在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(瑞士瑞士WAB公司公司 和德國西門子機械公司制造和德國西門子機械公司制造)。 珠磨法的破碎率一般控制在珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、以下：降低能耗、 減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率減少大分子目的產(chǎn)物的失活、減少由于高破碎率 產(chǎn)生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的產(chǎn)生的細胞小碎片不易分離而給后續(xù)操作帶來的 困難。困難。 25 珠磨法珠磨法(bead mill)特點：特點： 適用對象較廣適用

15、對象較廣 工業(yè)化、實驗室中應(yīng)用工業(yè)化、實驗室中應(yīng)用 細胞完全破碎細胞完全破碎 需冷卻需冷卻 26 1）2 液體剪切方法液體剪切方法 高壓勻漿法高壓勻漿法 High-pressure homogenization 大規(guī)模細胞破碎的常用方法大規(guī)模細胞破碎的常用方法 采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國采用高壓勻漿器（由高壓泵和勻漿閥組成，英國APV公司和公司和 美國美國 Microfluidics公司均有產(chǎn)品出售）。公司均有產(chǎn)品出售）。 利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖利用高壓使細胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速沖 擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時

16、，每擊撞擊環(huán)使細胞破碎，細胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時，每 秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，秒速度高達幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上， 被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中被迫改變方向從出口管流出。細胞在這一系列高速運動過程中 經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細胞破碎。 27 高壓勻漿器示意圖高壓勻漿器示意圖 28 高壓勻漿法高壓勻漿法 High-pressure homogenization 特點：特點： 適用對象廣，最適合于酵母和細菌；適用對象廣，最適合于酵母和細菌；

17、工業(yè)化、實驗室中應(yīng)用工業(yè)化、實驗室中應(yīng)用 細胞完全破碎細胞完全破碎 易造成堵塞的團狀或絲狀真菌，易造成堵塞的團狀或絲狀真菌， 較小的革蘭氏陽性菌，較小的革蘭氏陽性菌， 含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損含有包含體的基因工程菌（因包含體堅硬，易損 傷勻漿閥）傷勻漿閥） 不宜采用高壓勻漿法。 29 1）-3 X擠壓器法擠壓器法 X-press法法 改進的高壓方法改進的高壓方法：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至：將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25 形成冰晶體，利用形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷以上的高壓沖擊，使冷 凍細胞從高壓閥小孔中擠出。凍細胞從高壓閥小孔中擠出。 細胞破碎是由于冰晶

18、體的磨損，使包埋在冰中的微細胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微 生物變形而引起的。生物變形而引起的。 此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細此法主要用于實驗室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細 胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但不適胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點，但不適 應(yīng)于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。應(yīng)于對冷凍敏感的生化物質(zhì)。 30 1)-4 超聲波法超聲波法 Ultrasonication l利用超聲波振蕩器發(fā)射的利用超聲波振蕩器發(fā)射的15-25kHz的超聲波的超聲波 探頭處理細胞懸浮液。探頭處理細胞懸浮液。 l超聲波振蕩器以可分為槽式和探頭直接插入超聲波振蕩器以可分為槽式和探

19、頭直接插入 介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。介質(zhì)兩種型式，一般破碎效果后者比前者好。 l超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和超聲波的細胞破碎效率與細胞種類、濃度和 超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。超聲波的聲頻、聲能有關(guān)。 31 電聲超聲波發(fā)生器電聲超聲波發(fā)生器 示意圖示意圖 32 JY92-II D超聲波超聲波 細胞粉碎機細胞粉碎機 33 超聲波法超聲波法Ultrasonication 其原理可能與空化現(xiàn)象其原理可能與空化現(xiàn)象(cavitation phenomena)引起引起 的沖擊波和剪切作用有關(guān)。的沖擊波和剪切作用有關(guān)。 空穴泡由于受到超聲波的迅速沖擊而閉合，從而產(chǎn)空穴泡由于受到超聲波

20、的迅速沖擊而閉合，從而產(chǎn) 生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性 旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應(yīng)力，促使旋渦在介質(zhì)中的懸浮細胞上造成了剪切應(yīng)力，促使 細胞液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。細胞液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。 操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部操作過程產(chǎn)生大量的熱，因此操作需在冰水或外部 冷卻的容器中進行。冷卻的容器中進行。 34 超聲波破碎的適用范圍超聲波破碎的適用范圍 超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生超聲波破碎是很強烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生 物的破碎。物的破碎。 一般桿菌比球菌易破碎，一般桿菌比球菌

21、易破碎，G-細菌比細菌比G+細菌易破碎，細菌易破碎， 對酵母菌的效果較差。對酵母菌的效果較差。 但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性但超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團能使某些敏感性活性 物質(zhì)失活；物質(zhì)失活； 超聲波破碎的有效能量利用率極低；超聲波破碎的有效能量利用率極低； 由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在由于對冷卻的要求相當(dāng)苛刻，所以不易放大，但在 實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。實驗室小規(guī)模細胞破碎中常用。 35 不同機械破碎方法的比較 技術(shù)技術(shù)原理原理效果效果成本成本舉例舉例 勻 漿 法勻 漿 法 (孔型孔型) 須使細胞通過的小須使細胞通過的小 孔，使細胞受到剪孔，使細胞受到剪 切

22、力而破碎切力而破碎 劇烈劇烈適中適中細胞懸浮液大規(guī)模細胞懸浮液大規(guī)模 處理處理 珠 磨 破珠 磨 破 碎法碎法 細胞被玻璃珠或鐵細胞被玻璃珠或鐵 珠搗碎珠搗碎 劇烈劇烈便宜便宜細胞懸浮液和植物細胞懸浮液和植物 細胞的大規(guī)模處理細胞的大規(guī)模處理 超 聲 波超 聲 波 法法 用超聲波的空穴作用超聲波的空穴作 用使細胞破碎用使細胞破碎 適中適中昂貴昂貴細胞懸浮液小規(guī)模細胞懸浮液小規(guī)模 處理處理 36 機械破碎法機械破碎法 需要高能量，且產(chǎn)生高溫和高剪切力，易使需要高能量，且產(chǎn)生高溫和高剪切力，易使 不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活；不穩(wěn)定產(chǎn)品變性失活； 破碎的有機體或釋放的產(chǎn)物，不專一，并且破碎的有機體或釋放的產(chǎn)

23、物，不專一，并且 產(chǎn)生碎片的尺寸范圍大，后處理難度大；產(chǎn)生碎片的尺寸范圍大，后處理難度大； 37 2）非機械法）非機械法 I 酶法溶胞酶法溶胞 Enzymatic Lysis，酶解法，酶解法， 酶溶法酶溶法 利用酶反應(yīng)，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達利用酶反應(yīng)，分解破壞細胞壁上特殊的鍵，從而達 到破碎的目的。到破碎的目的。 外加酶法外加酶法 自溶法自溶法 38 3. 3 非機械法非機械法 外加酶法外加酶法 利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必須根據(jù)細胞壁利用溶酶系統(tǒng)處理細胞時必須根據(jù)細胞壁 的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿?，并確定的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定 相應(yīng)的次序。相應(yīng)的次序。 39 I 外加

24、酶法外加酶法 常用的溶酶常用的溶酶 溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽鍵內(nèi)切酶、 殼多糖酶等 溶菌酶主要用于細菌類溶菌酶主要用于細菌類 細胞壁溶解酶是幾種酶的復(fù)合物 40 重要微生物細胞壁的降解酶重要微生物細胞壁的降解酶 41 外加酶法外加酶法 溶菌酶能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的溶菌酶能專一性地分解細胞壁上肽聚糖分子的- 1,41,4糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。糖苷鍵，因此主要用于細菌類細胞壁的裂解。 革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶革蘭氏陽性菌懸浮液中加入溶菌酶，很快就產(chǎn)生溶 壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨

25、采用溶菌酶無壁現(xiàn)象。但對于革蘭氏陰性菌，單獨采用溶菌酶無 效果，必須與螯合劑效果，必須與螯合劑EDTAEDTA一起使用。一起使用。 放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚放線菌的細胞壁結(jié)構(gòu)類似于革蘭氏陽性菌，以肽聚 糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶糖為主要成分，所以也能采用溶菌酶; ;酵母和真菌酵母和真菌 由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì)由于細胞壁的組分主要是纖維素、葡聚糖、幾丁質(zhì) 等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等等，常用蝸牛酶、纖維素酶、多糖酶等; ;植物細胞植物細胞 壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維壁的主要成分是纖維素，常采用纖維素酶和半纖維 素酶裂解。素酶

26、裂解。 42 外加酶法外加酶法 有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入有時采用幾種酶的混合物會產(chǎn)生更好的效果，加入 時需確定相應(yīng)的次序。時需確定相應(yīng)的次序。 對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作對酵母細胞采用酶法破碎時，先加入蛋白酶作 用蛋白質(zhì)用蛋白質(zhì)-甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加甘露聚糖結(jié)構(gòu)，使二者溶解，再加 入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖層，最后只剩下 原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細原生質(zhì)體，這時若緩沖液的滲透壓變化，則細 胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。胞膜破裂，釋出胞內(nèi)產(chǎn)物。 43 外加酶法外加酶法 優(yōu)點：優(yōu)點：產(chǎn)品釋放的選擇性高；抽提

27、的速率產(chǎn)品釋放的選擇性高；抽提的速率 和收率高；產(chǎn)品的破壞最少；對和收率高；產(chǎn)品的破壞最少；對pH值和溫度值和溫度 等外界條件要求低；不殘留細胞碎片。等外界條件要求低；不殘留細胞碎片。 費用費用高，通用性差。高，通用性差。 適用性適用性：小規(guī)模的實驗室研究。小規(guī)模的實驗室研究。 44 酶法溶胞酶法溶胞 自溶法自溶法 Autolysis 自溶作用自溶作用是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是是酶解的另一種方法，所需溶胞的酶是 由微生物本身產(chǎn)生的。微生物代謝過程中，大多數(shù)由微生物本身產(chǎn)生的。微生物代謝過程中，大多數(shù) 都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶，以便都能產(chǎn)生一種能水解細胞壁上聚合結(jié)構(gòu)的酶，以

28、便 使生長過程進行下去。使生長過程進行下去。 改變微生物的環(huán)境，可誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激改變微生物的環(huán)境，可誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激 發(fā)產(chǎn)生其他的自溶酶，以達到自溶目的。發(fā)產(chǎn)生其他的自溶酶，以達到自溶目的。 影響因素影響因素 溫度溫度 時間時間 pH緩沖液濃度、細胞代謝途緩沖液濃度、細胞代謝途 徑等徑等 缺點缺點：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變：對不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變 性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。性，自溶后細胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。 45 II 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 Chemical permeation 化學(xué)法化學(xué)法 用某些化學(xué)試劑溶解細胞壁

29、或抽提細用某些化學(xué)試劑溶解細胞壁或抽提細 胞中某些組分的方法胞中某些組分的方法 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面某些化學(xué)試劑，如有機溶劑、變性劑、表面 活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變 細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞細胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞 內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。 該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的該法取決于化學(xué)試劑的類型以及細胞壁膜的 結(jié)構(gòu)與組成。結(jié)構(gòu)與組成。 46 II 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 (1)酸堿法酸堿法 調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pH值值 酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采

30、酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成氨基酸，通常采 用用6mol/L HCl。 堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從堿能溶解細胞壁上脂類物質(zhì)或使某些組分從 細胞內(nèi)滲漏出來。細胞內(nèi)滲漏出來。 成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。成本低，反應(yīng)激烈，不具選擇性。 47 II 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 (2)有機溶劑法有機溶劑法能分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細能分解細胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細 胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。丁醇、丙酮、氯仿、甲苯胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。丁醇、丙酮、氯仿、甲苯 (3)表面活性劑法表面活性劑法 無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是無論表面活性劑是陰離子、陽離子還是 非離子型，都是兩

31、性的，既能和水作用也能和脂作用，能與非離子型，都是兩性的，既能和水作用也能和脂作用，能與 細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶細胞壁上的脂蛋白結(jié)合，形成微泡，使膜的通透性增加或溶 解解 細胞破碎常用的表面活性劑：細胞破碎常用的表面活性劑： 膽酸鹽、磷脂等膽酸鹽、磷脂等 十二烷基硫酸鈉（十二烷基硫酸鈉（SDS，陰離子型）；非離子型如，陰離子型）；非離子型如Triton X- 100和吐溫（和吐溫（Tween）等）等; 對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞對疏水性物質(zhì)具有很強的親和力，能結(jié)合并溶解磷脂，破壞 內(nèi)膜的磷脂雙分子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。內(nèi)膜的磷脂雙分

32、子層，使某些胞內(nèi)物質(zhì)釋放出來。 48 II 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 (4)EDTA螯合劑螯合劑 處理處理G-細菌，對細胞壁外層有破壞作用。細菌，對細胞壁外層有破壞作用。 G-細菌的壁外層結(jié)構(gòu)通常靠二價陽離子細菌的壁外層結(jié)構(gòu)通?？慷r陽離子Ca2+ 或或Mg 2+結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦 結(jié)合脂多糖和蛋白質(zhì)來維持，一旦 EDTA將將Ca2+或或Mg2+螯合，大量的脂多糖分螯合，大量的脂多糖分 子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。子將脫落，使細胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。 49 II 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法 Chemical permeation 優(yōu)點：優(yōu)點： 對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量

33、的溶質(zhì)對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì) 如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì) 仍滯留在胞內(nèi)；仍滯留在胞內(nèi)； 細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進 一步提取。一步提取。 缺點：缺點： 通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放通用性差；時間長，效率低，一般胞內(nèi)物質(zhì)釋放 率不超過率不超過50%；有些化學(xué)試劑有毒；有些化學(xué)試劑有毒；化學(xué)試劑的加化學(xué)試劑的加 入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難，入常會給隨后產(chǎn)物的純化帶來困難， 并影響最終產(chǎn)物純度并影響最終產(chǎn)物純

34、度。 50 III 物理法物理法 滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法 凍融法凍融法 干燥法干燥法 51 滲透壓沖擊法滲透壓沖擊法Osmotic pressure 滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法滲透壓沖擊是較溫和的一種破碎方法 將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油將細胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油 或蔗糖溶液），達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖或蔗糖溶液），達平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖 液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進入 細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破裂。細胞內(nèi)，引起細胞溶脹，甚至破裂。 僅適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處僅

35、適用于細胞壁較脆弱的細胞或細胞壁預(yù)先用酶處 理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等）， 使細胞壁有缺陷，強度減弱。使細胞壁有缺陷，強度減弱。 52 凍融法凍融法 將細胞放在低溫下突然冷凍將細胞放在低溫下突然冷凍(約約-15)，而在室溫，而在室溫 下緩慢融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。下緩慢融化，反復(fù)多次而達到破壁作用。 由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，由于冷凍，一方面使細胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂， 另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細胞內(nèi)外溶液濃度變化， 引起細胞膨脹而破裂。引起細胞膨脹而破裂。 適用于細胞壁

36、較脆弱的菌體，破碎率較低，需反適用于細胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反 復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白復(fù)多次，此外，在凍融過程中可能引起某些蛋白 質(zhì)變性。質(zhì)變性。 53 干燥法干燥法 將細胞用不同的方法干燥，細胞膜滲透性發(fā)生變化將細胞用不同的方法干燥，細胞膜滲透性發(fā)生變化 而破裂，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑抽提胞而破裂，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑抽提胞 內(nèi)物質(zhì)。內(nèi)物質(zhì)。 干燥方法：干燥方法：空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥、冷凍空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥、冷凍 干燥等干燥等 氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30的氣流的氣流 中吹干；真空

37、干燥多用于細菌；冷凍干燥適用于不中吹干；真空干燥多用于細菌；冷凍干燥適用于不 穩(wěn)定的生化物質(zhì)。穩(wěn)定的生化物質(zhì)。 54 細胞破碎方法的比較細胞破碎方法的比較 分分 類類作作 用用 機機 理理適適 應(yīng)應(yīng) 性性 機機 械械 法法 珠磨法珠磨法固體剪切作用固體剪切作用可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分可達較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分 子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難 高壓勻漿法高壓勻漿法液體剪切作用液體剪切作用可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合可達較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合 絲狀菌和革蘭氏陽性菌絲狀菌和革蘭氏陽性菌 超聲破碎法超聲破碎法液體剪切作用液體剪切作用

38、對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，對酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈， 不適合大規(guī)模操作不適合大規(guī)模操作 X-press法法固體剪切作用固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目破碎率高，活性保留率高，對冷凍敏感目 的產(chǎn)物不適合的產(chǎn)物不適合 非非 機機 械械 法法 酶溶法酶溶法酶分解作用酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離， 溶酶價格高，通用性差溶酶價格高，通用性差 化學(xué)滲透法化學(xué)滲透法改變細胞膜的滲透性改變細胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較 低，通用性差低，通用性差 滲透壓法滲透壓法滲透壓劇烈改變滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用 凍結(jié)融化法凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)反復(fù)凍結(jié)-融化融化破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物破碎率較低，不適合對冷凍敏感目的產(chǎn)物 干燥法干燥法改變細胞膜滲透性改變細胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活 55 破碎方法選擇準則破碎方法選擇準則 1)細胞的處理量細胞