瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物

1、實(shí)驗(yàn)二 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 實(shí)驗(yàn)原理 3. 實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 4. 實(shí)驗(yàn)步驟 5. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及討論 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?v了解瓊脂糖凝膠電泳的原理v掌握瓊脂糖凝膠的制作及進(jìn)行電泳的方法 實(shí)驗(yàn)原理 v凝膠電泳是分離和純化DNA片段最常用的技術(shù)。根據(jù)制備凝膠的材料，分為瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳和和聚丙烯酰胺電泳。 v瓊脂糖凝膠電泳是基因工程操作中常規(guī)的實(shí)驗(yàn)方法，它能檢測(cè)少量的DNA（如用肉眼觀察，可檢測(cè)到10 ng的DNA），且檢測(cè)的范圍很廣。瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45 開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決開(kāi)

2、始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。下向正極泳動(dòng)。DNA分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)分子的遷移速度與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成反比。量的對(duì)數(shù)成反比。v瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物。v濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就

3、不同，從而分出不同的區(qū)帶。電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，是利用分子篩效應(yīng)，是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，可依據(jù)遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系，可依據(jù)DNA分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子的大小使其分離。該過(guò)程可以通過(guò)把分子分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物量標(biāo)準(zhǔn)參照物和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。和樣品一起進(jìn)行電泳而得到檢測(cè)。v溴化乙錠在紫外光照射下能發(fā)射熒光，當(dāng)DNA樣品在瓊脂糖凝膠中從負(fù)極向正極泳動(dòng)時(shí)，溴化乙錠從正極向負(fù)極移動(dòng)，這樣溴化乙錠分子就會(huì)嵌入DNA分子中形成絡(luò)合物，使DNA在紫外光下發(fā)射很強(qiáng)的熒光。在溴

4、化乙錠足夠的情況下，熒光的強(qiáng)度正比于DNA的含量，這樣就可以檢測(cè)DNA的濃度。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：vEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。環(huán)境。v實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣實(shí)驗(yàn)過(guò)程中操作要保持安靜、鎮(zhèn)定，注意樣品不能污染。品不能污染。實(shí)驗(yàn)儀器、材料與試劑 （一） 儀器 v1. 水平式凝膠電泳槽 v2. 穩(wěn)壓電泳儀 v3. 電爐 v4. 紫外檢測(cè)儀 v5. 臺(tái)式離心機(jī) （二） 材料 v實(shí)驗(yàn)一中的PCR產(chǎn)物（三）（三） 試劑試劑 v1.瓊脂糖v2. TAE電泳緩沖液(50) （pH8.0） Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mo

5、l/L EDTA（pH8.0） 100ml v3. 溴化乙錠溶液 10mg/ml水溶液，室溫，棕色瓶或鋁鉑紙包裝保存。 v4. 10DNA樣品上樣緩沖液 溴化乙錠（溴化乙錠（EBEB）是一種熒光染料，是一種熒光染料，EBEB分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。其熒光強(qiáng)度與DNADNA的含的含量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品量成正比。據(jù)此可粗略估計(jì)樣品DNADNA濃度。濃度。 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠EBEB染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其染色，肉眼可見(jiàn)核酸電泳帶，其DNADNA量一般量一般5ng5ng。核酸

6、染色劑核酸染色劑注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：EBEB是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。是致癌物質(zhì)，切勿用手接觸，更不要污染環(huán)境。電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一電泳指示劑溴酚蘭在堿性液體中呈紫蘭色，一般與蔗糖、甘油或聚蔗糖般與蔗糖、甘油或聚蔗糖400400組成上樣緩沖液。組成上樣緩沖液。 作用：作用：增加樣品比重，以確保增加樣品比重，以確保DNADNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。均勻沉入加樣孔內(nèi)。形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。形成肉眼可見(jiàn)的指示帶，預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置。使樣品呈色，使加樣操作更方便。使樣品呈色，使加樣操作更方便。上樣緩沖液上樣緩沖液實(shí)驗(yàn)步驟：瓊脂糖凝膠制備v

7、1. 洗凈電泳槽、制膠槽、梳子、擋板，晾干。 v2. 插好擋板、梳子。 v3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需稱(chēng)取0.4克瓊脂糖，放入制膠 的容器中（一般用三角瓶），然后加入40ml電泳緩沖液（1TAE）。 v4. 加熱煮沸，使瓊脂糖完全完全溶解。 v5. 溶液冷至約60時(shí)，加入溴化乙錠4 L (終濃度為0.5 g/ml)，輕輕搖勻，倒入制膠槽上，檢查有無(wú)氣泡。v6. 室溫下約30-45分鐘后，瓊脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和擋板，清除碎膠，將凝膠放入電泳槽中。 v7. 加入電泳緩沖液（1TAE）至電泳槽中，使液面高于膠面約1mm。v 8.在DNA樣品中加入2 L (1/10體積)的10 DNA上樣緩沖液

8、(loading buffer)，混勻，稍甩一下，使溶液都處于離心管底。 v9.用移液器吸起離心管中溶液，移入凝膠的梳孔中。v10.插上導(dǎo)線，打開(kāi)電泳儀電源，按照需要調(diào)節(jié)電壓至120V，電泳開(kāi)始，觀察電流情況或電泳槽中負(fù)極的鉑金絲是否有氣泡出現(xiàn)。 v11. 等溴酚藍(lán)泳動(dòng)至凝膠前沿后，將電壓（或電流）回零，關(guān)閉電源，停止電泳。 v12. 取出凝膠，在紫外觀測(cè)儀上觀察電泳結(jié)果。 v13. 根據(jù)需要切下DNA條帶，放入1.5ml Ep管中，放于4保存，以備下實(shí)驗(yàn)用。PCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/條帶）進(jìn)行1%的瓊脂糖凝

9、膠電泳后，各DNA條帶自上至下分別為2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)技巧和方法幾點(diǎn)注意事項(xiàng)：v1.）加樣時(shí)槍頭不要碰壞凝膠壁，否則DNA的帶型將不會(huì)整齊，加樣前要用槍頭吸打凝膠孔中的溶液，以趕走樣品空中的氣泡。v2.）每孔最大DNA上樣量決定于DNA樣品片段的大小、數(shù)目及樣品孔形狀與容量。v3.）應(yīng)注意每孔最大上樣容量及樣品孔體積，以免加樣時(shí)樣品流入附近樣品孔造成交叉污染，影響結(jié)果分析。v此外在瓊脂糖凝膠電泳中其它注意事項(xiàng)還有：v1.）凝膠中加入EB進(jìn)行電泳，便于紫外線下觀察電泳狀態(tài)，但EB會(huì)導(dǎo)致線形DNA遷移率下降。v.）電泳過(guò)程中，溴

10、化乙錠向負(fù)極移動(dòng)，與DNA泳動(dòng)的方向相反，較長(zhǎng)時(shí)間的電泳會(huì)造成靠正極方向的凝膠中溴化乙錠含量低，會(huì)對(duì)含量較少的小分子DNA片段檢測(cè)困難。處理方法是：將凝膠在0.5ug/ml的EB溶液中染色3045分鐘。v.）判斷正負(fù)極的另一方法是負(fù)極氣泡（H2）比正極氣泡（O2）多一倍。用多功能用多功能DNA純化回收試劑盒純化回收試劑盒（離心柱型）回收（離心柱型）回收DNAv在高濃度鹽離子存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附于離心柱內(nèi)的硅基質(zhì)膜上,再通過(guò)一系列快速的漂洗離心的步驟去蛋白液和漂洗液將引物,核苷酸,蛋白酶等雜質(zhì)去除,最后低鹽,高PH值的洗脫緩沖液將純凈DNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。v1在長(zhǎng)波紫外燈下在長(zhǎng)

11、波紫外燈下,用干凈刀片將所需回收用干凈刀片將所需回收的的DNA條帶切下條帶切下,盡量切除不含盡量切除不含DNA的凝膠的凝膠,得到凝膠體積越小越好得到凝膠體積越小越好。v2將切下含有將切下含有DNA條帶凝膠放入條帶凝膠放入1.5ml離心離心管管,稱(chēng)重。稱(chēng)重。v 先稱(chēng)一個(gè)空先稱(chēng)一個(gè)空1.5ml離心管重量離心管重量,然后放入凝膠塊后再稱(chēng)一次然后放入凝膠塊后再稱(chēng)一次,兩次重量相減兩次重量相減,得到凝膠的重量。得到凝膠的重量。v3. 加三倍體積溶膠加三倍體積溶膠/結(jié)合液結(jié)合液DB。v 如果凝膠重為如果凝膠重為0.1g,其體積可視為其體積可視為100l,則加入則加入300l溶膠液。溶膠液。v456水浴放置水浴放置5分鐘（或直至膠完全溶分鐘（或直至膠完全溶解）。每解）。每2-3分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解。分鐘渦旋震蕩一次幫助加速溶解。v5將上一步所得溶液加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中）, 12,000 rpm離心30-60秒,倒掉收集管中的廢液。v 如果總體積超過(guò)如果總體積超過(guò)750l，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附，可分兩次將溶液加入同一個(gè)吸附柱柱AC中。中。v6加入700l漂洗液WB（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)（請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇水乙醇!）,12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。v7加入500l漂洗液WB 12,000 rpm 離心1分鐘,棄掉廢液。 v8將吸附柱A