不同電荷生物聚合物對聚賴氨酸的抑菌活性研究

1、摘 要-聚賴氨酸是一種天然食品防腐劑，但與人工合成化學(xué)防腐劑相比，其抑菌效果相對差，提高其的抑菌活性具有重要意義。本文利用紫外分光光度掃描分析-聚賴氨酸與呈不同電荷生物聚合物的相互作用，利用打孔法分析，微量稀釋法以及CTC法分析不同電荷生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響。紫外可見分光光譜顯示-聚賴氨酸與負(fù)電荷聚合物有相互作用；帶正電的乳酸鏈球菌素、硫酸魚精蛋白可提高-聚賴氨酸的抑菌活性；呈負(fù)電的果膠、卡拉膠、羧甲基纖維素鈉（CMC NA）對其抑菌活性有一定抑制作用，未帶電荷的葡聚糖的影響較小。本研究可為-聚賴氨酸在食品防腐中的提供一定的參考。關(guān)鍵詞：-聚賴氨酸；生物聚合物；抑菌活性；大腸桿菌

2、；枯草桿菌Abstract- polylysine is a natural food preservative, but its bacteriostatic effect is relatively poor compared with that of synthetic chemical preservatives. In this paper, the interaction between -polylysine and the biopolymer with different charge was analyzed by ultraviolet spectrophotometry

3、, and the effects of different charge biopolymers on the bacteriostatic activity of -polylysine were analyzed by drilling method, microdilution method and CTC method. Uv-vis spectra show that -polylysine interacts with negatively charged polymers. The bacteriostatic activity of -polylysine was enhan

4、ced by positive streptococcus lactis and protamine sulfate. The e negatively charged pectin, carrageenan and sodium carboxymethyl cellulose (CMC NA) have a certain inhibitory effect on its antibacterial activity, while the uncharged glucan has less effect. This study can provide a reference for -pol

5、ylysine in food preservation.Key words：-PL；biopolymers；Antibacterialactivityof；E.coli；Bacillussubtilis目 錄1 引 言51.1 食品防腐劑51.2 天然防腐劑的研究現(xiàn)狀51.3 -聚賴氨酸研究綜述61.3.1 來源及性質(zhì)61.3.2 抑菌機(jī)制61.3.3 -聚賴氨酸的前景71.4 目的意義及研究內(nèi)容72 材料與方法82.1 材料試劑、儀器82.1.1材料試劑82.1.2 儀器82.1.3 供試菌種82.1.4 培養(yǎng)液培養(yǎng)基82.1.5 抑菌劑的配制82.2 方法92.2.1 菌種活化92.2.

6、2 培養(yǎng)92.2.3 單因素實驗92.2.4 不同電荷生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響92.2.5 -聚賴氨酸與不同電荷的生物聚合物相互作用研究92.2.6-聚賴氨酸與不同電荷的生物聚合物的最小抑菌濃度測定102.2.7 CTC活性染色103 結(jié)果與分析113.1 不同電荷的生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響113.1.1陽離子對-聚賴氨酸抑菌活性的影響113.1.2 不同陰離子聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響123.1.3 中性生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響133.2 最小抑菌濃度的測定173.3 CTC活性染色194 討論與結(jié)論21參 考 文 獻(xiàn)22致 謝2422不同電荷生物聚

7、合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響1 引 言1.1 食品防腐劑食品的腐敗變質(zhì)一直是全社會關(guān)注的一個重要問題，在現(xiàn)社會為了應(yīng)對食品腐敗變質(zhì)問題，廣泛使用食品添防腐劑來應(yīng)對食品腐敗變質(zhì)問題，食品防腐劑能有效的抑制食品腐敗，延長食品的儲藏期。食品防腐劑的使用量極少，效果顯著，對食品本身的風(fēng)味和色澤，營養(yǎng)無明顯的影響，甚至對食品的影響可以忽略不計，其中現(xiàn)社會應(yīng)用最為廣泛的為人工合成食品防腐劑，在國標(biāo)中規(guī)定的安全添加量中使用并不會對人體造成影響，但不合法的過量使用人工合成食品防腐劑，毒素會在人體中堆積，對人體造成無法避免的傷害。天然防腐劑對人體沒有這一顧慮，但因抑菌效果的不理想，防腐效果不突出等原因無法廣泛

8、使用，天然食品添加劑的這一系列缺點已然成為食品科學(xué)研究工作者的工作重點內(nèi)容。1.2 天然防腐劑的研究現(xiàn)狀天然的防腐劑可分為三類：植物源、動物源和微生物源22。微生物源天然防腐劑是現(xiàn)社會最理想的天然食品防腐劑，具有無毒、安全、高效、無其他副作用的優(yōu)點，符合未來食品防腐劑的發(fā)展和使用的要求，在食品行業(yè)的使用越來越廣泛，主要有-聚賴氨酸、曲酸、乳酸鏈球菌等。-聚賴氨酸是賴氨酸殘基通過羧基和氨基形成的酰胺鍵連接而成的短肽,與帶負(fù)電荷的陰離子有較強(qiáng)的靜電作用，有25-30個賴氨酸殘基；具有抑菌譜廣,水溶性好,安全性高,熱穩(wěn)定性好,抑菌 pH 范圍廣等優(yōu)點。1.3 -聚賴氨酸研究綜述1.3.1 來源及性質(zhì)

9、1977年日本學(xué)者Shima3等從微生物中篩選Dargendorff Positive物質(zhì)時，觀察到一株能穩(wěn)定大量產(chǎn)生DP物質(zhì)的放線菌白色鏈霉菌Streptomyces albulus，現(xiàn)其培養(yǎng)液過濾后有一種對德拉根道夫?qū)嶒灣赎栃缘幕衔?，該物質(zhì)經(jīng)證實為一種由單一賴氨酸在-羥基和-氨基形成酰胺鍵而連接成的聚氨基酸4，有2030個賴氨酸單體，為-聚賴氨酸 (-poly-L-lysine，-PL)。-聚賴氨酸是可以一種溶于水微溶于乙醇的多肽物質(zhì)，是一種重要的生物堿，其可被生物降解。物理性質(zhì)為青黃色，通常呈粉末狀，具有較強(qiáng)的除濕特性，空間結(jié)構(gòu)呈直鏈狀，由多個賴氨酸組成，具有很高的熱穩(wěn)定性，殺菌能力較

10、強(qiáng)，水溶性和熱穩(wěn)定性好，pH值對它不能產(chǎn)生影響，熔點不固定，一般在溫度高于250時軟化分解。-聚賴氨酸的抑菌活性受到分子量影響，抑菌活性最佳的分子量為3600-4300，分子量低于1300時失去抑菌活性。紅外光譜分析反映出-聚賴氨酸的強(qiáng)吸收峰值大約在16801640cm -1和1580-1520cm-16。1.3.2 抑菌機(jī)制-聚賴氨酸抑菌效率很高，在低濃度時就有抑菌活性；-聚賴氨酸的抑菌機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾個方面:（1）作用于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜系統(tǒng)，并在細(xì)胞膜上形成孔道，導(dǎo)致小分子物質(zhì)滲出，細(xì)胞外液滲透壓升高，細(xì)胞物質(zhì)合成受阻，當(dāng)細(xì)胞膜破裂時，大分子的物質(zhì)溢出，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而起到抑菌防腐

11、作用7。（2）作用于遺傳物質(zhì)，改變遺傳性狀。（3）作用于酶或者功能蛋白，影響蛋白質(zhì)的合成和正常生理代謝功能。其化學(xué)組成是由人體必需氨基酸L-賴氨酸構(gòu)成的多肽，經(jīng)消化后又可變成單一的賴氨酸而成為人體營養(yǎng)的強(qiáng)化劑，故聚賴氨酸作為食品防腐劑，具有無毒副作用，安全性高的特點。與鹽酸、檸檬酸、蘋果酸、甘氨酸和高級脂肪甘油酯等合用具有增效作用，但遇酸性多糖、磷酸鹽、鹽酸鹽、等可能因結(jié)合而使活性降低，同時-聚賴氨酸也具有一定的抗噬菌體的能力9。劉慧10等研究表明-聚賴氨酸對革蘭氏陽性的微球菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、革蘭氏陰性的大腸桿菌、沙門氏菌以及酵母菌有明顯抑制效果；-聚賴氨酸單獨使用時對革蘭氏陰性

12、菌的效果不明顯，但與醋酸復(fù)合使用后對枯草芽胞桿菌有明顯抑制作用；高溫處理后的-聚賴氨酸對微球菌仍有抑菌活性7，顯示-聚賴氨酸具有良好的熱穩(wěn)定性能；-聚賴氨酸在中性和微酸性環(huán)境中有較強(qiáng)的抑菌性能，而在酸性和堿性條件下抑菌效果不明顯11。1.3.3 -聚賴氨酸的前景隨人民生活水平不斷提高，對食品要求更高了：更多樣化、更新鮮、更有營養(yǎng)、更健康，尤其對食品的添加劑和防腐劑也要求越來越高23。我國的食品防腐劑多年來一直以化學(xué)防腐劑為主，天然食品防腐劑只有少數(shù)的幾種。-聚賴氨酸不同于傳統(tǒng)化學(xué)合成的防腐劑，是一種天然防腐劑。添加-聚賴氨酸于加工食品中就能夠達(dá)到防腐抑菌的目的，且在-聚賴氨酸不會影響食品本身的

13、風(fēng)味，有同時具有安全性，使得-聚賴氨酸被廣泛應(yīng)用于食品加工防腐1617192021，且-聚賴氨酸2003年10月美國食品藥物管理局批準(zhǔn)其為安全食品保藏劑15，在日本食品加工行業(yè)，-聚賴氨酸已作為一種食品防腐劑進(jìn)行使用并生產(chǎn)。而我國于2014年批準(zhǔn)-聚賴氨酸作為一種食品防腐劑添加至食品保鮮。1.4 目的意義及研究內(nèi)容本項目以革蘭氏陰性菌大腸桿菌、陽性菌枯草芽孢桿菌為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法，研究不同電荷聚合物、對-聚賴氨酸抑菌活性的影響。紫外-可見光掃描光譜分析-聚賴氨酸與帶不同電生物聚合物，96孔板測定-聚賴氨酸的最小抑菌濃度及其混合物的最小抑菌濃度，CTC活性染色測定抑菌效果，可為-聚賴氨酸在

14、食品中的科學(xué)應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。2 材料與方法2.1 材料試劑、儀器2.1.1材料試劑-聚賴氨酸、果膠、卡拉膠、葡聚糖、溶菌酶、硫酸魚精蛋白。2.1.2 儀器儀器 型號生產(chǎn)廠家恒溫培養(yǎng)箱超凈工作臺全自動高壓滅菌鍋電熱鼓風(fēng)干燥箱恒溫培養(yǎng)搖床電子天平DHP-9272ASW-CJ-2DYXQ-SG46-280SDHG-9070A NRY-2010CYP802N上海飛越實驗儀器有限公司蘇州凈化設(shè)備有限公司上海博訊實業(yè)有限公司上海飛越實驗儀器有限公司上海南榮實驗設(shè)備有限公司上海精密科學(xué)儀器有限公司2.1.3 供試菌種革蘭氏陽性菌種枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis)革蘭氏陰性菌種大腸桿菌

15、（Escherichiacoli)2.1.4 培養(yǎng)液培養(yǎng)基培養(yǎng)基操作步驟營養(yǎng)瓊脂牛肉膏 1g、酵母膏 2g、蛋白胨 5g、NaCL 5g、瓊脂15g、加水定容至1000ml調(diào)pH為7.4 121高壓滅菌15min備用營養(yǎng)肉湯蛋白胨10g、牛肉膏3g、NaCL5g、加水定容至1000ml，分裝30ml 121高壓滅菌15min備用 2.1.5 抑菌劑的配制2% -聚賴氨酸：稱取0.1克的-聚賴氨酸至5mL的無菌水中使其溶解。1%果膠：稱取0.1克的果膠至10ml的無菌水中加熱使其溶解。1%葡聚糖:稱取0.1克的葡聚糖至10ml的無菌水中使其溶解。4%魚精蛋白：稱取0.4克的魚精蛋白至10ml的無

16、菌水中使其溶解。2%溶菌酶：稱取0.2克的溶菌酶至10ml的無菌水中使其溶解。0.2%卡拉膠:稱取0.2克卡拉膠至100ml的無菌水中、加熱使其溶解。2.2 方法2.2.1 菌種活化超凈工作臺中接種環(huán)劃線接種。37培養(yǎng)24h活化。將活化的菌種接種至營養(yǎng)肉湯中，200rpm搖床培養(yǎng)16h。2.2.2 培養(yǎng)將活化的菌種接種至裝有30mL營養(yǎng)肉湯150mL的三角瓶，37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。2.2.3 單因素實驗超凈工作臺中取菌液（大腸桿菌或枯草芽孢桿菌）加入培養(yǎng)皿制，加入約20ml營養(yǎng)瓊脂，加入1ml菌液，菌液濃度約為1103，用7mm打孔器打孔，注入-聚賴氨酸以及其他不同測試物：-聚賴氨酸的濃度

17、為0.05%,其他成分的濃度分別為0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%，設(shè)置空白對照組。37恒溫箱培養(yǎng)24h。測量抑菌圈大小。2.2.4 不同電荷生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響枯草芽孢桿菌的平板中加入果膠、卡拉膠、葡聚糖、魚精蛋白、溶菌酶以及-聚賴氨酸和復(fù)合物為對照。比例以及濃度按2.2.3進(jìn)行。在指示菌為大腸桿菌按以上方法。2.2.5 -聚賴氨酸與不同電荷的生物聚合物相互作用研究利用紫外-可見分光光度計進(jìn)行波長掃描，蒸餾水作為對照分別記錄200nm-500nm吸光度值。掃描0.2mg/ml -聚賴氨酸分別與0.2 mg/ml不同物質(zhì)混合測試物。2.2.6 -聚賴氨酸與

18、不同電荷的生物聚合物的最小抑菌濃度測定利用96孔板對-聚賴氨酸與不同電荷的生物聚合物按比例混合，聚賴氨酸最為對照組，37恒溫箱培養(yǎng)24h，觀察其最小抑菌濃度。2.2.7 CTC活性染色利用CTC染色觀察果膠、葡聚糖、魚精蛋白、溶菌酶、卡拉膠按濃度0.001%、0.002%、0.004%、0.008%、0.01%與0.002%-聚賴氨酸抑菌混合反應(yīng)，大腸桿菌、枯草桿菌菌液為對照組，-聚賴氨酸比例為1，按1:0.05、1:0.1、1:0.5、1:1混合，并做好標(biāo)記。 溶液按比例混合，觀察抑菌活性，利用紫外-可見分光光度計進(jìn)行波長掃描，二甲基亞砜作為對照記錄470nm吸光度值。3 結(jié)果與分析3.1

19、不同電荷的生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響3.1.1陽離子對-聚賴氨酸抑菌活性的影響考察實驗結(jié)果可以看出，添加溶菌酶可提高-聚賴氨酸抑菌活性。溶菌酶使-聚賴氨酸對大腸桿菌抑菌性變高，隨濃度逐漸增大，溶菌酶與-聚賴氨酸產(chǎn)生了正向促進(jìn)作用，帶陽離子的溶菌酶與同樣帶陽離子-聚賴氨酸產(chǎn)生反應(yīng)所以抑菌效果的提高明顯：溶菌酶的含量逐漸增加時，抑菌圈增加明顯，-聚賴氨酸單獨使用的抑制效果不大，與溶菌酶混合時增幅效果較好，隨著溶菌酶的比例增加，抑菌效果增加明顯。表1不同溶菌酶/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-溶菌酶2mm2mm3

20、mm4mm6mm混合2mm3mm4mm4.5mm7mm表2不同溶菌酶/-聚賴氨酸比例對抑制枯草桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-溶菌酶2mm2mm3mm4mm6mm混合2mm3mm4mm4.5mm5mm考察實驗結(jié)果可以看出，硫酸魚精蛋白對-聚賴氨酸抑菌活性有促進(jìn)增強(qiáng)作用。硫酸魚精蛋白帶陽離子電可能可使細(xì)胞質(zhì)膜形成孔洞，破壞細(xì)菌生長，與-聚賴氨酸形成協(xié)同促進(jìn)作用，使抑菌活性增大，增加了-聚賴氨酸的抑菌活性13。表3 不同硫酸魚精蛋白/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-硫

21、酸魚精蛋白0mm0mm0mm0mm0mm混合1mm1.5mm1.5mm1.5mm2mm表4 不同硫酸魚精蛋白/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-硫酸魚精蛋白0mm0mm0mm0mm0mm混合1mm1mm1.5mm1.8mm2mm 3.1.2 不同陰離子聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響考察實驗結(jié)果可以看出，不同比例果膠對-聚賴氨酸活性有抑制作用，而隨濃度提高，對-聚賴氨酸的抑菌效果越發(fā)明顯。兩者混合后產(chǎn)生了沉淀，形成了復(fù)合物，使其在光譜上發(fā)生了變化。-聚賴氨酸對革蘭氏陰性菌具有明顯抑菌效果。果膠在酸性條件下有一定的抑菌性

22、。-聚賴氨酸與帶負(fù)電荷的物質(zhì)具有強(qiáng)靜電作用力，并且對生物膜有良好穿透力，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，起到抑菌防腐作用。隨果膠濃度提高，-聚賴氨酸抑菌活性有一定提高。但隨果膠含量進(jìn)一步提高，-聚賴氨酸抑菌活性逐漸下降。表5 不同果膠/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-果膠0mm0mm0mm0mm0mm混合1mm1.5mm0mm0mm0mm表6 不同果膠/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-果膠0mm0mm0mm0mm0mm混合1mm0mm0mm0mm0mm考察實

23、驗結(jié)果可以看出，帶陰性電的卡拉膠與-聚賴氨酸比例混合，卡拉膠對-聚賴氨酸的抑菌活性有這一定的影響。卡拉膠對-聚賴氨酸抑菌活性有抑制作用，卡拉膠與-聚賴氨酸混合現(xiàn)成沉淀，可能是卡拉膠粘性大，使得-聚賴氨酸擴(kuò)散困難，其含量越多，對-聚賴氨酸的負(fù)面影響越大。表7不同卡拉膠/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-卡拉膠0mm0mm0mm0mm0mm混合0mm0mm0mm0mm0mm表8不同卡拉膠/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-卡拉膠0mm0mm0mm0

24、mm0mm混合0mm0mm0mm0mm0mm3.1.3 中性生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響考察實驗結(jié)果可以看出，葡聚糖對-聚賴氨酸抑菌活性有一定影響，在大腸桿菌中影響并不明顯。而在枯草桿菌中有著一定的影響，但影響并不明。表8不同葡聚糖/-聚賴氨酸比例對抑制大腸桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-葡聚糖0mm0mm0mm0mm0mm混合1mm1mm1mm1.5mm1.6mm表9不同葡聚糖/-聚賴氨酸比例對抑制枯草桿菌活性的影響溶液 濃度0.5%0.1%0.15%0.2%0.25%-聚賴氨酸1mm-葡聚糖0mm0mm0mm0mm0mm混合1m

25、m1mm1mm0mm0mm3.1.4 陽性生物聚合物與-聚賴氨酸混合兩者混合物的紫外-分光掃描光譜在3-1-1實驗中得出，添加溶菌酶可提高-聚賴氨酸抑菌活性。圖3-1基于紫外-可見掃描光譜可以看出，兩者間有一定相互作用。圖3-1 溶菌酶、-聚賴氨酸以及兩者混合物的在200-350nm下的紫外-分光掃描光譜在實驗3-1-1中得出，硫酸魚精蛋白對-聚賴氨酸抑菌活性有促進(jìn)增強(qiáng)作用。圖3-2可知兩者的混合物的無太大變化，兩者未產(chǎn)生新聚合物。圖3-2 魚精蛋白、-聚賴氨酸以及兩者混合物的在200-350nm下的紫外-分光掃描光譜3.1.5 陰性生物聚合物與-聚賴氨酸混合兩者混合物的紫外-分光掃描光譜在3

26、-1-2實驗中得出果膠對-聚賴氨酸活性有抑制作用，兩者混合后可產(chǎn)生了沉淀，形成了復(fù)合物，使其在光譜上發(fā)生了明顯變化。圖3-3果膠、-聚賴氨酸以及兩者混合物的在200-350nm下的紫外-分光掃描光譜卡拉膠與-聚賴氨酸混合后反應(yīng)現(xiàn)成沉淀，產(chǎn)生復(fù)合物，使其在光譜有明顯的變化?？ɡz與-聚賴氨酸混合現(xiàn)成沉淀，使得-聚賴氨酸擴(kuò)散困難，得知其含量越多，對-聚賴氨酸的負(fù)面影響越大。圖3-4卡拉膠、-聚賴氨酸以及兩者混合物的在200-350nm下的紫外-分光掃描光譜3.1.6 中性生物聚合物與-聚賴氨酸混合兩者混合物的紫外-分光掃描光譜實驗3-1-3中得知葡聚糖對-聚賴氨酸抑菌活性有一定影響，將兩者混合，兩

27、者混合物的紫外-可見分光掃描光譜圖3-5可知，葡聚糖與-聚賴氨酸的混合物光譜上與理論值有無較大差別。圖3-5葡聚糖、-聚賴氨酸以及兩者混合物的在200-350nm下的紫外-分光掃描光譜3.2 最小抑菌濃度的測定含不同濃度抑菌劑培養(yǎng)基制備: 將肉湯培養(yǎng)基加入96孔板孔中。含不同濃度抑菌劑培養(yǎng)基制備: 將稀釋至0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%，觀察-聚賴氨酸的最小抑菌濃度，得到最小抑菌濃度為0.03%。-聚賴氨酸與帶不同電荷的聚合物按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5混合，使用菌濃約為1103，

28、37恒溫培養(yǎng)24h。表1 -聚賴氨酸對枯草桿菌和大腸桿菌的最小抑菌濃度濃度0.001%0.002%0.003%0.004%0.005%枯草桿菌+-大腸桿菌+-注: 表中“-”表示無微生物生長,“+”表示有少量微生物生長,“+”“+”分別表示微生物生長的量。將已知最小抑菌濃度的-聚賴氨酸（0.003%）與1%果膠、1%葡聚糖、4%魚精蛋白、2%溶菌酶、0.2%卡拉膠按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:0.3、1:0.4、1:0.5混合，濃度使用菌濃約為1103，37恒溫培養(yǎng)24h。表2 -聚賴氨酸與不同電荷聚合物比例混合對大腸桿菌最小抑菌濃度比例-pl+葡聚

29、糖-pl+果膠-pl+卡拉膠-pl+溶菌酶-pl+硫酸魚精蛋白1:0.02-+-+1:0.03-1:0.04-+-1:0.05-+-1:0.2-+-1:0.3-+-1:0.4+-1:0.5+-表3 -聚賴氨酸與不同電荷聚合物比例混合對枯草桿菌最小抑菌濃度比例-pl+葡聚糖-pl+果膠-pl+卡拉膠-pl+溶菌酶-pl+硫酸魚精蛋白1:0.02-+-1:0.03-1:0.04-1:0.05-1:0.2-+-1:0.3-+-1:0.4+-1:0.5+-觀察96孔板內(nèi)微生物的生長情況，-聚賴氨酸（0.003%）與葡聚糖（1%）按1:0.02、1:0.03、1:0.04、1:0.05、1:0.2、1:

30、0.3混合時抑菌效果明顯，葡聚糖的濃度增加，對-聚賴氨酸（0.003%）的影響變大，-聚賴氨酸（0.003%）的抑菌效果變小。-聚賴氨酸（0.003%）與果膠（1%）混合時，-聚賴氨酸對大腸桿菌的抑菌效果變差，隨著混合比例增加-聚賴氨酸對枯草桿菌的抑菌效果效果明顯變差。-聚賴氨酸（0.003%）與卡拉膠（0.2%）按1:0.03、1:0.04、1:0.05比例混合，-聚賴氨酸抑菌效果明顯，隨著卡拉膠的比例增加，抑菌效果明顯變差，-聚賴氨酸（0.003%）與溶菌酶（2%）混合，抑菌效果顯著，無大腸桿菌、枯草芽孢桿菌生長。-聚賴氨酸（0.003%）與硫酸魚精蛋白（4%）混合，抑菌效果顯著，無大腸桿

31、菌、枯草芽孢桿菌生長。 3.3 CTC活性染色（1）菌懸液制備:用移液管分別取大腸桿菌和枯草桿菌菌液0.3mL于離心管中，以5000r/min離心5min。棄上清液，加入無菌水至10mL，攪拌均勻，離心5min，除去上清液加無菌水至10mL，充分混勻。（2）取1.5mL離心管，每管取0.3mL大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌液為對照組，另取離心管只加0.02%-聚賴氨酸，其余五管依次加入測試物0.01%果膠、0.01%葡聚糖、0.04%魚精蛋白、0.02%溶菌酶、0.02%卡拉膠為對照組，并按0.02%-聚賴氨酸為1，1:0.05、1:0.1、1:0.5、1:1混合，并做好標(biāo)記。（3）37恒溫培養(yǎng)作用

32、1h加入3L增強(qiáng)劑和1.2L染色劑混勻，繼續(xù)作用30min后5000r/min離心5min，棄上清液，加入二甲基亞砜5mL,混勻。待混合均勻后5000r/min離心5min，觀察其顏色變化。 觀察實驗結(jié)果，對照組果膠、葡聚糖、卡拉膠、無抑菌效果，顏色為深紅色。魚精蛋白有微小抑菌效果為紅色，-聚賴氨酸、溶菌酶有明顯抑菌效果，為淡紅色。按比例混合后，帶有陰離子的果膠、卡拉膠對-聚賴氨酸的抑菌效果有明顯抑制，顏色無變化，為紅色，微生物存活率較高。帶有陽離子的溶菌酶、魚精蛋白對-聚賴氨酸的抑菌效果有明顯增強(qiáng)，顏色為淡紅色，隨著比例的增加，顏色為無色，微生物存活率降低。帶中性電的葡聚糖對-聚賴氨酸的影響

33、隨著比例的增加，影響明顯，顏色由淡紅色至橙色，隨著比例的增加，微生物存活率降低。3-6 CTC活性染色大腸桿菌/枯草芽孢桿菌活菌制劑微生物存活率4 討論與結(jié)論考察了不同電荷生物聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性的影響。利用紫外-可見光掃描光譜分析-聚賴氨酸與不同帶電生物聚合物以及多陽離子肽相互作用，主要結(jié)論如下：果膠、卡拉膠分別與-聚賴氨酸混合，形成了沉淀。溶菌酶與-聚賴氨酸產(chǎn)生聚合物，光譜上發(fā)生明顯變化，其不同濃度比例使-聚賴氨酸抑菌活性得到提高。帶不同電荷生物聚合物對-聚賴氨酸的抑菌活性的影響不同。陽離子聚合物，隨濃度提高，-聚賴氨酸抑菌活性增強(qiáng)；帶負(fù)電的聚合物對-聚賴氨酸抑菌活性有不利影響，卡拉

34、膠的影響最大，果膠的影響最小，其濃度進(jìn)一步提高，-聚賴氨酸抑菌效果降低；不帶電的中性聚合物僅對-聚賴氨酸產(chǎn)生輕微影響。觀察各個抑菌圈，以硫酸魚精蛋白、溶菌酶的活性增效效果最強(qiáng)。利用96孔板觀察-聚賴氨酸與不同電荷的聚合物比例混合，得知-聚賴氨酸對大腸桿菌的最小抑菌濃度為0.003%，對枯草桿菌的最小抑菌濃度同為0.003%，其中按比例混合。溶菌酶與聚賴氨酸反應(yīng)：對-聚賴氨酸的抑菌效果有明顯的增強(qiáng)效果。葡聚糖與-聚賴氨酸反應(yīng)：葡聚糖對-聚賴氨酸無明顯影響。魚精蛋白與-聚賴氨酸反應(yīng)：-聚賴氨酸的抑菌效果有明顯的增強(qiáng)效果。果膠與-聚賴氨酸反應(yīng)：對-聚賴氨酸抑菌有明顯的減弱，隨著果膠比例的增加對-聚賴

35、氨酸的影響增加?？ɡz與-聚賴氨酸反應(yīng)：對-聚賴氨酸抑菌效果有明顯的減弱，隨著比例和濃度的增強(qiáng)對-聚賴氨酸的抑菌效果影響增強(qiáng)。利用CTC活性染色的實驗結(jié)果表明，帶有陰性點的果膠、卡拉膠對-聚賴氨酸的抑菌效果有抑制作用，帶有陽性電的溶菌酶和硫酸魚精蛋白有增強(qiáng)作用，帶中性電的葡聚糖對-聚賴氨酸的影響隨著濃度比例的增加，抑制效果增加。隨著社會發(fā)展人們開始對食品安全性食品添加劑的意識提高,化學(xué)防腐劑將面臨挑戰(zhàn), 天然、無毒、無副作用的高效的食品防腐劑即將成為今后社會的發(fā)展趨勢。-聚賴氨酸是一種天然的生物代謝產(chǎn)品,殺菌能力和和對熱穩(wěn)定性好，是一種良好的防腐性能的生物防腐劑。-聚賴氨酸近幾年成為了每個國家

36、食品安全添加劑的研究的重點。尤其是在日本對-聚賴氨酸的研究相對比較成熟，并進(jìn)行了批量的產(chǎn)品生產(chǎn)，但隨著學(xué)者的研究深入，-聚賴氨酸的潛力得到發(fā)掘，-聚賴氨酸有這對藥用和食品防腐劑的巨大潛力可供研究開發(fā)，并可開發(fā)投入使用。參 考 文 獻(xiàn)1吳曉英,林影,陳慧英. 溶菌酶的研究進(jìn)展J. 工業(yè)微生物,2002(04):55-58.2邢宇,郭麗娜,孫偉. 微生物源天然防腐劑在食品上的應(yīng)用研究J. 生物技術(shù),2012,22(06):93-96.3Shimas , Sakaih.Polylysine produced by Streptom ycesJ. Agric Biol Chem , 1977, 41: 1907-1909.4Shimas , Sakaih.Poly-L-lysine produced by Streptom yces.Part II.Taxonomy and ferm entation StudiesJ.Agric Biol Chem , 1981, 45:2497-2502.5