辛伐他汀對心衰心肌細胞肌漿網鈣泵的影響

1、 18只家兔，雌雄不拘，分為只家兔，雌雄不拘，分為3組組假手術組假手術組6只，只，心心力衰竭力衰竭組組 6只，辛伐他汀只，辛伐他汀干預干預組組 6只只(術后即予辛伐他汀術后即予辛伐他汀10mg/kg/d10mg/kg/d，至至實驗結束實驗結束)。2.實驗方法：實驗方法：2.1：心衰模型的建立（主動脈瓣損傷：心衰模型的建立（主動脈瓣損傷+ +腹腹主主動脈縮窄法）：動脈縮窄法）：用戊巴比妥麻醉家兔，從右側頸總動脈用用戊巴比妥麻醉家兔，從右側頸總動脈用4 4F F導管導管破壞主動脈瓣破壞主動脈瓣。2 2周后，進行腹主動脈縮窄。用戊巴比妥麻周后，進行腹主動脈縮窄。用戊巴比妥麻醉，打開腹腔，在腎動脈上方

2、，將腹主動脈縮醉，打開腹腔，在腎動脈上方，將腹主動脈縮窄窄50%50%左右。左右。觀察指標：包括呼吸、活動、進食、紫紺觀察指標：包括呼吸、活動、進食、紫紺情況。情況。藥物對左室重構的影響藥物對左室重構的影響 心臟超聲心臟超聲觀察心臟變化觀察心臟變化，觀察指標：左房，觀察指標：左房內徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚內徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、射血分數、左室縮短率。度、左室后壁厚度、射血分數、左室縮短率。 解剖學觀察藥物對心室重構的影響：觀察解剖學觀察藥物對心室重構的影響：觀察心臟心臟重量重量、左心室重量、心臟重量指數、左心室重量、心臟重量指數、左室重、左室

3、重量指數量指數。 血液動力學觀察：血液動力學觀察：觀察左觀察左室舒張末壓室舒張末壓、左、左室收縮末壓。室收縮末壓。2.2 RT-PCR檢測心肌組織檢測心肌組織PLB、SERCA2a mRNA表達表達: 抽提抽提mRNA 逆轉錄逆轉錄 擴增擴增 SERCA2a 正義引物：正義引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG； 反義引物：反義引物：R-CAGCACCATCAGCCACT； PLB 正義引物：正義引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA； 反義引物：反義引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； -actin 正義引物：正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCC

4、GCACGAT ； 反義引物：反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ； 擴增條件為擴增條件為94預變性預變性4min，然后進入，然后進入PCR循環(huán)循環(huán),94變性變性30s，55退火退火30s，72延伸延伸1min，循環(huán)，循環(huán)35次再延伸次再延伸7min。SERCA2a、PLB與與-actin擴增片段長度分別為擴增片段長度分別為464、368、231bp。 電泳電泳 圖像分析圖像分析 2.3 Western blot檢測心肌細胞膜檢測心肌細胞膜SERCA2a、細胞漿、細胞漿CaMK、PKA、PP1蛋白表達蛋白表達:提取提取心肌細胞膜心肌細胞膜、細胞漿蛋白、細胞漿蛋白；用用

5、BCA法測定蛋白濃度；法測定蛋白濃度；Western blot分別檢測心肌細胞膜分別檢測心肌細胞膜SERCA2a蛋白、細胞漿蛋白、細胞漿CaM、CaMK、PKA、PP1蛋白表達蛋白表達。 3 統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析 各組測得數值均以各組測得數值均以Xs表示，表示，組間均數比較組間均數比較采用采用ANOVA檢驗檢驗 （SAS6.12版本），版本），P0.05為為統(tǒng)計學有顯著差異。統(tǒng)計學有顯著差異。4.結結 果果4.1 3組觀察開始時組觀察開始時LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較：比較： 3組家兔手術前組家兔手術前 LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVID

6、s 、 FS及及EF無明顯差別（無明顯差別（p0.05） 4.2 3組觀察終止時組觀察終止時LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較：比較： 觀察終止時心衰組觀察終止時心衰組LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs較假手術組明顯增加較假手術組明顯增加（P0.05），而他汀組以上參數較心衰組明顯降低（），而他汀組以上參數較心衰組明顯降低（P0.05）；心衰組）；心衰組FS及及EF較假手術較假手術組明顯降低（組明顯降低（P0.05），而他汀組），而他汀組FS及及EF較心衰組明顯增加（較心衰組明顯增加（P0.05）4.3 3組血流動力學結果比較：組血流動力

7、學結果比較： 3組家兔手術前血流動力學無明顯差別；觀察終止時，心衰組組家兔手術前血流動力學無明顯差別；觀察終止時，心衰組HR、LVESP和和LVEDP較假手術組明顯增加（較假手術組明顯增加（P0.05）；而他汀組以上參數較心衰組明顯降低）；而他汀組以上參數較心衰組明顯降低（P0.05）4.4 3組心臟、左心室、心臟重量指數組心臟、左心室、心臟重量指數 、左室重量指數比較、左室重量指數比較： 心衰組家兔心臟外觀較假手術組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數、心衰組家兔心臟外觀較假手術組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數、左室重量指數明顯增加（左室重量指數明顯增加（P0.05）；

8、而他汀組以上參數明顯低于心衰組（）；而他汀組以上參數明顯低于心衰組（P0.05） 4.5 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a mRNA表達比較表達比較：表表1-6：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a mRNA表達比較表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的SERCA2a mRNA水平顯著低于假手術組，而辛水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的伐他汀組的SERCA2a mRNA水平明顯高于心衰組。水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后SERCA2a mRNA的的表達比較表達比較圖圖1-1圖圖1-2 4.6 三組心

9、肌組織三組心肌組織PLB mRNA表達比較：表達比較：表表1-7：三組心肌組織：三組心肌組織PLB mRNA表達比較表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的PLB mRNA水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的組的PLB mRNA水平明顯高于心衰組。水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后PLB mRNA的水平的水平表達比較表達比較圖圖1-3圖圖1-4 4.7 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a蛋白表達比較蛋白表達比較：表表1-8：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a蛋白蛋白表達比較

10、表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的SERCA2a蛋白水平顯著低于假手術組，而辛伐蛋白水平顯著低于假手術組，而辛伐他汀組的他汀組的SERCA2a蛋白水平明顯高于心衰組。蛋白水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后SERCA2a蛋白的表達比較蛋白的表達比較 圖圖1-5 圖圖1-6 4.8三組心肌組織三組心肌組織CaMK蛋白表達比較蛋白表達比較：表表1-9：三組心肌組織：三組心肌組織CaMK蛋蛋白白表達比較表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組

11、心肌細胞心衰組心肌細胞CaMK表達顯著高于假手術組，辛表達顯著高于假手術組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。伐他汀組顯著低于心衰組。 家兔家兔7周后周后CaMK蛋白的表達比較蛋白的表達比較 圖圖1-7 圖圖1-8 4.9 三組心肌組織三組心肌組織PKA蛋白表達比較蛋白表達比較：表表1-10：三組心肌組織：三組心肌組織PKA蛋白蛋白表達比較表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組心肌細胞心衰組心肌細胞PKA表達顯著低于假手術組，辛伐他表達顯著低于假手術組，辛伐他汀組顯著高于心衰組汀組顯著高于心衰組。家兔家兔7周后周后PKA蛋白

12、的表達比較蛋白的表達比較圖圖1-9圖圖1-10 4.10 三組心肌組織三組心肌組織PP1蛋白表達比較蛋白表達比較：表表1-11：三組心肌組織：三組心肌組織PP1蛋白蛋白表達比較表達比較注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組心肌細胞心衰組心肌細胞PP1表達顯著高于假手術組，辛伐表達顯著高于假手術組，辛伐他汀組顯著低于心衰組他汀組顯著低于心衰組。家兔家兔7周后周后PP1蛋白的表達比較蛋白的表達比較 圖圖1-11圖圖1-12 4.11 三組心肌組織三組心肌組織CaMK活性活性比較比較：表表1-12：三組心肌組織：三組心肌組織CaM

13、K活性活性比較比較 可見可見心衰組心衰組CaMK活活性明顯高于假手術組，辛性明顯高于假手術組，辛伐他汀組伐他汀組CaMK活性顯活性顯著低于心衰組著低于心衰組。圖圖1-13注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 4.12 三組心肌組織三組心肌組織PKA活性活性比較比較：表表1-13：三組心肌組織：三組心肌組織PKA活性活性比較比較 可見可見心衰組心衰組PKA活性活性明顯低于假手術組，辛明顯低于假手術組，辛伐他汀組伐他汀組PKA活性顯著活性顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-14注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組

14、比較P0.05。4.13 肌漿網囊泡的電鏡圖像：圖肌漿網囊泡的電鏡圖像：圖115 4.14 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a活性活性比較比較：表表1-14：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a活性比較活性比較 可見可見心衰組心衰組SERCA2a活活性明顯低于假手術組，辛伐性明顯低于假手術組，辛伐他汀組他汀組SERCA2a活性顯著活性顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-16注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 4.15 三組三組心肌細胞肌漿網攝鈣能力心肌細胞肌漿網攝鈣能力比較比較：表表1-15：三組：三組心肌細胞肌漿網攝鈣能力心肌細胞肌

15、漿網攝鈣能力比較比較 可見可見心衰組肌漿網攝鈣能心衰組肌漿網攝鈣能力明顯低于假手術組，辛伐力明顯低于假手術組，辛伐他汀組肌漿網攝鈣能力顯著他汀組肌漿網攝鈣能力顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-17注：與假手術組比較注：與假手術組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。圖圖1-18家兔心肌肌漿網外反應液家兔心肌肌漿網外反應液R值變化曲線值變化曲線假手術組假手術組辛伐他汀組辛伐他汀組心衰組心衰組5討討 論論 大多數研究表明大多數研究表明SERCA2a在心衰時基因和蛋白表達下降、在心衰時基因和蛋白表達下降、活性降低；活性降低；PLB表達減少。心衰時交感腎上腺素能神經系統(tǒng)興表達減少。心

16、衰時交感腎上腺素能神經系統(tǒng)興奮，高濃度兒茶酚胺長期慢性刺激引起心肌奮，高濃度兒茶酚胺長期慢性刺激引起心肌-腎上腺能受體密腎上腺能受體密度下調度下調,cAMP水平降低，水平降低，PKA活性下降，也有研究表明心衰時活性下降，也有研究表明心衰時PKA的表達下降。另外，心衰時的表達下降。另外，心衰時-腎上腺能受體密度下調可以腎上腺能受體密度下調可以引起引起PP1抑制劑活性降低從而導致抑制劑活性降低從而導致PP1的表達和活性的增高。的表達和活性的增高。PKA表達減小、活性降低，表達減小、活性降低，PP1表達增加、活性提高，引起表達增加、活性提高，引起PLB絲氨酸絲氨酸-16位點的磷酸化程度下降，對位點的

17、磷酸化程度下降，對SERCA2a的抑制加的抑制加強，進而導致強，進而導致SERCA2a活性降低，回攝鈣離子的能力下降，活性降低，回攝鈣離子的能力下降，細胞漿內鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在細胞漿內鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在SERCA2a活活性降低的情況下，性降低的情況下，NCX(鈉鈣交換體鈉鈣交換體)起到代償作用，起到代償作用，NCX將細將細胞漿內鈣離子轉運出細胞增多，胞漿內鈣離子轉運出細胞增多， 肌漿網回攝和儲存鈣減少，肌漿網回攝和儲存鈣減少，影響心肌的收縮功能。影響心肌的收縮功能。 心衰時心衰時PLB對對SERCA2a間接調節(jié)作用下降的同時，間接調節(jié)作用下降的同時，CaMK的的

18、直接調節(jié)作用增加。其表現為直接調節(jié)作用增加。其表現為CaMK表達和活性增加。但是表達和活性增加。但是CaMK的過表達又可引起心肌肥厚，進一步加重心力衰竭，形的過表達又可引起心肌肥厚，進一步加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)成惡性循環(huán)。 本實驗結果顯示心衰組本實驗結果顯示心衰組SERCA2a、PLB mRNA水平顯著下水平顯著下降，降，SERCA2a、PKA蛋白表達和活性降低，蛋白表達和活性降低，CaMK和和PP1蛋蛋白表達增加，白表達增加，CaMK活性增加，肌漿網的攝鈣能力降低。肌漿活性增加，肌漿網的攝鈣能力降低。肌漿網的攝鈣能力降低的原因一方面是因為網的攝鈣能力降低的原因一方面是因為SERCA2a蛋

19、白表達下降；蛋白表達下降；另一方面是因為另一方面是因為PKA蛋白表達和活性下降以及蛋白表達和活性下降以及PP1蛋白表達增蛋白表達增加可以引起加可以引起PLB的去磷酸化程度增加，進一步引起的去磷酸化程度增加，進一步引起SERCA2a活活性下降。所以性下降。所以SERCA2a活性（下降了活性（下降了44.5）和肌漿網的攝鈣）和肌漿網的攝鈣能力（下降了能力（下降了43.1）降低的程度較）降低的程度較SERCA2a蛋白表達（下降蛋白表達（下降了了32.4）下降的程度大，并不是與）下降的程度大，并不是與SERCA2a蛋白表達下降的蛋白表達下降的程度平行。程度平行。 研究表明血管緊張素研究表明血管緊張素可

20、以引起心衰大鼠的可以引起心衰大鼠的SERCA2a表表達和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的達和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的SERCA2a表達和表達和功能，群多普利可以提高心衰大鼠的功能，群多普利可以提高心衰大鼠的PLB水平，奧美沙坦能增水平，奧美沙坦能增加心衰大鼠的加心衰大鼠的SERCA2a、PLB和絲氨酸和絲氨酸-16位點磷酸化的位點磷酸化的PLB的表達，都提示心衰時的表達，都提示心衰時RAS系統(tǒng)參與引起了系統(tǒng)參與引起了SERCA2a表達和表達和功能的降低。功能的降低。 研究表明洛伐他汀可以抑制心肌研究表明洛伐他汀可以抑制心肌PP1的表達，提示洛伐他的表達，提示洛伐他汀的作用可以相當于心肌汀的作用可以相當于心肌PP1的抑制劑，抑制心肌的抑制劑，抑制心肌PP1的表