辛伐他汀對(duì)心衰心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)鈣泵的影響

1、 18只家兔，雌雄不拘，分為只家兔，雌雄不拘，分為3組組假手術(shù)組假手術(shù)組6只，只，心心力衰竭力衰竭組組 6只，辛伐他汀只，辛伐他汀干預(yù)干預(yù)組組 6只只(術(shù)后即予辛伐他汀術(shù)后即予辛伐他汀10mg/kg/d10mg/kg/d，至至實(shí)驗(yàn)結(jié)束實(shí)驗(yàn)結(jié)束)。2.實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：2.1：心衰模型的建立（主動(dòng)脈瓣損傷：心衰模型的建立（主動(dòng)脈瓣損傷+ +腹腹主主動(dòng)脈縮窄法）：動(dòng)脈縮窄法）：用戊巴比妥麻醉家兔，從右側(cè)頸總動(dòng)脈用用戊巴比妥麻醉家兔，從右側(cè)頸總動(dòng)脈用4 4F F導(dǎo)管導(dǎo)管破壞主動(dòng)脈瓣破壞主動(dòng)脈瓣。2 2周后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄。用戊巴比妥麻周后，進(jìn)行腹主動(dòng)脈縮窄。用戊巴比妥麻醉，打開腹腔，在腎動(dòng)脈上方

2、，將腹主動(dòng)脈縮醉，打開腹腔，在腎動(dòng)脈上方，將腹主動(dòng)脈縮窄窄50%50%左右。左右。觀察指標(biāo)：包括呼吸、活動(dòng)、進(jìn)食、紫紺觀察指標(biāo)：包括呼吸、活動(dòng)、進(jìn)食、紫紺情況。情況。藥物對(duì)左室重構(gòu)的影響藥物對(duì)左室重構(gòu)的影響 心臟超聲心臟超聲觀察心臟變化觀察心臟變化，觀察指標(biāo)：左房，觀察指標(biāo)：左房?jī)?nèi)徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚內(nèi)徑、左室舒張末徑、左室收縮末徑、室間隔厚度、左室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)、左室縮短率。度、左室后壁厚度、射血分?jǐn)?shù)、左室縮短率。 解剖學(xué)觀察藥物對(duì)心室重構(gòu)的影響：觀察解剖學(xué)觀察藥物對(duì)心室重構(gòu)的影響：觀察心臟心臟重量重量、左心室重量、心臟重量指數(shù)、左心室重量、心臟重量指數(shù)、左室重、左室

3、重量指數(shù)量指數(shù)。 血液動(dòng)力學(xué)觀察：血液動(dòng)力學(xué)觀察：觀察左觀察左室舒張末壓室舒張末壓、左、左室收縮末壓。室收縮末壓。2.2 RT-PCR檢測(cè)心肌組織檢測(cè)心肌組織PLB、SERCA2a mRNA表達(dá)表達(dá): 抽提抽提mRNA 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄 擴(kuò)增擴(kuò)增 SERCA2a 正義引物：正義引物：F-TGAATAAACCGCCTCGG； 反義引物：反義引物：R-CAGCACCATCAGCCACT； PLB 正義引物：正義引物：F-ACTTCCCAGCTACAAGCCCA； 反義引物：反義引物：R-CTGATGTGGGAAATGACGGA； -actin 正義引物：正義引物：F-CTTCTCCTTGATGTCCC

4、GCACGAT ； 反義引物：反義引物：R-GTGCTGTCCCTGTACGCCTCTGG ； 擴(kuò)增條件為擴(kuò)增條件為94預(yù)變性預(yù)變性4min，然后進(jìn)入，然后進(jìn)入PCR循環(huán)循環(huán),94變性變性30s，55退火退火30s，72延伸延伸1min，循環(huán)，循環(huán)35次再延伸次再延伸7min。SERCA2a、PLB與與-actin擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為464、368、231bp。 電泳電泳 圖像分析圖像分析 2.3 Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞膜檢測(cè)心肌細(xì)胞膜SERCA2a、細(xì)胞漿、細(xì)胞漿CaMK、PKA、PP1蛋白表達(dá)蛋白表達(dá):提取提取心肌細(xì)胞膜心肌細(xì)胞膜、細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞漿蛋白；用用

5、BCA法測(cè)定蛋白濃度；法測(cè)定蛋白濃度；Western blot分別檢測(cè)心肌細(xì)胞膜分別檢測(cè)心肌細(xì)胞膜SERCA2a蛋白、細(xì)胞漿蛋白、細(xì)胞漿CaM、CaMK、PKA、PP1蛋白表達(dá)蛋白表達(dá)。 3 統(tǒng)計(jì)分析統(tǒng)計(jì)分析 各組測(cè)得數(shù)值均以各組測(cè)得數(shù)值均以Xs表示，表示，組間均數(shù)比較組間均數(shù)比較采用采用ANOVA檢驗(yàn)檢驗(yàn) （SAS6.12版本），版本），P0.05為為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異。4.結(jié)結(jié) 果果4.1 3組觀察開始時(shí)組觀察開始時(shí)LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較：比較： 3組家兔手術(shù)前組家兔手術(shù)前 LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVID

6、s 、 FS及及EF無明顯差別（無明顯差別（p0.05） 4.2 3組觀察終止時(shí)組觀察終止時(shí)LAd、IVSD、LVIDd、LVIDs、LVPwd 、FS 、EF比較：比較： 觀察終止時(shí)心衰組觀察終止時(shí)心衰組LAd、IVSd、LVPwd、LVIDd、LVIDs較假手術(shù)組明顯增加較假手術(shù)組明顯增加（P0.05），而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低（），而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低（P0.05）；心衰組）；心衰組FS及及EF較假手術(shù)較假手術(shù)組明顯降低（組明顯降低（P0.05），而他汀組），而他汀組FS及及EF較心衰組明顯增加（較心衰組明顯增加（P0.05）4.3 3組血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果比較：組血流動(dòng)力

7、學(xué)結(jié)果比較： 3組家兔手術(shù)前血流動(dòng)力學(xué)無明顯差別；觀察終止時(shí)，心衰組組家兔手術(shù)前血流動(dòng)力學(xué)無明顯差別；觀察終止時(shí)，心衰組HR、LVESP和和LVEDP較假手術(shù)組明顯增加（較假手術(shù)組明顯增加（P0.05）；而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低）；而他汀組以上參數(shù)較心衰組明顯降低（P0.05）4.4 3組心臟、左心室、心臟重量指數(shù)組心臟、左心室、心臟重量指數(shù) 、左室重量指數(shù)比較、左室重量指數(shù)比較： 心衰組家兔心臟外觀較假手術(shù)組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數(shù)、心衰組家兔心臟外觀較假手術(shù)組明顯增大，且心臟重量、左室重量及心臟重量指數(shù)、左室重量指數(shù)明顯增加（左室重量指數(shù)明顯增加（P0.05）；

8、而他汀組以上參數(shù)明顯低于心衰組（）；而他汀組以上參數(shù)明顯低于心衰組（P0.05） 4.5 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)比較表達(dá)比較：表表1-6：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a mRNA表達(dá)比較表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的SERCA2a mRNA水平顯著低于假手術(shù)組，而辛水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀組的伐他汀組的SERCA2a mRNA水平明顯高于心衰組。水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后SERCA2a mRNA的的表達(dá)比較表達(dá)比較圖圖1-1圖圖1-2 4.6 三組心

9、肌組織三組心肌組織PLB mRNA表達(dá)比較：表達(dá)比較：表表1-7：三組心肌組織：三組心肌組織PLB mRNA表達(dá)比較表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的PLB mRNA水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀組的組的PLB mRNA水平明顯高于心衰組。水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后PLB mRNA的水平的水平表達(dá)比較表達(dá)比較圖圖1-3圖圖1-4 4.7 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a蛋白表達(dá)比較蛋白表達(dá)比較：表表1-8：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a蛋白蛋白表達(dá)比較

10、表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 心衰組的心衰組的SERCA2a蛋白水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐蛋白水平顯著低于假手術(shù)組，而辛伐他汀組的他汀組的SERCA2a蛋白水平明顯高于心衰組。蛋白水平明顯高于心衰組。 家兔家兔7周后周后SERCA2a蛋白的表達(dá)比較蛋白的表達(dá)比較 圖圖1-5 圖圖1-6 4.8三組心肌組織三組心肌組織CaMK蛋白表達(dá)比較蛋白表達(dá)比較：表表1-9：三組心肌組織：三組心肌組織CaMK蛋蛋白白表達(dá)比較表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組

11、心肌細(xì)胞心衰組心肌細(xì)胞CaMK表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，辛表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，辛伐他汀組顯著低于心衰組。伐他汀組顯著低于心衰組。 家兔家兔7周后周后CaMK蛋白的表達(dá)比較蛋白的表達(dá)比較 圖圖1-7 圖圖1-8 4.9 三組心肌組織三組心肌組織PKA蛋白表達(dá)比較蛋白表達(dá)比較：表表1-10：三組心肌組織：三組心肌組織PKA蛋白蛋白表達(dá)比較表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組心肌細(xì)胞心衰組心肌細(xì)胞PKA表達(dá)顯著低于假手術(shù)組，辛伐他表達(dá)顯著低于假手術(shù)組，辛伐他汀組顯著高于心衰組汀組顯著高于心衰組。家兔家兔7周后周后PKA蛋白

12、的表達(dá)比較蛋白的表達(dá)比較圖圖1-9圖圖1-10 4.10 三組心肌組織三組心肌組織PP1蛋白表達(dá)比較蛋白表達(dá)比較：表表1-11：三組心肌組織：三組心肌組織PP1蛋白蛋白表達(dá)比較表達(dá)比較注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05 ；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05 。 可見可見心衰組心肌細(xì)胞心衰組心肌細(xì)胞PP1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，辛伐表達(dá)顯著高于假手術(shù)組，辛伐他汀組顯著低于心衰組他汀組顯著低于心衰組。家兔家兔7周后周后PP1蛋白的表達(dá)比較蛋白的表達(dá)比較 圖圖1-11圖圖1-12 4.11 三組心肌組織三組心肌組織CaMK活性活性比較比較：表表1-12：三組心肌組織：三組心肌組織CaM

13、K活性活性比較比較 可見可見心衰組心衰組CaMK活活性明顯高于假手術(shù)組，辛性明顯高于假手術(shù)組，辛伐他汀組伐他汀組CaMK活性顯活性顯著低于心衰組著低于心衰組。圖圖1-13注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 4.12 三組心肌組織三組心肌組織PKA活性活性比較比較：表表1-13：三組心肌組織：三組心肌組織PKA活性活性比較比較 可見可見心衰組心衰組PKA活性活性明顯低于假手術(shù)組，辛明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組伐他汀組PKA活性顯著活性顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-14注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組

14、比較P0.05。4.13 肌漿網(wǎng)囊泡的電鏡圖像：圖肌漿網(wǎng)囊泡的電鏡圖像：圖115 4.14 三組心肌組織三組心肌組織SERCA2a活性活性比較比較：表表1-14：三組心肌組織：三組心肌組織SERCA2a活性比較活性比較 可見可見心衰組心衰組SERCA2a活活性明顯低于假手術(shù)組，辛伐性明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組他汀組SERCA2a活性顯著活性顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-16注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。 4.15 三組三組心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝鈣能力心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝鈣能力比較比較：表表1-15：三組：三組心肌細(xì)胞肌漿網(wǎng)攝鈣能力心肌細(xì)胞肌

15、漿網(wǎng)攝鈣能力比較比較 可見可見心衰組肌漿網(wǎng)攝鈣能心衰組肌漿網(wǎng)攝鈣能力明顯低于假手術(shù)組，辛伐力明顯低于假手術(shù)組，辛伐他汀組肌漿網(wǎng)攝鈣能力顯著他汀組肌漿網(wǎng)攝鈣能力顯著高于心衰組高于心衰組。圖圖1-17注：與假手術(shù)組比較注：與假手術(shù)組比較*P0.05；與心衰組比較；與心衰組比較P0.05。圖圖1-18家兔心肌肌漿網(wǎng)外反應(yīng)液家兔心肌肌漿網(wǎng)外反應(yīng)液R值變化曲線值變化曲線假手術(shù)組假手術(shù)組辛伐他汀組辛伐他汀組心衰組心衰組5討討 論論 大多數(shù)研究表明大多數(shù)研究表明SERCA2a在心衰時(shí)基因和蛋白表達(dá)下降、在心衰時(shí)基因和蛋白表達(dá)下降、活性降低；活性降低；PLB表達(dá)減少。心衰時(shí)交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興表達(dá)減少。心

16、衰時(shí)交感腎上腺素能神經(jīng)系統(tǒng)興奮，高濃度兒茶酚胺長(zhǎng)期慢性刺激引起心肌奮，高濃度兒茶酚胺長(zhǎng)期慢性刺激引起心肌-腎上腺能受體密腎上腺能受體密度下調(diào)度下調(diào),cAMP水平降低，水平降低，PKA活性下降，也有研究表明心衰時(shí)活性下降，也有研究表明心衰時(shí)PKA的表達(dá)下降。另外，心衰時(shí)的表達(dá)下降。另外，心衰時(shí)-腎上腺能受體密度下調(diào)可以腎上腺能受體密度下調(diào)可以引起引起PP1抑制劑活性降低從而導(dǎo)致抑制劑活性降低從而導(dǎo)致PP1的表達(dá)和活性的增高。的表達(dá)和活性的增高。PKA表達(dá)減小、活性降低，表達(dá)減小、活性降低，PP1表達(dá)增加、活性提高，引起表達(dá)增加、活性提高，引起PLB絲氨酸絲氨酸-16位點(diǎn)的磷酸化程度下降，對(duì)位點(diǎn)的

17、磷酸化程度下降，對(duì)SERCA2a的抑制加的抑制加強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致SERCA2a活性降低，回?cái)z鈣離子的能力下降，活性降低，回?cái)z鈣離子的能力下降，細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子增加，心肌的舒張功能降低。在SERCA2a活活性降低的情況下，性降低的情況下，NCX(鈉鈣交換體鈉鈣交換體)起到代償作用，起到代償作用，NCX將細(xì)將細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞增多，胞漿內(nèi)鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞增多， 肌漿網(wǎng)回?cái)z和儲(chǔ)存鈣減少，肌漿網(wǎng)回?cái)z和儲(chǔ)存鈣減少，影響心肌的收縮功能。影響心肌的收縮功能。 心衰時(shí)心衰時(shí)PLB對(duì)對(duì)SERCA2a間接調(diào)節(jié)作用下降的同時(shí)，間接調(diào)節(jié)作用下降的同時(shí)，CaMK的的

18、直接調(diào)節(jié)作用增加。其表現(xiàn)為直接調(diào)節(jié)作用增加。其表現(xiàn)為CaMK表達(dá)和活性增加。但是表達(dá)和活性增加。但是CaMK的過表達(dá)又可引起心肌肥厚，進(jìn)一步加重心力衰竭，形的過表達(dá)又可引起心肌肥厚，進(jìn)一步加重心力衰竭，形成惡性循環(huán)成惡性循環(huán)。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心衰組本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示心衰組SERCA2a、PLB mRNA水平顯著下水平顯著下降，降，SERCA2a、PKA蛋白表達(dá)和活性降低，蛋白表達(dá)和活性降低，CaMK和和PP1蛋蛋白表達(dá)增加，白表達(dá)增加，CaMK活性增加，肌漿網(wǎng)的攝鈣能力降低。肌漿活性增加，肌漿網(wǎng)的攝鈣能力降低。肌漿網(wǎng)的攝鈣能力降低的原因一方面是因?yàn)榫W(wǎng)的攝鈣能力降低的原因一方面是因?yàn)镾ERCA2a蛋

19、白表達(dá)下降；蛋白表達(dá)下降；另一方面是因?yàn)榱硪环矫媸且驗(yàn)镻KA蛋白表達(dá)和活性下降以及蛋白表達(dá)和活性下降以及PP1蛋白表達(dá)增蛋白表達(dá)增加可以引起加可以引起PLB的去磷酸化程度增加，進(jìn)一步引起的去磷酸化程度增加，進(jìn)一步引起SERCA2a活活性下降。所以性下降。所以SERCA2a活性（下降了活性（下降了44.5）和肌漿網(wǎng)的攝鈣）和肌漿網(wǎng)的攝鈣能力（下降了能力（下降了43.1）降低的程度較）降低的程度較SERCA2a蛋白表達(dá)（下降蛋白表達(dá)（下降了了32.4）下降的程度大，并不是與）下降的程度大，并不是與SERCA2a蛋白表達(dá)下降的蛋白表達(dá)下降的程度平行。程度平行。 研究表明血管緊張素研究表明血管緊張素可

20、以引起心衰大鼠的可以引起心衰大鼠的SERCA2a表表達(dá)和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的達(dá)和功能降低，氯沙坦可以提高心衰大鼠的SERCA2a表達(dá)和表達(dá)和功能，群多普利可以提高心衰大鼠的功能，群多普利可以提高心衰大鼠的PLB水平，奧美沙坦能增水平，奧美沙坦能增加心衰大鼠的加心衰大鼠的SERCA2a、PLB和絲氨酸和絲氨酸-16位點(diǎn)磷酸化的位點(diǎn)磷酸化的PLB的表達(dá)，都提示心衰時(shí)的表達(dá)，都提示心衰時(shí)RAS系統(tǒng)參與引起了系統(tǒng)參與引起了SERCA2a表達(dá)和表達(dá)和功能的降低。功能的降低。 研究表明洛伐他汀可以抑制心肌研究表明洛伐他汀可以抑制心肌PP1的表達(dá)，提示洛伐他的表達(dá)，提示洛伐他汀的作用可以相當(dāng)于心肌汀的作用可以相當(dāng)于心肌PP1的抑制劑，抑制心肌的抑制劑，抑制心肌PP1的表