第一章微生物的分離和純培養(yǎng)hw

1、第一章第一章 微生物培養(yǎng)技術(shù)微生物培養(yǎng)技術(shù)微生物: 結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單，個體多數(shù)十分微小，通結(jié)構(gòu)都相當(dāng)簡單，個體多數(shù)十分微小，通常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有常要用光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到，有的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。的甚至沒有細(xì)胞結(jié)構(gòu)。2 2、類群、類群1 1、特點、特點病毒（無細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）病毒（無細(xì)胞結(jié)構(gòu)、寄生生活）細(xì)菌細(xì)菌 電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌電子顯微鏡下的結(jié)核桿菌 放線菌放線菌真菌真菌青霉菌青霉菌酵母菌酵母菌原生生物原生生物病病 毒毒細(xì)細(xì) 菌菌放線菌放線菌真真 菌菌原生動物原生動物2 2、類群、類群無細(xì)胞結(jié)構(gòu)無細(xì)胞結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞原核細(xì)胞真核細(xì)胞真核細(xì)胞l微生物的分離和純培

2、養(yǎng)技術(shù)是微生微生物的分離和純培養(yǎng)技術(shù)是微生物最基本的實驗技術(shù)，它包括物最基本的實驗技術(shù)，它包括培養(yǎng)培養(yǎng)基的制備、滅菌和消毒、接種、培基的制備、滅菌和消毒、接種、培養(yǎng)養(yǎng)等步驟等步驟內(nèi)容提要：內(nèi)容提要：微生物及其分類微生物及其分類培養(yǎng)基與各類營養(yǎng)物質(zhì)培養(yǎng)基與各類營養(yǎng)物質(zhì)無菌技術(shù)無菌技術(shù)菌落菌落大腸桿菌的純化培養(yǎng)大腸桿菌的純化培養(yǎng)微生物數(shù)量的測定微生物數(shù)量的測定1 1、概念、概念二、培養(yǎng)基二、培養(yǎng)基 人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。營養(yǎng)基質(zhì)。按成分不同劃分按成分不同劃分天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基化

3、學(xué)成分不恒定的天然有機物化學(xué)成分不恒定的天然有機物牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。用于工業(yè)生產(chǎn)用于工業(yè)生產(chǎn)化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配化學(xué)成分完全了解的物質(zhì)配制而成的培養(yǎng)基制而成的培養(yǎng)基高氏高氏1 1號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)號培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基?；Ｓ糜诜诸惡丸b定用于分類和鑒定2 2、分類、分類按物理狀態(tài)不同劃分按物理狀態(tài)不同劃分固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入在液體培養(yǎng)基中加入一定量凝固劑一定量凝固劑，使其成為固體狀態(tài)，使其成為固體狀態(tài)，瓊脂瓊脂含量一般為含量一般為1.5%-2.0%1.5%-2.0%，固體培養(yǎng)基常用來進行，固體培養(yǎng)基常用來

4、進行微生物的微生物的分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌分離、鑒定、活菌計數(shù)及菌種保藏種保藏 瓊脂含量一般為瓊脂含量一般為0.2%-0.7%0.2%-0.7%，觀觀察微生物的運動特征察微生物的運動特征、分類鑒定、分類鑒定及噬菌體效價滴定及噬菌體效價滴定 不加任何凝固不加任何凝固劑劑，大規(guī)模工，大規(guī)模工業(yè)業(yè)生產(chǎn)生產(chǎn)及在實及在實驗室進行微生驗室進行微生物的基礎(chǔ)理論物的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用方面的和應(yīng)用方面的研究研究半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基按用途不同劃分按用途不同劃分基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基含有一般微生物生長繁殖所需的含有一般微生物生長繁殖所需的基本營基本營養(yǎng)物質(zhì)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）的培

5、養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）用來將某種或某類微生物從混雜的微用來將某種或某類微生物從混雜的微生物群體中生物群體中分離分離出來的培養(yǎng)基，在培出來的培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的養(yǎng)基中加入相應(yīng)的特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化特殊營養(yǎng)物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)學(xué)物質(zhì)，抑制不需要抑制不需要的微生物的生長，的微生物的生長，有利于所需有利于所需微生物的生長微生物的生長用于用于鑒別不同類型鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基，微生物的培養(yǎng)基，微生物產(chǎn)生某種微生物產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物代謝產(chǎn)物，與培養(yǎng)基與培養(yǎng)基中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反中的特殊化學(xué)物質(zhì)發(fā)生特定的化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征變化選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基3 3、基本營養(yǎng)、

6、基本營養(yǎng)碳源、氮源、能源、生長因子、水、無機鹽碳源、氮源、能源、生長因子、水、無機鹽碳源碳源無機碳源：無機碳源：有機碳源：有機碳源：COCO2 2、COCO3 32 2- -、HCOHCO3 3- -牛肉膏、蛋白胨等牛肉膏、蛋白胨等自養(yǎng)微生物自養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物異養(yǎng)微生物氮源氮源無機氮源：無機氮源：有機氮源：有機氮源：NHNH4 4、NONO3 3- -牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、尿素等等含含CHONCHON的的有機物有機物是是異養(yǎng)異養(yǎng)型微生物的型微生物的碳源、氮源、能源碳源、氮源、能源(3)(3)能源能源（4 4）生長因子：）生長因子： 微生物生長不可缺少的微量有機物

7、，如：微生物生長不可缺少的微量有機物，如：維生素、氨基酸、堿基等（牛肉膏、酵母膏、維生素、氨基酸、堿基等（牛肉膏、酵母膏、蛋白胨中含有）。蛋白胨中含有）。 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基 培養(yǎng)基組分培養(yǎng)基組分作用瓊脂瓊脂 20g 20g 牛肉膏牛肉膏 5g5g蛋白胨蛋白胨 10g10gNaCl 5gNaCl 5gH H2 2O O 定容至定容至1000ml1000ml1000ml1000ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的配方凝固劑凝固劑提供碳源、氮源、能源、生長因子提供碳源、氮源、能源、生長因子碳源、氮源

8、、生長因子碳源、氮源、生長因子無機鹽無機鹽水、溶劑水、溶劑選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基應(yīng)用應(yīng)用加入加入青霉素青霉素加入加入高濃度食鹽高濃度食鹽不加氮源不加氮源不加含碳有機物不加含碳有機物的無碳的無碳培養(yǎng)基培養(yǎng)基加入加入青霉素等抗生素青霉素等抗生素延伸：延伸：分離酵母菌、霉菌等真菌分離酵母菌、霉菌等真菌分離金黃色葡萄球菌分離金黃色葡萄球菌分離固氮菌分離固氮菌分離自養(yǎng)型微生物分離自養(yǎng)型微生物分離導(dǎo)入了目的基因的分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞受體細(xì)胞鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基:l加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（加入伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMS培養(yǎng)基）培養(yǎng)基）l鑒別大腸桿菌鑒別大腸桿菌l現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤現(xiàn)象：藍(lán)紫色金屬光澤

9、4.培養(yǎng)基要滿足微生物對環(huán)境條件的需求培養(yǎng)基要滿足微生物對環(huán)境條件的需求 ：真菌真菌 微酸性（微酸性（5.0-6.05.0-6.0）細(xì)菌細(xì)菌 中性（中性（6.5-7.56.5-7.5）放線菌放線菌 微堿性（微堿性（7.5-8.57.5-8.5）大多數(shù)微生物適宜生長的溫度在大多數(shù)微生物適宜生長的溫度在25-4025-40之間之間厭氧菌需提供無氧條件厭氧菌需提供無氧條件pH：溫度：溫度：氧氣：氧氣：1.1.滅菌：滅菌：使用使用強烈強烈的理化因素殺死物體內(nèi)的理化因素殺死物體內(nèi)外外所有所有的微生物，包括芽孢和孢子。的微生物，包括芽孢和孢子。三三. .無菌技術(shù)：無菌技術(shù)： 泛指在培養(yǎng)微生物的操作中，泛指

10、在培養(yǎng)微生物的操作中，防止外來雜菌的污染的方法防止外來雜菌的污染的方法灼燒滅菌灼燒滅菌干熱滅菌箱干熱滅菌箱高壓蒸汽滅菌鍋高壓蒸汽滅菌鍋2 2、消毒、消毒使用較為使用較為溫和溫和的物理或化學(xué)方法殺的物理或化學(xué)方法殺死物體表面或內(nèi)部的死物體表面或內(nèi)部的部分部分微生物（微生物（不包不包括芽孢和孢子括芽孢和孢子）。）。煮沸消毒法：煮沸消毒法：100 5-6min巴氏消毒法：巴氏消毒法：70-75 30min或或80 15min化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣化學(xué)藥劑消毒法：酒精、氯氣紫外線消毒：實驗前紫外線消毒：實驗前30min超凈臺超凈臺煮沸煮沸消毒消毒法法巴氏消毒法巴氏消毒法化學(xué)藥劑（化學(xué)藥劑（70%酒

11、精等）酒精等）紫外線紫外線針對不耐高溫的液體針對不耐高溫的液體接種室、超凈工作臺接種室、超凈工作臺能耐高溫的，需要保持干燥的物品能耐高溫的，需要保持干燥的物品灼燒法灼燒法干熱滅菌干熱滅菌高壓蒸汽滅菌高壓蒸汽滅菌接種工具（接種環(huán)等）接種工具（接種環(huán)等）實驗操作者的雙手實驗操作者的雙手培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)皿等玻璃器皿培養(yǎng)基培養(yǎng)基消毒方法消毒方法滅菌方法滅菌方法實驗操作者的衣服實驗操作者的衣服單個單個或少數(shù)菌體或少數(shù)菌體2.2.特征：特征：大小、形狀、光澤度、大小、形狀、光澤度、顏色、透明度等。顏色、透明度等。3.3.功能：功能：1.1.定義：定義：四、菌落四、菌落鑒定菌種鑒定菌種的重要依據(jù)的重要依

12、據(jù)固體固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上大量繁殖大量繁殖子細(xì)胞群體子細(xì)胞群體五、微生物的分離和純培養(yǎng)五、微生物的分離和純培養(yǎng)分散成單個細(xì)胞分散成單個細(xì)胞, ,形成單個菌落形成單個菌落1 1、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基、制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）（大腸桿菌分離和純培養(yǎng)）計算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）計算、稱量（配制固體培養(yǎng)基要加入瓊脂）溶化溶化調(diào)調(diào)pH(pH(注意：滅菌前調(diào)注意：滅菌前調(diào)PH)PH)分裝、包扎分裝、包扎滅菌（高壓蒸汽滅菌）滅菌（高壓蒸汽滅菌）倒平板倒平板倒平板技術(shù)倒平板技術(shù)1234使瓶口迅速使瓶口迅速通過火焰通過火焰在火焰旁打開在火焰旁打開錐形瓶錐形瓶打開一條稍

13、大于打開一條稍大于瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿瓶口的縫隙，向培養(yǎng)皿中倒入中倒入 約約10-20ml倒入倒入培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。培養(yǎng)皿，立即蓋上皿蓋。等待平板冷卻凝固等待平板冷卻凝固后倒置后倒置 1. 1.培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 50 左右時，才能用來倒平板。你用什么辦左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？法來估計培養(yǎng)基的溫度？ 可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。剛不燙手時，就可以進行倒平板了。 2.2.為什么需要使錐形瓶的瓶口通為什么需要使錐形

14、瓶的瓶口通過火焰？過火焰？ 通過灼燒滅菌，防止瓶口的通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。微生物污染培養(yǎng)基。3.3.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？平板冷凝后，為什么要將平板倒置？ 平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]以使培養(yǎng)基表面的水分更好地?fù)]發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。入培養(yǎng)基，造成污染。 4.4.在倒平板的過程中，如果不小在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部心將培養(yǎng)

15、基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？為什么？ 空氣中的微生物可能在皿蓋與空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。2 2、接種、接種平板劃線法平板劃線法交叉劃線法交叉劃線法連續(xù)劃線法連續(xù)劃線法1 1、將接種環(huán)放在、將接種環(huán)放在火焰上灼燒，直火焰上灼燒，直到接種環(huán)到接種環(huán)_2 2、在、在_旁旁冷卻接種環(huán)，并冷卻接種環(huán)，并打開棉塞打開棉塞 3 3、將試管口通過火焰、將試管口通過火焰 4 4、將已、將已_的接種環(huán)的接種環(huán)伸入菌液中蘸取一環(huán)

16、菌液伸入菌液中蘸取一環(huán)菌液 6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入手將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，平板內(nèi)，劃劃_條平行線，條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。蓋上皿蓋。注意不要劃破培養(yǎng)基。5 5、將試管通過、將試管通過火焰，并塞上棉火焰，并塞上棉塞塞 火焰火焰冷卻冷卻三至五三至五7 7、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，、灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一區(qū)域劃線的從第一區(qū)域劃線的_開開始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以始往第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)以上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)上操作，在三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。劃線。注意不要將最后一區(qū)的注意不要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)

17、相連。劃線與第一區(qū)相連。末端末端燒紅燒紅8、將平板、將平板_放入培養(yǎng)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。箱中培養(yǎng)。 倒置倒置 為什么在操作的第一步以及每次劃線之前為什么在操作的第一步以及每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物。可能存在的微生物污染培養(yǎng)物。殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，殺死上次殘留的菌種，保證使下一次劃線時，菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通

18、過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到菌落。減少，以便得到菌落。及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。環(huán)境和感染操作者。6 6支試管，分別加入支試管，分別加入9ml9ml無菌水無菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106稀釋涂布平板法稀釋涂布平板法a.a.梯度稀釋菌液：梯度稀釋菌液：菌液菌液b.b.涂布平板：涂布平板：滴滴灼灼試試涂涂取取0.1ml0.1ml菌懸液菌懸液微量微量 移液器移液器Pour plate(3)(3)稀釋混合平板法（課本

19、稀釋混合平板法（課本P14)P14) 將將接種后接種后的培養(yǎng)基和一個的培養(yǎng)基和一個未接種未接種的培養(yǎng)基，放的培養(yǎng)基，放入入3737恒溫箱中恒溫箱中倒置倒置培養(yǎng)培養(yǎng)12h-24h,12h-24h,直到長出菌落為直到長出菌落為止。止。3 3、培養(yǎng)、培養(yǎng)4 4、實實驗驗結(jié)結(jié)果果觀觀察察5 5、菌株的保存方、菌株的保存方法法（1）臨時保藏：）臨時保藏：接種到接種到固體斜面固體斜面培養(yǎng)基，菌培養(yǎng)基，菌落長成后置于落長成后置于44冰箱保存。冰箱保存。（2）長期保存：）長期保存： 甘油冷凍管藏法甘油冷凍管藏法擱置斜面擱置斜面六、微生物數(shù)量的計算直接計數(shù)法直接計數(shù)法間接計數(shù)法間接計數(shù)法（一）直接計數(shù)法（一）直

20、接計數(shù)法 顯微鏡直接計數(shù)法顯微鏡直接計數(shù)法 將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放將待測樣品制成懸液，然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進行計數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微在顯微鏡下進行計數(shù)。根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來計算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用生物數(shù)目來計算出體積內(nèi)的微生物總數(shù)。一般適用于純培養(yǎng)液懸浮液中單細(xì)胞菌體的計數(shù)。于純培養(yǎng)液懸浮液中單細(xì)胞菌體的計數(shù)。v優(yōu)點：優(yōu)點：直觀、快速、操作簡單直觀、快速、操作簡單v缺點：缺點：不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不能區(qū)分死菌與活菌，所得為總數(shù)，結(jié)果往往偏高不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)不適于對運動細(xì)菌的計數(shù)需要相對高的細(xì)菌濃度需要相對

21、高的細(xì)菌濃度個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察個體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察1 1、血球計數(shù)板、血球計數(shù)板 計數(shù)板是一塊特制的計數(shù)板是一塊特制的厚玻璃片，玻片上有四個厚玻璃片，玻片上有四個槽構(gòu)成三個平臺，中央平槽構(gòu)成三個平臺，中央平臺又由一短槽隔成兩半，臺又由一短槽隔成兩半，其上各刻有一小方格網(wǎng)。其上各刻有一小方格網(wǎng)。 每個方格網(wǎng)共分九個每個方格網(wǎng)共分九個大格，中央的一大格作為大格，中央的一大格作為計數(shù)用，稱為計數(shù)室。計數(shù)用，稱為計數(shù)室。*#血球計數(shù)板計數(shù)室有兩種刻度血球計數(shù)板計數(shù)室有兩種刻度1大格大格=16中格中格2516=400小格小格1大格大格=25中格中格16 25 =400小格小格 計數(shù)

22、室邊長為計數(shù)室邊長為1mm，則計數(shù)，則計數(shù)區(qū)的面積為區(qū)的面積為l11 mm2，蓋，蓋上蓋玻片后計數(shù)室高度為上蓋玻片后計數(shù)室高度為0.1mm，所以一個計數(shù)室的體，所以一個計數(shù)室的體積為積為l0.10.1mm3。(注意：注意：1 ml 1000 mm3 )計數(shù)室容積1 1、稀釋、稀釋 用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。用無菌生理鹽水將待測菌稀釋成適當(dāng)濃度的菌懸液。2 2、鏡檢計數(shù)室、鏡檢計數(shù)室 加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢，若有污物，則用自來水沖洗，加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢，若有污物，則用自來水沖洗，95%95%乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。乙醇棉球輕

23、輕擦洗，然后用吸水紙吸干或電吹風(fēng)吹干。3 3、加樣、加樣 取潔凈的血球計數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取取潔凈的血球計數(shù)板一塊，蓋上蓋玻片。將菌懸液搖勻，用無菌滴管吸取少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，少許，沿蓋玻片邊緣滴入一小滴，讓菌液利用液體的表面張力充滿計數(shù)區(qū)，靜置靜置5min5min。 注：取樣時先要搖勻菌液，加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生注：取樣時先要搖勻菌液，加樣時計數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生2、操作步驟4 4、顯微鏡計數(shù)（以、顯微鏡計數(shù)（以1616小格小格 2525中格的中格的 規(guī)格為例）規(guī)格為例） 在高倍下在高倍下(40X)(40X)計數(shù)對

24、兩個計數(shù)室記數(shù)，方法：每個計數(shù)室選計數(shù)對兩個計數(shù)室記數(shù)，方法：每個計數(shù)室選5 5個中格個中格(4(4個角和中央的一個中格個角和中央的一個中格) )中的菌體進行計數(shù)，求得每個中中的菌體進行計數(shù)，求得每個中方格的平均值，再乘上方格的平均值，再乘上2525即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成即為大方格中的總菌數(shù)，最后換算成1ml1ml菌液中的總菌數(shù)。菌液中的總菌數(shù)。 注：依照注：依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“的原則進行計數(shù)的原則進行計數(shù) 計數(shù)時應(yīng)不時調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體計數(shù)時應(yīng)不時調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體 一般樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有一般樣品稀釋度要求每小

25、格內(nèi)約有510510個菌體為宜個菌體為宜 計數(shù)的結(jié)果是兩個計數(shù)室所記菌數(shù)的平均值計數(shù)的結(jié)果是兩個計數(shù)室所記菌數(shù)的平均值5 5、清洗血球計數(shù)板、清洗血球計數(shù)板 計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬計數(shù)完畢，將血球計數(shù)板在水龍頭下流水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉物洗刷，洗完后電吹風(fēng)吹干，鏡檢確認(rèn)計數(shù)區(qū)無殘留菌體或其它沉淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。淀。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。3、計數(shù)方法v所統(tǒng)計的中格的總菌數(shù)所統(tǒng)計的中格的總菌數(shù)A A，菌液的稀釋倍數(shù)為，菌液的稀釋倍數(shù)為B B，則，則1ml1ml菌液中：菌液中：

26、 (1) 25(1) 25個中方格的計數(shù)板計算公式個中方格的計數(shù)板計算公式(2) 162) 16個中方格的計數(shù)板計算公式個中方格的計數(shù)板計算公式）（個總菌數(shù)mlBABA/50000102554）（個總菌數(shù)mlBAB/4000010164A4（二）間接計數(shù)法（二）間接計數(shù)法 稀釋平板計數(shù)法稀釋平板計數(shù)法 將待測樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分將待測樣品按比例做一系列稀釋后，將其中的微生物充分分散成單個細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平分散成單個細(xì)胞，取一定稀釋度、一定量的稀釋樣液接種到平板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基內(nèi)；或是將一定量的稀板上，使其均勻分布于平板中的培養(yǎng)基

27、內(nèi)；或是將一定量的稀釋液，與溶化后冷卻至釋液，與溶化后冷卻至4545左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，傾入無菌培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。培養(yǎng)皿中，搖勻、靜置待凝。 經(jīng)過培養(yǎng)，由單個微生物生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，經(jīng)過培養(yǎng)，由單個微生物生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個菌落代表樣品中的一個微生物個體。統(tǒng)計培養(yǎng)基中的出即一個菌落代表樣品中的一個微生物個體。統(tǒng)計培養(yǎng)基中的出現(xiàn)的菌落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)?，F(xiàn)的菌落，即可推算出樣品中的活菌數(shù)。l能檢測活菌數(shù)和雜菌數(shù)能檢測活菌數(shù)和雜菌數(shù)l時間長，繁瑣，測定值時常受各種因素影響時間長，繁瑣，測定值時常受各種因素影響l由于待測樣品

28、往往不宜完全分散成單個細(xì)胞，所由于待測樣品往往不宜完全分散成單個細(xì)胞，所以，長成一個單菌落也可能來自樣品中的以，長成一個單菌落也可能來自樣品中的2-32-3或更或更多個細(xì)胞。因此，平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低多個細(xì)胞。因此，平板菌落計數(shù)的結(jié)果往往偏低優(yōu)缺點：編號編號 稀釋菌樣稀釋菌樣 吸取菌樣吸取菌樣傾注平板傾注平板 恒溫培養(yǎng)恒溫培養(yǎng) 計數(shù)計數(shù)1、操作步驟104 105 106原樣 101 102 103 104 105 1060.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.2ml0.2ml0.2ml0.5ml0.5ml6支試管，分支試管，分別加入別加入4.5ml無菌水無菌水2、計數(shù)原則（1 1）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有）細(xì)菌、放線菌、酵母菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)有30-30030-300個個菌落為宜，霉菌以每個培養(yǎng)皿內(nèi)