DNA片段從瓊脂糖凝膠中的分離

1、實驗十實驗十 片段從瓊脂糖凝膠片段從瓊脂糖凝膠中的分離中的分離DNA fragment recovery from the agrose gel一實驗?zāi)康募氨尘耙粚嶒災(zāi)康募氨尘皐在生物技術(shù)實驗中，反應(yīng)獲得的目的片段，酶切后所得特定的序列， 分子雜交中所制備的探針等，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，目的片段與其它分開， 這就需要有一套方法將目的從凝膠中分離出來，通過處理后得到純化的目的， 以用于以后分子雜交，重組子構(gòu)建，序列分析等.從凝膠中分離回收的方法現(xiàn)在常用的技術(shù)有：w電洗脫法w 低熔點瓊脂糖凝膠法w濾膜插片法等w其中電洗脫法，經(jīng)濟節(jié)省，操作方便， 對的回收效果好。低熔點瓊脂糖凝膠法w65oC瓊脂糖凝

2、膠熔點w低熔點瓊脂糖凝膠 37oC 液體濾膜插片法wHigh efficientwDNA high quality for microinjectionw5kb fragmentw100ng DNA fragmentw10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutesw0.5 mol/L NaOH 5 minutesw低鹽緩沖液50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)w高鹽緩沖液50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)電洗脫法基本原理w將電泳分離后含目的片段的瓊脂糖切割下來， 裝于透析袋

3、中，繼續(xù)在高電壓下電泳，這時目的會從凝膠中電泳出進入透析袋中， 由于分子量大，不能透過透析袋，從而保留于透析袋中。w取出透析袋中含的溶液， 進一步用酚、氯仿抽提純化。二實驗試劑及儀器二實驗試劑及儀器wNaHCO3 2%wEDTA-Na2 0.01MwTBE電泳液10.8g Tris堿0.93g EDTA5.5g 硼酸 調(diào)pH8.2 定容1000ml瓊脂糖 透析袋 酚 氯仿 乙醇 三、實驗方法實驗方法w一、透析袋的處理：w切取適當(dāng)長度適析袋。w在NaHCO3 1mM EDTA溶液中煮沸分鐘。w棄去煮沸液，加無菌水內(nèi)外反復(fù)洗凈透析袋。二、電洗脫w在長波紫外燈下（nm ）將含目標(biāo)片段的凝膠條帶切下裝

4、入透析袋中。w向透析袋內(nèi)加入ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡。w將透析袋水平放入電泳槽（長度方向與電泳平行）， 加入適量緩沖液將透析袋浸沒（約mm）。w接通電源，伏電洗，在紫外燈下觀察待全部移出凝膠。w改變電場方向繼續(xù)通電分鐘。w從透析袋中吸出緩沖液于ml Eppendorf管中。w加入倍體積正丁醇，混勻抽提去。w在臺式離心機上最高速分鐘。w吸去上層，正丁醇溶液。w重復(fù)，二次。w自下層言的溶液中加入等體積酚氯仿（個）抽提次。w上清轉(zhuǎn)入另一Eppendorf管中加入1/10倍體積3M NaAc 倍體積預(yù)冷無水乙醇，于過夜。w12000g，4下離心分鐘，得沉淀。w棄上清，加入乙醇洗滌次后棄

5、干乙醇。w加入l 溶解。w取l 溶液加入2l Loading buffer于瓊脂糖上， 伏電泳，小時。w在紫外透射儀上觀察結(jié)果。w測定溶液OD260,OD280值。結(jié)果與分析結(jié)果與分析w計算回收效率，判斷純度。w記錄電泳結(jié)果w問題與討論：w電洗脫過程后，為什么要反向電泳分鐘？w電洗脫后的如何去除？玻璃奶法快速純化回收玻璃奶法快速純化回收DNA片段片段本方法有多種用途，主要包括：w從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段；w從DNA反應(yīng)物中純化目的DNA片段，如回收純化PCR產(chǎn)物、酶切連接反應(yīng)中的DNA片段；w從探針制備反應(yīng)物中去除未標(biāo)記上的核苷酸以及小的DNA片段（比如引物）；wDNA濃縮、去鹽及去除

6、雜質(zhì)。w本試劑盒的主要成分“基因純”試劑是無毒、無味、無腐蝕作用的白色顆粒，能專一性結(jié)合0.2kb到50kb大小的DNA（雙鏈或單鏈，線性、環(huán)狀或超螺旋），不結(jié)合RNA、蛋白質(zhì)、寡聚核苷酸、有機溶劑、去污劑及其它可能抑制酶活性的有機或無機物。使用本法回收DNA片段有以下優(yōu)點：w高純度高純度：回收的DNA片段基本上不含RNA、蛋白質(zhì)及其它有機分子，可直接用于酶切、連接、探針制備、序列測定等；w簡便簡便：所需主要儀器是一架臺式離心機；w快速快速：整個回收過程只需半個小時；w高效高效：回收得率達(dá)到70%以上；w多用途多用途：可以同時作膠回收、PCR產(chǎn)物回收、DNA片段及探針的純化濃縮等；w安全安全：

7、不接觸苯酚、氯仿等有害物質(zhì)。二、試劑盒組成二、試劑盒組成w1碘化鈉溶液： 50mlw2DNA洗滌液（20倍濃縮液）：10mlw3“基因純”試劑： 1mlw4超純水： 1mlw使用前，將DNA洗滌濃縮液（10ml）倒入一玻璃瓶中，加140ml無水乙醇及50ml蒸餾水（由使用者自配），混勻后置于-20冰箱中，其余溶液置于4冰箱。三、操作步驟三、操作步驟w從瓊脂糖凝膠中分離純化從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段片段a. 常規(guī)DNA電泳。按常規(guī)方法用溴化乙錠（EB）染色DNA，而后將欲分離的DNA帶從膠上切割下來，置于一1.5ml離心管中。b. 稱出凝膠帶的重量，加入三倍量（V/W）的碘化鈉溶液。（如0

8、.1g凝膠中加入0.3ml碘化鈉溶液）。c. 置于55水浴5-10分鐘，直至凝膠完全溶化。d. 加入20ul充分混勻的“基因純”試劑（建議使用前用漩渦振蕩器振蕩3分鐘），室溫放置5分鐘（期間不時將管子顛倒幾次以混勻）。e. 離心10秒（10,000rpm），倒去上清液。f. 加0.8ml剛從冰箱中取出的DNA洗滌液，充分搖勻，離心10秒，去上清。g. 重復(fù)步驟f兩次（共洗滌三次）。h. 用吸水紙仔細(xì)將管壁上及管底殘留的洗滌液吸干。i. 加入20ul超純水，混勻后置于55水浴5分鐘。j. 離心3分鐘，將上清液小心吸至另一個離心管，即為純化的DNA。可直接用于酶切、亞克隆、PCR、標(biāo)記、探針制備、

9、序列測定、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等。注意事項注意事項：w溴化乙錠染色后的DNA易受紫外光破壞，故盡量放置于暗室，切帶時應(yīng)使用長波長紫外燈，切膠時間盡量短。wDNA洗滌液應(yīng)保持在低溫，否則可能使DNA從“基因純”試劑上脫落而導(dǎo)致回收率降低。w步驟h是另一關(guān)鍵，管壁和管底殘留的洗滌液若不完全除去，可能導(dǎo)致“基因純”試劑上結(jié)合的DNA無法由蒸餾水洗脫。PCR反應(yīng)物中純化目的反應(yīng)物中純化目的DNA片段片段PCR反應(yīng)完畢后，加蒸餾水至100ul（最后體積）。加入300ul碘化鈉溶液，混勻。以下步驟與“從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段”中步驟d到j(luò)相同。從探針制備反應(yīng)中除去未標(biāo)記上的核從探針制備反應(yīng)中除去未標(biāo)記上的核苷酸及小的苷酸及小的DNA片段片段探針制備反應(yīng)完畢后，加蒸餾水至100ul（最后體積）。加入300ul碘化鈉溶液，混勻。以下步驟與“從瓊脂糖凝膠中分離純化DNA片段”中步驟d到j(luò)相同。DNA濃縮，去鹽及去除雜質(zhì)濃縮，去鹽及去除雜質(zhì)加入3倍量的碘化鈉溶液于