長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)管理論文

1、長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)管理論文 摘要：實(shí)驗(yàn)研究了不同種類、不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)組合和其他四種理化因子對(duì)長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。以前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)我蜃右?，4-D效果最好。其中以2，4-D的最佳濃度為0.5mg/L。而本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明:組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA為最佳。在其它的四種理化因子中，1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。蔗糖的最佳濃度為30g/L；葡萄糖在研究范圍內(nèi)隨著濃度的增加，生長(zhǎng)速度也在增加。最適于長(zhǎng)春花的PH值為5.0-5.4。 關(guān)鍵詞：長(zhǎng)春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)理化因子

2、 一、引言 長(zhǎng)春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）屬于夾竹桃科（Apocynaceae）長(zhǎng)春花屬1。為多年生草本。原產(chǎn)于非洲東南部，現(xiàn)在我國(guó)各地均有栽培。長(zhǎng)春花用途廣泛，主要含具有抗腫瘤作用的生物堿長(zhǎng)春堿和長(zhǎng)春新堿等2。長(zhǎng)春花組織和細(xì)胞培養(yǎng)的研究已經(jīng)有很多年，多數(shù)應(yīng)用于大量細(xì)胞生產(chǎn)和植物的再生，以成分分析、提取為主，應(yīng)用于次生代謝產(chǎn)物的提取卻很少3。 長(zhǎng)春花的懸浮培養(yǎng)的就是植物細(xì)胞工業(yè)化的必經(jīng)步驟和固體培養(yǎng)基相比，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有繁殖速度快、能大規(guī)模培養(yǎng)和提供大量均勻一致的植物細(xì)胞培養(yǎng)物的特點(diǎn)。然而長(zhǎng)春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)技術(shù)并不完善，在國(guó)內(nèi)外很少有此類報(bào)道。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

3、受到許多外界條件的影響。如激素、溫度、光照、營(yíng)養(yǎng)、PH值等。本文就這方面選取了不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)種類、濃度組合以及其他的四種理化因子來培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，以便獲得細(xì)胞快速增殖的最佳培養(yǎng)條件。 二、材料與方法 1材料 長(zhǎng)春花（Catharanthusroseus(L.)G.Don）取自中科院武漢植物園 2愈傷組織的誘導(dǎo) 取春天4月份的長(zhǎng)春花幼嫩的葉片，為誘導(dǎo)及大量繁殖，必須對(duì)外植體進(jìn)行挑選4，用自來水沖洗1-2個(gè)小時(shí)，濾紙吸干，用75%的酒精侵泡30S后，用0.1%的升汞消毒8min，無菌水沖洗數(shù)遍。切成0.5cm0.5cm的小塊。接種于含0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg

4、/L6-BA（本文所用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑購(gòu)于上海，配成1mg/mL的母液）、瓊脂7g/L、蔗糖30g/L的MS固體培養(yǎng)基上（PH=5.8，高壓滅菌）在光強(qiáng)為40mol/ms12-14h/d.溫度為252條件先誘導(dǎo)5。 3愈傷組織的篩選及細(xì)胞懸浮系的建立6 誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于含50ml固體培養(yǎng)基的150ml的三角瓶中，每瓶的接種量約3g。愈傷組織每25天繼代一次。經(jīng)3-5次繼代后，選擇生長(zhǎng)均一、質(zhì)地疏松、分散性好的愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中。每150ml三角瓶中分裝40ml的液體培養(yǎng)基（同上的固體培養(yǎng)基去掉瓊脂，以下的實(shí)驗(yàn)沒有特別說明的都是該種培養(yǎng)基）。每次接種量約為2g。懸浮培養(yǎng)采用旋轉(zhuǎn)式搖床，轉(zhuǎn)

5、速為120r/min。置于光照下培養(yǎng)。 4細(xì)胞干重的測(cè)定 細(xì)胞懸浮周期為25天。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)減壓過濾后測(cè)其鮮重。然后收集培養(yǎng)物置于60烘箱中烘干至恒重稱其干重。換算成每天每升培養(yǎng)基增加的細(xì)胞干重毫克數(shù)，即mg/Ld.表示細(xì)胞的生長(zhǎng)速度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取其平均值計(jì)算結(jié)果。 三、結(jié)果與討論 1激素組合對(duì)長(zhǎng)春花細(xì)胞懸浮培養(yǎng)生長(zhǎng)的效應(yīng) （1）2，4-D和6-BA組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表42，4-D和NAA組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 2，4-D（0.5）+6-BAx（mg/L） 0.05 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 5.0 干重增加（mg/L） 2352 5008 8200 10109

6、6095 5832 4000 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 95 201 328 405 244 234 160 由表4可以看出，2，4-D和6-BA組合使用比單獨(dú)一種更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)組合中6-BA在0.05-0.5范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度隨著濃度的增加而增加。在0.5mg/L2，4-D+0.5mg/L6-BA時(shí)，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度最快。而在6-BA在0.5-2.0mg/L時(shí)，隨著6-BA的增加，其生長(zhǎng)速度不斷地下降。 （2）2，4-D、NAA和6-BA組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表52，4-D、NAA和6-BA組合對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 2，4-D（0.5）+NAA（0.5）+6-BAx（mg/L） 0

7、.05 0.1 0.2 0.5 1.0 2.0 5.0 干重增加（mg/L） 2503 4313 6532 9205 9826 10294 8653 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 101 173 262 369 394 412 347 由表5可以看出：2，4-D、NAA和6-BA三種激素組合時(shí)，更有利于細(xì)胞培養(yǎng)的生長(zhǎng)，且在研究范圍內(nèi)較單因子有著更明顯的效果。在研究范圍內(nèi)的最佳濃度為0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA。 2其他理化因子對(duì)長(zhǎng)春花懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) （1）不同種類培養(yǎng)基對(duì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 在長(zhǎng)春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，分別采取了1/4MS、1/2MS

8、、MS、B5、White、N6六種不同的培養(yǎng)基6，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 表6不同種類培養(yǎng)基對(duì)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 培養(yǎng)基種類 1/4MS 1/2MS MS B5 White N6 干重增加（mg/L） 9776 12526 10294 11328 8310 死亡 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 392 501 412 454 333 由表6可以看出1/2MS、MS和B5培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)比較適合。而在N6培養(yǎng)基中細(xì)胞全部死亡。在不同培養(yǎng)基中的細(xì)胞生長(zhǎng)的速度情況不同是由于作為氮源的狀態(tài)不同，含量不同所造成的。 （2）不同蔗糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表7不同蔗糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 不同蔗糖濃度（g/L） 0 1

9、0 20 30 40 50 干重增加（mg/L） 死亡 2587 5278 10294 9775 7829 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 104 212 412 391 314 由表7可以看出，在MS培養(yǎng)基中，隨著蔗糖濃度的升高，生長(zhǎng)速度逐漸增大，說明在低濃度時(shí)，糖是細(xì)胞生長(zhǎng)的限制性基質(zhì)7。甘煥遠(yuǎn)等8在總結(jié)前人和自己的工作的基礎(chǔ)上提出了培養(yǎng)基中蔗糖常常是使培養(yǎng)物生長(zhǎng)達(dá)到最高的碳源。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)隨著糖濃度的增加會(huì)導(dǎo)致干重的增加，而細(xì)胞數(shù)量并不顯著增加9。實(shí)驗(yàn)也證明了蔗糖的濃度為30g/L時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)最快。低于或高于此濃度，其細(xì)胞生長(zhǎng)速度都將下降。 （3）不同葡萄糖濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表8不同葡萄糖濃度

10、對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 不同葡萄糖濃度（g/L） 0 10 20 30 40 50 干重增加（mg/L） 死亡 2150 4415 6040 7281 8801 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 87 177 242 292 353 由表8和上面兩個(gè)示意圖可以看出，在MS培養(yǎng)基中，在實(shí)驗(yàn)所研究的范圍內(nèi)，隨著葡萄糖濃度的升高，細(xì)胞生長(zhǎng)速率隨之增加。而且較之于蔗糖相比，增長(zhǎng)更明顯。此外還發(fā)現(xiàn)葡萄糖下的愈傷組織比蔗糖下的要疏松、均勻而且細(xì)小顆粒多。 （4）不同PH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 表9不同PH值對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的效應(yīng) 不同PH值 3.8 4.2 4.6 5.0 5.4 5.8 6.2 6.6 干重增加（mg/L） 47

11、34 5948 8597 12808 16741 10294 7224 4636 生長(zhǎng)速度（mg/Ld） 190 238 344 513 550 412 289 186 由表9和上面兩個(gè)示意圖可以看出：PH值對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)影響十分明顯。在研究范圍內(nèi)PH值在5.0-5.4時(shí)最適于長(zhǎng)春花細(xì)胞的生長(zhǎng)。PH值過大或過小都對(duì)愈傷組織的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中培養(yǎng)基的PH值在小范圍內(nèi)呈先降低后升高的變化趨勢(shì)10，這種變化趨勢(shì)主要是由于NO3-和NH4+之間供應(yīng)和吸收的不平衡11。在研究范圍內(nèi)的最適PH值為5.4。 四、結(jié)論 從以上的實(shí)驗(yàn)部分可以看出：不同的理化因子對(duì)長(zhǎng)春花培養(yǎng)細(xì)胞有不同的影響。其

12、中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)是培養(yǎng)基中的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物細(xì)胞培養(yǎng)起著重要而明顯的調(diào)節(jié)作用，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也得到了驗(yàn)證。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類以及濃度對(duì)不同的植物有著不同的效果。在長(zhǎng)春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中，組合因子比單因子更有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)，以0.5mg/LNAA+0.5mg/L2,4-D+2.0mg/L6-BA效果最佳，細(xì)胞生長(zhǎng)速度最快。從結(jié)果可以看出不是植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度越高、種類越多效果就越明顯。對(duì)不同的植物應(yīng)選擇相應(yīng)的種類和適宜的濃度。另外，不同的培養(yǎng)基在長(zhǎng)春花細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)中也有不同的效果。這主要是由于培養(yǎng)基的組分不同。其中1/2MS、MS和B5這三種培養(yǎng)基較有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。這可能是由于這三種

13、培養(yǎng)基中的氮元素相對(duì)于其他的培養(yǎng)要少一些的原因，而更有利于長(zhǎng)春花細(xì)胞的生長(zhǎng)。蔗糖和葡萄糖是培養(yǎng)基中碳素和能量物質(zhì)的來源。同時(shí)對(duì)保持培養(yǎng)基的滲透壓也有重要的作用。但在培養(yǎng)基中糖的含量不宜過高，一般在2-4%為宜。PH值是細(xì)胞培養(yǎng)的重要的外界環(huán)境，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)起著重要的作用，不宜過高也不宜過低，本實(shí)驗(yàn)研究的長(zhǎng)春花的最適PH值為5.0-5.4。 參考文獻(xiàn) 1江蘇新醫(yī)學(xué)院中藥大詞典M上海.上?？茖W(xué)技術(shù)出版社1997 2季宇彬中藥有效成分藥理與應(yīng)用M哈爾濱.黑龍江科學(xué)技術(shù)出版社 3W巴爾茨E賴因哈德MH芩克植物組織培養(yǎng)及其在生物技術(shù)上的應(yīng)用M北京：科學(xué)出版社，1983，110 4宋思揚(yáng)，樓士林生物技術(shù)概論M北京：科學(xué)出版社，1996，6180 5陳因良，陳志宏細(xì)胞培養(yǎng)工程M上海：華東化工學(xué)院出版社，1992，251