實(shí)驗(yàn)五(一)培養(yǎng)基的制備與滅菌概述

1、（一）培養(yǎng)基的制備與滅菌（一）培養(yǎng)基的制備與滅菌實(shí)驗(yàn)五、土壤中微生物的分離純化實(shí)驗(yàn)五、土壤中微生物的分離純化與活菌計(jì)數(shù)與活菌計(jì)數(shù)一、培養(yǎng)基的制備一、培養(yǎng)基的制備目的要求目的要求明確培養(yǎng)基的配制原理明確培養(yǎng)基的配制原理通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制通過對基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制,掌握配制培養(yǎng)掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟基的一般方法和步驟按培養(yǎng)基的用途分按培養(yǎng)基的用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分固體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基半固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基基本原理基本原理按成分不同分按成分不同分天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基半

2、合成培養(yǎng)基半合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基的配方培養(yǎng)基的配方牛肉膏蛋白牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)胨瓊脂培養(yǎng)基（一種天基（一種天然培養(yǎng)基然培養(yǎng)基,用用于分離和培于分離和培養(yǎng)細(xì)菌）養(yǎng)細(xì)菌） 配方配方:牛肉膏牛肉膏 3g蛋白胨蛋白胨 10g氯化鈉氯化鈉 5g瓊脂瓊脂 20g水水 1000mlpH 7-7.2滅菌滅菌 121 20min 高氏高氏號培號培養(yǎng)基（一種合養(yǎng)基（一種合成培養(yǎng)基成培養(yǎng)基,可可用于培養(yǎng)放線用于培養(yǎng)放線菌）菌） 配方配方:可溶性淀粉可溶性淀粉 20gKNO3 1gNaCl 0.5gK2HPO4 0.5gMgSO4 0.5gFeSO4 0.01g瓊脂瓊脂 20g水水 1000mlpH 7.27.4滅菌滅

3、菌 121 20min 馬丁氏培養(yǎng)馬丁氏培養(yǎng)基（一種合成基（一種合成培養(yǎng)基培養(yǎng)基,可用可用于分離培養(yǎng)真于分離培養(yǎng)真菌）菌） 配方配方:蛋白胨蛋白胨 g葡萄糖葡萄糖 10gK2HPO4 gMgSO4 7H2O 0.5g瓊脂瓊脂 20g%孟加拉紅水溶液孟加拉紅水溶液 3.3ml水水 1000mlpH 自然自然滅菌滅菌 121 30min 使用前使用前,添加鏈霉素添加鏈霉素 固體淀粉培固體淀粉培養(yǎng)基（一種鑒養(yǎng)基（一種鑒別培養(yǎng)基別培養(yǎng)基,用用于大分子物質(zhì)于大分子物質(zhì)水解的生理生水解的生理生化鑒定）化鑒定）配方配方: 蛋白胨蛋白胨 10g NaCl 5g 牛肉膏牛肉膏 5g 可溶性淀粉可溶性淀粉 2g

4、蒸餾水蒸餾水 1000ml 瓊脂瓊脂 20g 滅菌滅菌 121 20min葡萄糖蛋白胨葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基（一水培養(yǎng)基（一種鑒別培養(yǎng)基種鑒別培養(yǎng)基,用于腸道菌的用于腸道菌的生理生化鑒定）生理生化鑒定） 配方配方: 蛋白胨蛋白胨 5g 葡萄糖葡萄糖 5g K2HPO4 2g 蒸餾水蒸餾水 1000ml pH 7.07.2 滅菌滅菌 112 30min 器材器材溶液或試劑溶液或試劑 4mol/L NaOH,1mol/L HCl, ,各類培養(yǎng)基的配方藥品。各類培養(yǎng)基的配方藥品。儀器或其他用具儀器或其他用具 試管試管, ,三角瓶三角瓶, ,搪瓷杯搪瓷杯, ,量筒量筒, ,天平天平, ,藥匙藥匙, ,電

5、磁爐電磁爐, ,高壓蒸氣高壓蒸氣滅菌鍋滅菌鍋, ,pHpH試紙?jiān)嚰?pH5.5(pH5.59.0)9.0), ,硅膠塞硅膠塞, ,棉花棉花, ,報(bào)紙報(bào)紙, ,記號記號筆等。筆等。 操作步驟（一）操作步驟（一）1 1 計(jì)算 :根據(jù)配方按照用量計(jì)算。2. 2. 稱量:3 3溶解:如有瓊脂,要不斷攪拌避免糊底。4 4、調(diào)節(jié)pH:用1mol/L NaOH或1mol/L HCl調(diào)節(jié),以pH試紙或pH計(jì)測定。5 5過濾:趁熱用四層紗布過濾。（本次實(shí)驗(yàn)省略） 操作步驟（二）操作步驟（二）6.分裝 試管:固體不超過試管高度的 1/5;液體、半固體不超過試管高度的1/4或1/3 。三角燒瓶:總體積的一半為限。管

6、口或瓶口不得沾有培養(yǎng)基操作步驟（三）操作步驟（三）7.加塞1.正確正確;2.管內(nèi)部分太短管內(nèi)部分太短,外部太松外部太松;3.外部過小外部過小操作步驟（三）操作步驟（三）8.包扎:注明培養(yǎng)基的名稱。9.滅菌 :按不同培養(yǎng)基所需的溫度、時間滅菌。10.擱置斜面 (1/3l/2,不能超過不能超過1/2)。11.無菌檢查實(shí)驗(yàn)無菌器皿的準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)無菌器皿的準(zhǔn)備無菌水無菌水: :在試管或三角瓶內(nèi)量取實(shí)驗(yàn)所需的自來水在試管或三角瓶內(nèi)量取實(shí)驗(yàn)所需的自來水, , 經(jīng)經(jīng)121 121 20min20min滅菌。滅菌。無菌無菌移液吸管移液吸管、培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿: :報(bào)紙包扎后報(bào)紙包扎后, ,經(jīng)經(jīng)121 20min121

7、20min滅菌滅菌 了解幾種滅菌方法了解幾種滅菌方法,掌握干熱滅菌法和加掌握干熱滅菌法和加壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。壓蒸汽滅菌法的原理及其使用方法。 目的要求目的要求二、消毒與滅菌 滅菌是指殺死一切微生物的營養(yǎng)體滅菌是指殺死一切微生物的營養(yǎng)體,芽孢芽孢和孢子。消毒則指消滅病原菌和有害微生物和孢子。消毒則指消滅病原菌和有害微生物的營養(yǎng)體的營養(yǎng)體,因而只是部分滅菌。因而只是部分滅菌。消毒與滅菌的方法很多消毒與滅菌的方法很多,一般可分為加熱、一般可分為加熱、過濾、照射和使用化學(xué)藥品等方法。過濾、照射和使用化學(xué)藥品等方法。 基本原理基本原理干熱滅菌干熱滅菌火焰灼燒法火焰灼燒法干熱滅菌法干熱滅菌法

8、（烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法）（烘箱內(nèi)熱空氣滅菌法）濕熱滅菌法濕熱滅菌法加壓蒸汽滅菌法加壓蒸汽滅菌法紫外線滅菌法紫外線滅菌法微孔濾膜過濾除菌微孔濾膜過濾除菌火焰灼燒法火焰灼燒法直接在火焰上灼燒滅菌直接在火焰上灼燒滅菌主要用于實(shí)驗(yàn)室接種針主要用于實(shí)驗(yàn)室接種針( (環(huán)環(huán)) )、試管口、三角瓶口、試管口、三角瓶口和金屬小工具等的滅菌。和金屬小工具等的滅菌。干熱滅菌法干熱滅菌法設(shè)備設(shè)備: :電熱烘箱電熱烘箱適用于適用于耐高溫器皿耐高溫器皿, ,160-170160-170, ,維持維持2 2小時小時注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1. 1.溫度不可超過溫度不可超過180180, ,以防玻璃器皿上的棉塞及包裝紙烤以防玻璃

9、器皿上的棉塞及包裝紙烤焦著火。焦著火。2.2.滅菌時物品不宜堆放得太緊滅菌時物品不宜堆放得太緊, ,以免妨礙空氣流通。以免妨礙空氣流通。3.3.滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板滅菌物品不要接觸電烘箱內(nèi)壁的鐵板, ,以防包裝紙烤焦起以防包裝紙烤焦起火?；?。4.4.電烘箱內(nèi)溫度電烘箱內(nèi)溫度7070時時, ,方可打開箱門方可打開箱門, ,以免驟然降溫導(dǎo)以免驟然降溫導(dǎo)致玻璃器皿炸裂。致玻璃器皿炸裂。2.濕熱滅菌(一）高壓蒸汽滅菌法 :是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)是將物品放在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)0.1MPa,1210.1MPa,121保持保持151530min30min進(jìn)行滅菌進(jìn)行滅菌, ,從而導(dǎo)致菌從而導(dǎo)

10、致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。時間的長短體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。時間的長短可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化可根據(jù)滅菌物品種類和數(shù)量的不同而有所變化, ,以達(dá)以達(dá)到徹底滅菌為準(zhǔn)。此法適用于培養(yǎng)基、工作服、橡到徹底滅菌為準(zhǔn)。此法適用于培養(yǎng)基、工作服、橡皮物品等的滅菌皮物品等的滅菌, ,也可用于玻璃器皿的滅菌。也可用于玻璃器皿的滅菌。在同一溫度下在同一溫度下,濕熱的殺菌效力比干熱大。濕熱的殺菌效力比干熱大。原因一原因一:濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分,蛋白質(zhì)較易凝固蛋白質(zhì)較易凝固,因蛋白質(zhì)含水量增加因蛋白質(zhì)含水量增加,所需凝固溫度降低。所需凝固溫度降低。 卵白

11、蛋白含水量卵白蛋白含水量/%/%3030分鐘內(nèi)凝固所需溫度分鐘內(nèi)凝固所需溫度/505625748018809061450160170蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需的溫度高為什么干熱滅菌比濕熱滅菌所需的溫度高,時間長時間長?原因二原因二:濕熱的穿透力比干熱大。濕熱的穿透力比干熱大。原因三原因三:濕熱的蒸氣有潛熱存在。濕熱的蒸氣有潛熱存在。在同一壓力下在同一壓力下,含有空氣的蒸汽所達(dá)到的溫度低含有空氣的蒸汽所達(dá)到的溫度低于飽和蒸汽的溫度于飽和蒸汽的溫度,所以所以排氣排氣是否完全很重要。是否完全很重要。間歇滅菌法: 應(yīng)用于不易于高壓蒸汽滅

12、菌的培養(yǎng)應(yīng)用于不易于高壓蒸汽滅菌的培養(yǎng)基如明膠培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等?；缑髂z培養(yǎng)基、牛乳培養(yǎng)基、含糖培養(yǎng)基等。此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌此法是用阿諾氏流動蒸汽滅菌器進(jìn)行滅菌, ,每天每天加熱加熱10030min10030min、連續(xù)三天、連續(xù)三天, ,可徹底滅菌?？蓮氐诇缇Ｖ蠓邢痉?注射器和解剖器械等可用煮沸消毒注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般煮沸消毒時間為法。一般煮沸消毒時間為101015min15min。超高溫殺菌: 此法指在溫度和時間標(biāo)準(zhǔn)分別為此法指在溫度和時間標(biāo)準(zhǔn)分別為135135150150和和2 28s8s的條件下對牛乳或其他液態(tài)的條件下對牛乳或其他

13、液態(tài)食品進(jìn)行處理的一種工藝。食品進(jìn)行處理的一種工藝。2.濕熱滅菌(二）l高壓蒸汽滅菌法操作步驟（三）手提式高壓蒸汽滅菌鍋手提式高壓蒸汽滅菌鍋全自動數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌鍋全自動數(shù)顯立式高壓蒸汽滅菌鍋操作步驟（三）操作步驟（三）（以手提式高壓蒸汽滅菌鍋為例以手提式高壓蒸汽滅菌鍋為例） 1. 1.裝鍋先向外層鍋內(nèi)加入適量的水先向外層鍋內(nèi)加入適量的水, ,放入內(nèi)鍋放入內(nèi)鍋, ,裝入待滅菌裝入待滅菌物品。物品。2.2.加蓋 將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌鍋的排氣槽內(nèi)。再將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌鍋的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓, ,勿使漏氣。勿

14、使漏氣。3.3.滅菌 加熱加熱, ,并同時打開排氣閥并同時打開排氣閥, ,待冷空氣完全排盡后待冷空氣完全排盡后, ,關(guān)上關(guān)上排氣閥排氣閥, ,升溫至升溫至l21l21時維持時維持1520min1520min。 4.4.降溫取物 滅菌結(jié)束后滅菌結(jié)束后, ,切斷電源切斷電源, ,當(dāng)壓力表的壓力降至當(dāng)壓力表的壓力降至0 0時時, ,打開排氣閥打開排氣閥, ,開蓋取物。開蓋取物。加壓蒸汽滅菌法加壓蒸汽滅菌法 0.1MPa,1210.1MPa,121, ,20min20min滅菌滅菌 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng): :1. 1.切勿忘記加水切勿忘記加水, ,加水量不可過少加水量不可過少, ,以防滅菌鍋燒干而引起以防

15、滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。炸裂事故。2.2.鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后鍋內(nèi)冷空氣必須完全排盡后, ,才能關(guān)上排氣閥才能關(guān)上排氣閥, ,維持所需維持所需壓力。壓力。3.3.壓力一定要降到壓力一定要降到“0 0”時時, ,才能打開排氣閥才能打開排氣閥, ,開蓋取物。開蓋取物。4.4.滅菌全程必須有人看守。滅菌全程必須有人看守。紫外線滅菌法紫外線滅菌法適用于無菌室、接種箱、手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面適用于無菌室、接種箱、手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。的滅菌。紫外線燈距照射物以不超過紫外線燈距照射物以不超過1.2m1.2m為宜。為宜。若紫外線照射與若紫外線照射與3%5%3%5%的石炭酸溶液或的石炭酸溶液

16、或2%3%2%3%的的來蘇爾等化學(xué)消毒劑結(jié)合使用來蘇爾等化學(xué)消毒劑結(jié)合使用, ,可加強(qiáng)滅菌效果。可加強(qiáng)滅菌效果。注意事項(xiàng)注意事項(xiàng):紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用紫外線對眼結(jié)膜及視神經(jīng)有損傷作用,對皮膚有刺激作用對皮膚有刺激作用,故不能直視紫外線燈光故不能直視紫外線燈光,更不能在紫外線燈光下工作。更不能在紫外線燈光下工作。過濾除菌法過濾除菌法適用于適用于不耐熱的液體物質(zhì)不耐熱的液體物質(zhì)（如維生素、血清、酶（如維生素、血清、酶等熱敏性物質(zhì)）。等熱敏性物質(zhì)）。濾膜孔徑濾膜孔徑: :0.22m0.22m缺點(diǎn)缺點(diǎn): :無法去除培養(yǎng)液中的病毒和噬菌體。無法去除培養(yǎng)液中的病毒和噬菌體。思考題思考題培養(yǎng)基配好后培養(yǎng)基配好后, ,為什么必須立即滅菌為什么必須立即滅菌? ?如何檢查滅菌后如何檢查滅菌后的培養(yǎng)基是無菌的的培養(yǎng)基是無菌的? ?P2P2（1 1）在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意哪些問題在配制培養(yǎng)基的操作過程中應(yīng)注意哪些問題? ?為什為什么么? ? P2P2（）（）在干熱滅菌操作過程中應(yīng)注意哪些問題在干熱滅菌