姬松茸發(fā)酵條件優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)分析

1、姬松茸發(fā)酵條件優(yōu)化及動(dòng)力學(xué)分析趙迎慶，曹新志*，熊俐，李琳琳（四川理工學(xué)院生物工程學(xué)院，四川自貢 643000）摘要：在搖瓶條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行姬松茸3L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，確定了最適培養(yǎng)條件：溫度24-25 、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH 6.4、接種量6 %，在此條件下菌體干重1.420 g/100mL，胞外多糖含量6.955 g/L。在發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化的上對(duì)姬松茸分批發(fā)酵發(fā)酵動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究，描述姬松茸菌體生長(zhǎng)、胞外多糖、底物消耗的代謝規(guī)律。關(guān)鍵詞：姬松茸；液體發(fā)酵；培養(yǎng)條件優(yōu)化；動(dòng)力學(xué)分析Optimization of Submerge Fermentation

2、Conditions of Agaricus Blazei Muril and Dynamics Analysis Zhao Yingqing，Cao Xinzhi*, Xiong Li, Li Linlin(Deptment of Bioengineering, Sichuan University of Science and Engineering, Zigong 643000, Sichuan)Abstract: On the basis of above results, Agaricus Blazei Murill was further studied in 3L stirred

3、 tank fermentation and the suitable conditions were:temperature 24-25,stirring rate 152 r/min, ventilation quantity 0.58 m3/h, pH6.4, inoculation amount 6%. At this basis, dry weight of mycelium was 1.420 g/100mL, exopolysaccharides 6.955 g/L.The kinetic model of cell growth, exopolysaccharides and

4、substrate consumption in batch fermentation process.Key words: Agaricus blazei Murill; submerged cultivation; optimization of fermentation condition; dynamic analysis姬松茸（Agaricus blazei Murill）又稱(chēng)“巴西蘑菇”、“小松菇”、“柏氏蘑菇”，在分類(lèi)學(xué)上隸屬于真菌門(mén)（Aumycota）、擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes），傘菌目(Agaricales)，蘑菇科(A

5、garicaceae)，蘑菇屬(Agaricus)1，是1種珍稀的食藥兼用真菌2。在巴西圣保羅市周邊的草原、秘魯、美國(guó)加利福尼亞州、福羅里達(dá)州都有自然生長(zhǎng)的姬松茸。1945年首次被美國(guó)真菌學(xué)家A.Murrill發(fā)現(xiàn)。1967年比利時(shí)的海涅曼博士鑒定其為新種與雙孢菇同屬3。隨后，姬松茸傳到日本。1992年我國(guó)福建省從日本引進(jìn)了姬松茸并進(jìn)行栽培。此后才由福建傳到其他各個(gè)省份4。由于栽培姬松茸的溫度、濕度等條件比較苛刻，所以我國(guó)北方很少栽培姬松茸。在以往對(duì)姬松茸液體發(fā)酵的研究中，大都停留在搖瓶發(fā)酵階段，但是要實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)就必須經(jīng)歷發(fā)酵罐的放大實(shí)驗(yàn)，所以從搖瓶到發(fā)酵罐的放大是發(fā)酵產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中

6、的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。但與搖瓶發(fā)酵相比發(fā)酵罐的發(fā)酵溫度、pH、罐壓、溶氧、轉(zhuǎn)速等發(fā)酵參數(shù)更容易檢測(cè)和控制，二者的區(qū)別主要體現(xiàn)在發(fā)酵罐可以對(duì)各項(xiàng)指標(biāo)實(shí)時(shí)監(jiān)控，同時(shí)兩者在供氧能力和剪切力上也有較大的差別。本章節(jié)的研究在搖瓶發(fā)酵工藝的基礎(chǔ)上進(jìn)行了3L發(fā)酵罐的發(fā)酵條件優(yōu)化，期望為進(jìn)一步工藝放大提供依據(jù)。同時(shí)本文還研究了姬松茸的菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)和基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)以及胞外多糖產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)，應(yīng)用動(dòng)力學(xué)模型可以預(yù)測(cè)菌絲體的生長(zhǎng)狀態(tài)，可以更為方便的通過(guò)動(dòng)力學(xué)模型實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化控制，同時(shí)這也為姬松茸液體發(fā)酵進(jìn)一步放大培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗(yàn)材料姬松茸菌種(Agaricus Blazei Murill)，

7、由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)菌種保藏中心提供。1.2 培養(yǎng)基液體母種發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，麩皮10 g，蔗糖20 g，KH2PO4 2 g，MgSO4.5H2O 0.2 g，蒸餾水1000 mL，pH自然。液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖57.5 g/L，工業(yè)玉米漿2.05 g/L，KH2PO4 2 g/L，MgSO4.5H2O 0.2 g/L，VB1 0.01 g/L，蒸餾水1000 mL，pH自然。麥粒培養(yǎng)基：煮熟的麥粒200 g，蔗糖10 g，KH2PO4 2 g，MgSO4.5H2O 0.2 g，碳酸鈣10 g，pH自然。1.3 殘?zhí)堑臏y(cè)定DNS法測(cè)定還原糖5，Roe比色法測(cè)定蔗糖6 。1.4 生物量的

8、測(cè)定參照周選圍生物量測(cè)定方法7 1.5 總糖的測(cè)定苯酚-硫酸法8 1.6溶氧(DO)消耗的測(cè)定發(fā)酵液溶氧采用溶氧電極進(jìn)行測(cè)定。培養(yǎng)基滅菌結(jié)束循環(huán)水浴降溫至發(fā)酵溫度，向培養(yǎng)基通風(fēng)攪拌至溶解氧達(dá)到飽和，此時(shí)溶氧電極讀數(shù)定義為100.0。1.7發(fā)酵液pH值的測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中pH的變化采用pH電極進(jìn)行測(cè)定測(cè)定。1.8發(fā)酵設(shè)備及培養(yǎng)基的滅菌實(shí)驗(yàn)選用食用油作為消泡劑，滅菌前往發(fā)酵罐內(nèi)滴加幾滴食用油，然后用牛皮紙包住空氣過(guò)濾器，尾氣出口由里到外依次用棉花、紗布、牛皮紙包裹，滅菌前用夾子夾住與罐體相連的硅膠管，然后在0.1MPa蒸汽滅菌20 min。 2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)2.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)Pla

9、ckett-Burman設(shè)計(jì)法是一種兩水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，該法實(shí)驗(yàn)次數(shù)少同時(shí)可以將眾多的考察因素的影響效應(yīng)作主次排序，因此該方法被廣泛的應(yīng)用到生物工藝過(guò)程優(yōu)化中9。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)以及食用菌發(fā)酵罐發(fā)酵的規(guī)律，實(shí)驗(yàn)選取的因素及編碼水平見(jiàn)表1，以菌體干重、胞外多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，利用design-expert 8.0軟件進(jìn)行Plackett- Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)。表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼表(Table 1 The factor and coding of the Plackett-Burman)因素水平因素水平A溫度（）1（28）-1（22）D接種量（%）1（8）-1

10、（4）B轉(zhuǎn)速（r/min）1（180）-1（120）E通氣（m3/h）1（0.6）-1（0.2）C pH1（7）-1（6）2.2 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)響應(yīng)面分析法(Response Surface Analysis)是一種從多因素系統(tǒng)中尋求最佳條件的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法10，最常用的是二次回歸旋轉(zhuǎn)中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Central Composite Design)和中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(Box-Behnken) 11。利用design-expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合得二次回歸方程，通過(guò)響應(yīng)面分析，分析模型顯著性、各因素的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，進(jìn)而尋求最優(yōu)影響因子的水平，最終得到最適液體發(fā)酵條件。對(duì)

11、于二因子數(shù)學(xué)模型可表述為： Y=a0+a1X1+a2X2+a12X1X2+a11X12+a22X22 （1-1）上式中，Y為響應(yīng)值即姬松茸胞外多糖含量，a0為截距，a1、a2、a11、a22均為回歸模型的系數(shù)。2.3 動(dòng)力學(xué)模型的建立在分批發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵模型往往是根據(jù)微生物生長(zhǎng)、菌體代謝以底物消耗之間關(guān)聯(lián)建立的，然后通過(guò)實(shí)踐不斷的去驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，這樣才能更好的去控制發(fā)酵過(guò)程。在發(fā)酵過(guò)程中，根據(jù)產(chǎn)物積累與底物利用之間關(guān)系，將發(fā)酵分為三類(lèi)12：相關(guān)模型，即產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)相關(guān)。部分相關(guān)模型，即反應(yīng)產(chǎn)物與底物消耗有著間接的關(guān)系。非相關(guān)模型，即產(chǎn)物的生成與具體生長(zhǎng)沒(méi)有直接的關(guān)系。在本章節(jié)的研究

12、中主要按菌體生長(zhǎng)、底物消耗、胞外多糖的積累三者之間的關(guān)系來(lái)對(duì)姬松茸液體發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行研究。2.4 姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型目前對(duì)微生物菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型應(yīng)用廣泛的是Monod方程13，Monod方程為典型的非結(jié)構(gòu)模型，該模型著眼于整個(gè)微生物群體的變化，不考慮個(gè)體細(xì)胞水平的變化，但相關(guān)表明研究Monod方程僅適用于細(xì)胞群體生長(zhǎng)緩慢且細(xì)胞密度較低的發(fā)酵環(huán)境14，發(fā)酵過(guò)程中不應(yīng)存在高濃度底物抑制、代謝物反饋抑制、營(yíng)養(yǎng)物不足等導(dǎo)致的菌體生長(zhǎng)緩慢現(xiàn)象。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)發(fā)酵液中蔗糖濃度小于4.5 g/L時(shí)菌體生長(zhǎng)速率明顯下降并伴有溶菌現(xiàn)象，這說(shuō)明發(fā)酵液中的限制性底物對(duì)菌體生長(zhǎng)的限制性不能忽略，因此Mon

13、od方程不能做用作姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。分批發(fā)酵生長(zhǎng)環(huán)境固定，所以在培養(yǎng)基各營(yíng)養(yǎng)成分固定情況下，從姬松茸發(fā)酵代謝分析可知，菌體生長(zhǎng)會(huì)有一個(gè)最大值點(diǎn)，根據(jù)以上假設(shè)姬松茸菌體生長(zhǎng)曲線應(yīng)為S型，這與種群生長(zhǎng)規(guī)律類(lèi)似，在研究限制空間種群增長(zhǎng)規(guī)律時(shí)應(yīng)用廣泛的則為L(zhǎng)ogistic方程。Logistic方程是典型的S型曲線15，這說(shuō)明Logistic方程可以很好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中菌絲體生長(zhǎng)規(guī)律。Logistic方程模型見(jiàn)公式（1-2）。 =dXdt=max1-XXmax (1-2)公式1-2中X：菌絲體干重，單位g/100mL；t：發(fā)酵時(shí)間，單位h；：比生長(zhǎng)速率；max代表最大細(xì)胞比生長(zhǎng)速率；Xmax

14、代表最大菌體濃度，單位g/100mL。將(1-2)式積分得： Xt=X0emaxt1-X0Xmax(1-emaxt) (1-3)公式（1-3）中X0代表初始菌體濃度，單位g/100mL。在發(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)，X值比Xmax要小很多，所以此時(shí)X0Xmax接近于0可以忽略不計(jì)，說(shuō)明菌體呈現(xiàn)指數(shù)生長(zhǎng)，但當(dāng)X值比Xmax相當(dāng)?shù)臅r(shí)候，這時(shí)說(shuō)明菌體生長(zhǎng)緩慢或者菌體停止生長(zhǎng)。在對(duì)姬松茸進(jìn)行分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Logistic方程具有很好的適應(yīng)性。2.5 姬松茸胞外多糖生成動(dòng)力學(xué)模型胞外多糖是姬松茸發(fā)酵過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的產(chǎn)物，根據(jù)搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐結(jié)果可知，胞外多糖在發(fā)酵初期有少量合成，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入平穩(wěn)期后胞外多糖開(kāi)

15、始大量合成，因此可以將姬松茸胞外多糖合成類(lèi)型歸于部分相關(guān)型。目前對(duì)于此類(lèi)型產(chǎn)物合成的動(dòng)力學(xué)模型廣泛采用Luedeking-Piert模型16-18：dPdt=dXdt+X (0,0) (1-4)公式1-4中為生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)，為非生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)，dP/dt為胞外多糖生成速度，P為胞外多糖濃度g/L。當(dāng)t=0，P=P0時(shí)，將公式1-2代如公式4-4得：dPdt=max1-XXmax+X (0,0) (1-5)對(duì)公式1-5積分得：Pt=P0+Xt-X0+Xmaxmaxln1-X0Xmax(1-emaxt) (1-6)2.6 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型根據(jù)發(fā)酵的搖瓶實(shí)驗(yàn)和發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果，姬松茸對(duì)蔗糖的利用呈現(xiàn)倒S

16、形。培養(yǎng)中蔗糖主要有三個(gè)方面的用途：姬松茸菌體生長(zhǎng)消耗，維持姬松茸正常各項(xiàng)生命活動(dòng)消耗，合成胞外多糖消耗。因此姬松茸底物消耗動(dòng)力學(xué)模型可以表示為：-dSdt=1YXsdXdt+1YPsdPdt+mX (1-7)公式（1-7）中YXs代表姬松茸菌體得率系數(shù)，單位g/g；YPs代表姬松茸胞外多糖得率系數(shù)，單位g/g；S為蔗糖濃度，單位g/L；m為姬松茸菌體維持系數(shù)。將公式（1-2）與公式（1-4）帶入公式（1-7）中得：-dSdt=1YXsmax1-XXmax+1YPsmax1-XXmax+X+mX (1-8)對(duì)公式（1-8）積分得：St=S0-1YXs+YPsXt-X0-YPs+mXmaxmax

17、ln1-X0Xmax(1-emaxt) (1-9)公式（1-9）中S0代表當(dāng)t=0時(shí)蔗糖初始濃度。3 結(jié)果與討論3.1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值(Table 2 Plackett-Burman experimental design and results)試驗(yàn)號(hào)A溫度（）B轉(zhuǎn)速（r/min）C pHD接種量（%）E通氣（m3/h）菌體干重g/(100mL)胞外多糖含量g/L6-1-1-11-10.7954.5919111-1-10.8075.02071-1-1-110.8915.61510-1111-10.7154.039811-

18、1-1-10.8165.1452-111-110.7494.314111-1110.8495.23712-1-1-1-1-10.8034.496111-11110.8615.4644-11-1110.7764.5085-1-11-110.8124.50431-111-10.8375.3013.2 因素主次的確定3.2.1以姬松茸菌體干重為響應(yīng)值影響因素主次的確定利用design-expert 8.0軟件以姬松茸菌體干重為響應(yīng)值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，分析結(jié)果如下表3。由表3中的“Prob F值”可以對(duì)實(shí)驗(yàn)影響因素主次做出排序，因素主次順序依次是AB E CD，即：溫度轉(zhuǎn)速通氣pH 接種量。由表4-

19、3中的顯著性檢驗(yàn)（P0.01），可以看出溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH，4個(gè)因素對(duì)姬松茸液體發(fā)酵有著非常顯著的影響。表3 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)(Table 3 Partial regression coefficients and their significance test)模型項(xiàng)回歸系數(shù)自由度均方F值Prob F顯著性模型55.04610-375.34 0.0001*A0.03410.014210.19 0.0001*B-0.02416.86410-3102.49 0.0001*C-0.01211.68710-427.620.0019*D-3.7510-312.26910-32.520.163

20、5E0.01416.69710-533.880.0011*常數(shù)項(xiàng)0.081注：”*”表示影響顯著（PB E CD，即：溫度轉(zhuǎn)速通氣pH 接種量。由表1-4中的顯著性檢驗(yàn)（P0.01），可以看出溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH，4個(gè)因素對(duì)姬松茸液體發(fā)酵有著非常顯著的影響。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論是以菌體干重還是以胞外多糖為響應(yīng)值，溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH，4個(gè)因素都對(duì)實(shí)驗(yàn)有著非常顯著的影響。所以在接下來(lái)的研究試驗(yàn)中對(duì)溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH，4個(gè)影響因素進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。表4 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)(Table 4 Partial regression coefficients and their significa

21、nce test)模型項(xiàng)回歸系數(shù)自由度均方F值Prob F顯著性模型50.56121.03 0.0001*A0.4412.37215.77 0.0001*B-0.1410.2452.960.0003*C-0.07910.07516.390.0067*D3.83310-311.76310-40.0380.8511E0.01410.09220.020.0042*常數(shù)項(xiàng)4.851注：”*”表示影響顯著（P0.01）2.3 中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH為自變量，分別用A、B、C、D表示，并用-1、0、1代表編碼水

22、平，以胞外多糖含量Y作為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表5，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表6。表5 實(shí)驗(yàn)因素水平(Table 5 The factor of the Box-Behnken)因素水平A溫度（）B轉(zhuǎn)速（r/min）C通氣（m3/h）D pH-1221200.26025-1500.46.51281800.67表6 中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(Table 6 Design and results of Box-Behnken design)試驗(yàn)號(hào)A溫度（）B轉(zhuǎn)速（r/min）C通氣（m3/h）D pHY1菌體干重（g/100mL）Y2胞外多糖（g/L）9-100-11.1716.257

23、1210010.9655.6386001-11.3476.6132900001.3746.80022010.-11.1146.673150-1101.0986.758800111.2556.7252500001.3506.8601-1-1000.8805.85019-10101.1476.2173-11001.0036.0732700001.3406.738230-1010.8736.5972600001.3796.770500-1-11.1076.5361810-101.0075.5132800001.2956.8651401-101.2416.677130-1-101.0836.44670

24、0-111.1746.55321-1000.8075.3992010101.0915.763411000.8255.43011-10011.0236.13417-10-101.1356.01510100-10.8535.5361601101.1446.7789-100-11.1716.2571210010.9655.6382.4 擬合模型的建立及顯著性檢驗(yàn)利用design-expert 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表7。表7 回歸模型方差分析(Table 7 Analysis of variance of regression model)來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性模型6.47

25、140.4657.50 0.0001*A0.8910.89110.71 0.0001*B0.03010.0303.720.0442*C0.1010.1012.870.0030*D2.08310-412.08310-40.0260.8744AB9.21610-319.21610-31.150.0230*AC5.76010-415.76010-40.0720.7928AD0.01310.0131.580.0300*BC0.01110.0111.390.2588BD1.96010-411.96010-40.0240.8781CD2.25610-312.25610-30.280.6045A25.271

26、5.27155.64 0.0001*B20.1310.1315.570.0015*C20.02010.0202.440.1404D20.02810.0283.540.0407*殘差0.11148.03410-3模型失擬0.10100.0103.240.1341不顯著純誤差0.01243.08810-3總差6.58280.46決定系數(shù)R20.9829校正系數(shù)R2Adj0.9658預(yù)測(cè)R2Pred0.9094信噪比20.682注：“*”表示影響顯著（0.01P0.05），“*”表示影響極顯著（P0.01）數(shù)學(xué)模型經(jīng)二次回歸擬合，得回歸方程預(yù)測(cè)模型：Y=-26.4268+1.1408A+0.0409

27、B+2.956C+3.0946D-2.9167AB+0.03AC+0.0433AD-4.6667BC+5.4167BD-0.3975CD-0.0283A2-2.1694B2-0.3533C2-0.374D2 (1-10)擬合方程的二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值，拋物線開(kāi)口朝下，這說(shuō)明擬合得到的方程有極大值點(diǎn)。擬合方程方差分析見(jiàn)表7，模型的決定系數(shù)R2值為98.29 %，說(shuō)明回歸方程可以很好的反應(yīng)發(fā)酵條件對(duì)姬松茸菌體干重和胞外多糖的影響，可以用回歸方程來(lái)代替真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)來(lái)對(duì)姬松茸液體發(fā)酵進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。校正系數(shù)R2Adj值為96.58%，說(shuō)明模型只有3.42 %的概率不能解釋響應(yīng)面值的變化。失擬項(xiàng)P值0.134

28、1不顯著，說(shuō)明所得方程與實(shí)際擬合中的非正常誤差所占的比例小，另外模型各項(xiàng)A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、C2、D2中除D、AC、BC、BD、CD、C2不顯著外，其余項(xiàng)都顯著。說(shuō)明擬合方程對(duì)姬松茸液體發(fā)酵提供了一個(gè)很好分析預(yù)測(cè)模型。利用design-expert 8.0軟件對(duì)二次回歸模型進(jìn)行分析，得到溫度、轉(zhuǎn)速、通氣、pH，4個(gè)因素之間的立體分析圖和等高線圖。結(jié)合圖1-12及design-expert 8.0軟件綜合分析得到姬松茸液體發(fā)酵菌絲體干重和胞外多糖最大值點(diǎn)：溫度24.6、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH 6.4，此時(shí)菌體干重達(dá)到1.4

29、72 g/100mL（預(yù)測(cè)值），胞外多糖7.0179 g/L（預(yù)測(cè)值）。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出發(fā)酵溫度24.6，考慮到發(fā)酵過(guò)程溫度的波動(dòng)性以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)規(guī)律，最終確定姬松茸液態(tài)發(fā)酵溫度范圍24-25。 圖1 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 1 Response surface and plots for alternative effects of temperature and rotational speed on dry weight of mycelium) 圖2溫度和通氣對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 2 Response surface and plots fo

30、r alternative effects of temperature and ventilation quantity on dry weight of mycelium) 圖3 溫度和pH對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 3 Response surface and plots for alternative effects of temperature and pH on dry weight of mycelium) 圖4 轉(zhuǎn)速和通氣對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 4 Response surface and plots for alternative effe

31、cts of rotational speed and ventilation quantity on dry weight of mycelium 圖5 轉(zhuǎn)速和pH對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 5 Response surface and plots for alternative effects of rotational speed and pH on dry weight of mycelium) 圖6 通氣和pH對(duì)菌體干重響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 6 Response surface and plots for alternative effects of ve

32、ntilation quantity and pH on dry weight of mycelium) 圖7 溫度和轉(zhuǎn)速對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 7 Response surface and plots for alternative effects of temperature and rotational speed on extracellular polysaccharide) 圖8 溫度和通氣對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 8 Response surface and plots for alternative effects of temperatu

33、re and ventilation quantity on extracellular polysaccharide) 圖9 溫度和pH對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 9 Response surface and plots for alternative effects of temperature and pH on extracellular polysaccharide) 圖10 轉(zhuǎn)速和通氣對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 10 Response surface and plots for alternative effects of rotational sp

34、eed and ventilation quantity on extracellular polysaccharide) 圖11 轉(zhuǎn)速和pH對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 11 Response surface and plots for alternative effects of rotational speed and pH on extracellular polysaccharide) 圖12 通氣和pH對(duì)胞外多糖響應(yīng)面圖和等高線圖(Figure 12 Response surface and plots for alternative effects of venti

35、lation quantity and pH on extracellular polysaccharide)為了證實(shí)上述優(yōu)化條件的可靠性，所以對(duì)優(yōu)化條件進(jìn)行3次以上的驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果表明當(dāng)溫度24-25、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h、pH 6.4時(shí)，菌體干重1.420 g/100mL，胞外多糖含量6.955 g/L，同理論值相比，相對(duì)誤差分別為3.66 %和0.904 %。因此實(shí)驗(yàn)得到的姬松茸3L液體發(fā)酵條件具有一定的可靠性和真實(shí)性。2.5 姬松茸3L發(fā)酵罐發(fā)酵曲線及其動(dòng)力學(xué)分析 為了了解姬松茸液體發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化后對(duì)菌體干重和胞外多糖含量的影響，在發(fā)酵過(guò)程中每隔12h進(jìn)行

36、取樣，測(cè)定姬松茸發(fā)酵過(guò)程中菌體干重、胞外多糖、殘?zhí)呛俊⑷苎醯淖兓?，并?duì)姬松茸液體發(fā)酵曲線進(jìn)行簡(jiǎn)單的分析。結(jié)果見(jiàn)圖13-16。圖13 姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線（一）(Figure 13 The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril) (一) 圖14 姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線（二）(Figure 14 The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril) (二) 圖15 姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線（三）(Figure 15 The d

37、ynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril) (三) 圖16 姬松茸分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)曲線（四）(Figure 16 The dynamics curve in batch fermentation of Agaricus Blazei Muril) (四)2.6 動(dòng)力學(xué)模型分析及參數(shù)估計(jì)2.6.1姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)公式（1-3）可以表述為lnXXmax-X-t的函數(shù)，即： lnXXmax-X=t-lnXmaxX0-1 (1-11)通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)X0=0.004 g/100mL，Xmax=1.417 g/100mL，以l

38、nXXmax-X對(duì)t作圖可得max=0.0602 h-1，將模型參數(shù)帶入公式（1-3）得姬松茸菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程：Xt=0.004e0.0602t1-0.0041.417(1-e0.0602t)擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9616（0.01P0.05），說(shuō)明模型具有良好的擬合性，可以客觀的反應(yīng)姬松茸菌體生長(zhǎng)規(guī)律。2.6.2姬松茸胞外多糖生成動(dòng)力學(xué)當(dāng)姬松茸菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期時(shí)，dXdt=0，X=Xmax，所以此時(shí)LuedekingPirct方程dPdt=X，即：=1XmaxdPdt (1-12)由于max、X0、Xmax均為已知，通過(guò)origin 8.0軟件可以計(jì)算出當(dāng)具體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)態(tài)時(shí)dP/d

39、t=0.156，帶入公式（1-12），即可得出=0.1101。令a(t)=X(t)-X0，b(t)= Xmaxmaxln1-X0Xmax(1-emaxt)，這時(shí)姬松茸胞外多糖動(dòng)力學(xué)模型可以寫(xiě)成：Pt=P0+a(t)+b(t) (1-13)當(dāng)t=0時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得P=P0=0.026，所以：Pt=0.026+a(t)+b(t) (1-14)公式（1-14）可以看做P(t)- a(t)的一次函數(shù)，對(duì)其作圖，可得直線斜率=1.118。將模型參數(shù)max、X0、Xmax、帶入方程（1-6）得姬松茸胞外多糖生成的動(dòng)力學(xué)方程： Pt=0.026+1.118Xt-0.004+0.11011.4170.06

40、02ln1-0.0041.417(1-e0.0602t) 擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9828（0.01P0.05），說(shuō)明模型具有良好的擬合性，可以客觀的反應(yīng)姬松茸胞外多糖生成規(guī)律。2.6.3姬松茸基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)令a1=1YXs+YPs，b1=YPs+m，此時(shí)公式（1-9）可以表述為： St=S0-a1Xt-X0-b1Xmaxmaxln1-X0Xmax(1-emaxt) (1-15) 按照4.5.6.2中求解、的方法即可得出a1、b1的數(shù)值，即：a1=3.82、b1=0.087。將模型參數(shù)max、X0、Xmax、a1、b1帶入方程（1-15）得姬松茸基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)方程： St=57.5-3.82

41、Xt-0.004-0.0871.4170.0602ln1-0.0041.417(1-e0.0602t) 擬合方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9873（0.01P0.05），說(shuō)明模型具有良好的擬合性，可以客觀的反應(yīng)姬松茸基質(zhì)消耗規(guī)律。3結(jié)論在本章節(jié)的研究中確定了3L發(fā)酵罐最適培養(yǎng)條件：溫度24-25、轉(zhuǎn)速152 r/min、通氣0.58 m3/h 、pH 6.4、接種量6%。經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，在此條件下菌體干重1.420 g/100mL，胞外多糖含量6.955 g/L，同理論值相比，相對(duì)誤差分別為3.66 %和0.904 %。實(shí)驗(yàn)還對(duì)姬松茸分批發(fā)酵中菌體干重、胞外多糖、殘?zhí)呛康淖兓M(jìn)行動(dòng)力學(xué)分析并建立數(shù)學(xué)模型。運(yùn)用origin 8.0軟件參數(shù)進(jìn)行估計(jì)并進(jìn)行曲線擬合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所采取的姬松茸菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型（Logistic方程）和姬松茸胞外多糖生成的動(dòng)力學(xué)模型（Luedeking-Priet方程）以及基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型能較好的對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，所得的動(dòng)力學(xué)模型可以用于解釋姬松茸在發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、胞外多糖的生成和基質(zhì)消耗的動(dòng)力學(xué)規(guī)律。參考文獻(xiàn)1 Lv WH, Cong W, Cai ZL. Improvement of nisin production in pH feed-back controlled, fed-batch cul