RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾

1、第二節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后的加工與修飾不論原核或真核生物的rRNAs都是以更為復(fù)雜的初級轉(zhuǎn)錄本形式被合成的，然后再加工成為成熟的 RNA分子。然而絕大多數(shù)原核生物轉(zhuǎn)錄和翻譯是同時進行的， mRNAh并以其為模板進行蛋白質(zhì)的合成，因此原核細胞的 生物轉(zhuǎn)錄和翻譯在時間和空間上是分天的，剛轉(zhuǎn)錄出來的隨著mRNA開始的DNA上合成，核蛋白體即附著在 mRNA并無特殊的轉(zhuǎn)錄后加工過程，相反，真核 mRN堤分子很大的前體，即核內(nèi)不均一 RNAhnRNA分子中大約只有10%勺部分轉(zhuǎn)變成成熟的 mRNA其余部分將在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中被降解掉。（一） mRNA勺加工修飾原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的 mRNA為多順反子，即幾個

2、結(jié)構(gòu)基因，利用共同的啟動子和共同終止信號經(jīng)轉(zhuǎn)錄 生成一條mRNA所以此mRNA分子編碼幾種不同的蛋白質(zhì)。例如乳糖操縱子上的Z、Y及A基因，轉(zhuǎn)錄生成的mRNA可翻譯生成三種酶，即半乳糖苷酶，透過酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。原核生物中沒有核模，所以轉(zhuǎn)錄與翻 譯是連續(xù)進行的，往往轉(zhuǎn)錄還未完成，翻譯已經(jīng)開始了，因此原核生物中轉(zhuǎn)錄生成的mRNA沒有特殊的轉(zhuǎn)錄后加工修飾過程。真核生物轉(zhuǎn)錄生成的 mRNA為單順反子，即一個 mRNA分子只為一種蛋白質(zhì)分子編碼。真核生物mRNA的加工修飾，主要包括對 5端和3端的修飾以及對中間部分進行剪接。1.在5端加帽成熟的真核生物 mRNA其結(jié)構(gòu)的5端都有一個 m7G-PPNm結(jié)構(gòu)

3、，該結(jié)構(gòu)被稱為甲基鳥苷的帽子。如 圖17-9所示。鳥苷通過5 -5 焦磷酸鍵與初級轉(zhuǎn)錄物的5端相連。當鳥苷上第 7位碳原子被甲基化形成m7G-PPNm時，此時形成的帽子被稱為“帽 0”，如果附m7G-PPNm外，這個核糖的第“ 2”號碳上也甲 基化，形成m7G-PPNm稱為“帽1 ”，如果5末端N1和N2中的兩個核糖均甲基化，成為 m7G-PPNmPNm2 稱為“帽2”。從真核生物帽子結(jié)構(gòu)形成的復(fù)雜可以看出，生物進化程度越高，其帽子結(jié)構(gòu)越復(fù)雜。5 5y yItiptopiiateItiptopiiate-、 -NTNT9N N? ? ? ? ? ? 0_F-OT-00_F-OT-0 - - P

4、-P-O1O1 or oror y y0-0-BaseBase0(E0(E OHOHiH0-P-00-P-0圖 17-9Post-transcri ptional modification EndEndL- - -7 - - - -7-McU)7-McU)腫jatftfsjatftfs計：triptwsphaittriptwsphait “capR“capR.r-Firir-FiriI IpApApApApApApApApApApApA 斥 ”tWv-AtWv-A twitwiof mRNa showing the 7-methylguanosine cap and poly-A tail.精

5、選文庫3真核生物mRNA 5端帽子結(jié)構(gòu)的重要性在于它是 mRNa做為翻譯起始的必要的結(jié)構(gòu)，對核糖體對mRNA的識別提供了信號，這種帽子結(jié)構(gòu)還可能增加mRNA勺穩(wěn)定性，保護 mRNa免遭5外切核酸酶的攻擊。2.在3端加尾大多數(shù)的真核 mRNA都有3端的多聚尾巴（A），多聚（A）尾巴大約為200bp。多聚（A）屠巴不是由DNA編碼的，而是轉(zhuǎn)錄后在核內(nèi)加上去的。受polyA聚合酶催化，該酶能識別,mRNa的游離3 -OH端，并加上約200個A殘基。精選文庫4多恢昔gS+jiATFgS+jiATF多核甘厳十nPPinPPi近年來已知，在大多數(shù)真核基因的 信號?？亢怂崦冈诖诵盘栂掠?10-15 入100

6、-200個A堿基。關(guān)于polyA尾巴的功能問題盡管經(jīng)過極其廣泛的探索，但還不完全清楚。有人推測 polyA可能與mRNA從細胞核轉(zhuǎn)送到細胞質(zhì)有關(guān)，但是相當數(shù)量，的沒有polyA屠巴的mRNA如組蛋白mRNA也照樣通過核膜進入細胞質(zhì)。還有人認為這種結(jié)構(gòu)對真核mRNA勺翻譯效率具有某種作用，并能穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)，保持一定的生物半衰期。3 一端有一個 AATAA序列，這個序列是 mRNaj -端加polyA尾的堿基外切斷磷酸二酯鍵，在polyA聚合酶催化下，在3 -OH上逐一引3.mRNA前體（hnRNA的拼接原核生物的結(jié)構(gòu)基因是連續(xù)編碼序列，而真核生物基因往往是斷裂基因，即編碼一個蛋白質(zhì)分子的核

7、苷酸序列被多個插入片斷所隔開，一個真核生物結(jié)構(gòu)基因中內(nèi)含子的數(shù)量，往往與這個基因的大小有關(guān)， 例如胰島素是一個很小的蛋白質(zhì)，它結(jié)構(gòu)基因只有兩個內(nèi)含子，而有些很大的蛋白質(zhì)，它的結(jié)構(gòu)基因中可 以有幾十個內(nèi)含子。經(jīng)過復(fù)雜的過程后，切去內(nèi)元，將有編碼意義的核苷酸片段 （Extron外元也叫外顯子） 連接起來（圖17-10 ）。熾JnlAnDFrimaiyFrimaiy innficnptinnficnpt I I E EACJACJE E i i I I EjgnEjgn I IAAAAAAIAAAAAAI AmAmb)iiE)ocii ipaflipafl 1|1|AAAAAAA)AAAAAAA)H

8、 HTnusUioTnusUio n n ；PodnPodn圖 17-10P rimary poly merase lltranscri pt of a eukaryote gene showing (a)introns after cappingand addition of polyA tail.(b)Excision of introns to form the mature mRNA is called sp licing.精選文庫5基因區(qū)域ExonIntronExon卵清蛋白內(nèi)元2UAAG GUGAACAGGUUG卵清蛋白內(nèi)元3UCAG GUACUCAGUCUGP-珠蛋白內(nèi)元1GCA

9、G GUUGUCAGGCUGmRNA這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的17-11以卵清蛋白基因為例，介紹一個典型的轉(zhuǎn)錄及加工過程。 IM cibii內(nèi)I I含護蚪晁于3 34 4i i 0 0mrmrL L|flfl宙羅腺科議化HBII乙|p|p【 E E 【FTFT【戌熟卵清3 3白廿他RNA圖 17-11卵清蛋白基因轉(zhuǎn)錄及加工過程圖中外顯示以1、2、表示，內(nèi)含子以 A、B、C、D表示mRNA勺拼接，需要在拼接部位有供拼接識別的保守性強的一致順序，通過對 分析，發(fā)現(xiàn)外元和內(nèi)元拼接部位部分堿基順序有一定的規(guī)律（見表17-4 ）。表17 - 4含有內(nèi)元的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物其拼接處的堿基順序100多種真核細胞基

10、因的真核生物的結(jié)構(gòu)的基因中具有可表達活性的外顯子，也含有無表達活性的內(nèi)含子，但內(nèi)含子序列下是 無意義的，越來越多的實驗證明有許多基因中的內(nèi)含子參與基因表達調(diào)控，在轉(zhuǎn)錄時，外顯子及內(nèi)含子均 轉(zhuǎn)錄到hnRNA中。在細胞核中hnRNA進行剪接作用，首先在核酸內(nèi)切酶作用下剪切掉內(nèi)含子；然后在連接 酶作用下，將外顯子各部分連接起來，而變?yōu)槌墒斓膍RNA這就是剪接作用，也有少數(shù)基因的hnRNA不需進行剪接作用，例如a -干擾素基因，圖精選文庫6P-珠蛋白內(nèi)元2CAGG GUGAACAGUCUCIg入內(nèi)含子1UCAG GUCAGCAGGGGCSV40病毒早期T抗原UAAG GUAAUUAGAUUC表中劃線的

11、堿基對拼接識別有重要作用,如將兔的P -珠蛋白的拼接部位的 GT改為AT后，拼接反應(yīng)即受到影響。mRN/前體拼機制U3U3 atiRhJPatiRhJPintTPHintTPHASMHLASMHLY Y OFOF SPLICBSPLICBOSOMEOSOMESTEPSTEP 1 1tAjlltAjllATAT HJRMAnHJRMAnONON : :AmAm y y spiJCEspiJCE sratsratCLHAVCLHAVACACT TE EU4U4圖 17-12assemblySTEPSTEP 2 2 T T spucEspucE firmfirm CLEAVAGECLEAVAGE A

12、NDAND tXDNtXDN SECyUENCJSECyUENCJ ucAntwucAntw護ii*ijii*ij intmnintmn 楓WTHSWTHS UlUl 血 ftarnftarn 就 a a LuiMLuiM 總、科曲1 1 & & liVerJdWliVerJdW inin uidtetuidtet創(chuàng)OHOHU5U5* *d d : :rifltur:rifltur: mRNAmRNAseqiinues)seqiinues)The RNA sp licing mechanism.RNA sp licing is catalyzed by a sp liceosome forme

13、d from theof U1,U2,U5,and sn RNPs(shown as green circles )plus other components (notshown).Afterthe 5spliceof the secondassembly of the sp liceosome ,the reaction occures in two spep s:in ste p 1the branch-po int A nucleotide in the intron sequence,which is located colse to the 3splice site ,attacks

14、 site and cleaves it;the cut 5end of the intron sequence thereby becomes covalently linked to this A nucleotide,forming the branched nucleotide shown in Figure 8-55.In ste p 2 the 3-OH endof the first exon sequence,which was created in the firststep,adds to the beginning exon sequence,cleqving the R

15、NA molecule at the 3s plice site;the two exon sequences are thereby joined to each other and the intron sequence is released ad a ribosone.These sp licing reactionsUlUl卻A AU UHlHl精選文庫7occur im the nucleus and gengerate mRNa molecules from p rimary RNA transcri pts （mRNA p recursormolecules）.mRNA拼接反應(yīng)

16、需要有核內(nèi)小分子RNA參與它們與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物稱為小核糖核蛋白顆粒，分別被命名為 U1,U2,U3,U4,U5,和U6RNA SnRNA中的U2RNA由與內(nèi)元右端拼接部位附近的UACUA順序高度互補，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由特定的酶來識別切除該環(huán)狀結(jié)構(gòu)，完成拼接過程，如圖17-12所示。SnRNA圖 17-13stages;energyEJtoAEJtoA 1 1 pGpGPrniiiyPrniiiy R R NANA cmtisoripicmtisoripi5HI IA AAGpAGp ExonExon 2TriRNATriRNAAGpAGpUnUn A AAOAOMechanim of m

17、RNa sp licing.Note that,for clarity,the p rocess is shown in twois not required for the process since transesterificationreactions are involved.真核生物1，而3 , 5-磷酸二酯鍵連接3末端與外顯子2之間的3， 和外顯子2可以連接起來（圖mRNA前體在剪接過程中，還可以形成套索樣的結(jié)構(gòu)，在內(nèi)含子序列中常有一個分支部位的 腺苷酸殘基，它的2 -OH可以自動攻擊內(nèi)含子 5端與外顯子1連接的磷酸二酯鍵，切開了外噗子 腺苷酸原來已有3，5-磷酸二酯鍵相連的兩個

18、相鄰的核苷酸殘基，加上此 后，在腺苷酸處出現(xiàn)了一個套索，已被切下的外顯子1的3 -OH攻擊內(nèi)含子5-磷酸二酯鍵，鍵斷裂后，內(nèi)含子以套索的形式被節(jié)下來，此時外顯子 17-13 ）。不論拼接過程如何，拼接必須極為精確，否則會導(dǎo)致遺傳信息傳遞障礙，合成的蛋白質(zhì)可能喪失其正 常的功能。我國南方廣大地區(qū)是P-地中海貧血的高發(fā)區(qū)，這是由于P -珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制所引起的一種血紅蛋白病。 實驗表明P -珠蛋白基因兀1中核苷酸的點突變改變了正常拼接部位的堿基順 序，結(jié)果造成錯誤部位的拼接。加工成熟的mRNAI能翻譯，但產(chǎn)物不是正常的P -珠蛋白，結(jié)果引起血紅蛋白級結(jié)構(gòu)和功能的改變。（二） rRN

19、A轉(zhuǎn)錄后加工原核生物rRNA轉(zhuǎn)錄后加工，包括以下幾方面： rRNA前體被大腸桿菌 RNaseffl ,RNaseE等剪切成一定 鏈長的rRNA分子；rRNA在修飾酶催化下進行堿基修飾；rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體的大、小亞基（見圖 17-14 ）P PUMUMg精選文庫84040仏前體號-H H =_1-5s-5s KhlAKhlAittNAittNA風(fēng)RNARNAiRrfAiRrfARN3MRN3M n nAHN/ksAHN/ksI I 血 RNARNAIKNIKNA AI-!23s23s RIVARIVA 鼬 RNARNAI I _n_n5i5i rRNArRNA5151 rRNArRN

20、A40s40s鬣里如種盍口嗔:圖17-14 大腸桿菌rRNA前體的加工真核生物rRNA前體比原核生物大，哺乳動物的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為45s，低等真核生物的rRNA前體為38s,真核生物5SRNA前體獨立于其他三種 rRNA的基因轉(zhuǎn)錄（圖17-15）。4s4s rRNArRNA 酮 ttttI I甲站優(yōu)申基化45S45S rRNArRNA1 1水M M323323圖17-15 真核生物rRNA前體的加工真核生物rRNA前體中含有插入順序，rRNA前體要形成成熟的rRNA,需要經(jīng)過拼接反應(yīng)。例如，四膜蟲的rRNA前體的拼接是一種無酶催化的自動拼接過程。四膜蟲基因組內(nèi)，26srRNA編碼的區(qū)域內(nèi)有413

21、bp的插入順序。該插放序列可以不消耗能量從 rRNA前體中被除掉。用SDS煮沸和用蛋白酶外理等破壞酶活性 辦法，都不能破壞拼接活性，但反應(yīng)中Mg2+和鳥嘌吟核苷酸是必在的。用32P-GTP進行追蹤實驗表明，起始過程是GTP在插入順序5端發(fā)生親核反應(yīng)，同時 GMP與 5端切點的切除段形成磷酸二酯鍵并使原RNA斷開。第二步是5 切點的外元3 -OH與3 切點的外元5 -P共價連接，獲得成熟的rRNA被切除部分 最后環(huán)化，形成一個環(huán)狀結(jié)構(gòu)，同時從5 端去掉一個15核苷酸啐片。剩余部分連接成 399核苷酸的環(huán)狀精選文庫9個核苷酸的線性內(nèi)含子序列即L-19，它具有催化活性，上面的剪接（圖 17-16 ）

22、。內(nèi)含子外于1I1I外S S子2 2G-QHG-QHy y - y并&子1 1外顯子2 2-G G6 6414414y r +L L 舊 RNARNA圖17-16 四膜蟲rRNA前體的自我剪接這種rRNA的自身剪接反應(yīng)給人們一個提示：即RNA分子也有酶的催化活性。這向酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)這一傳統(tǒng)概念提出了挑戰(zhàn)。這種有酶催化活性的別發(fā)現(xiàn)RNA具有催化作用，他們的發(fā)現(xiàn)對于了解生命進行過程有重要意義。 催化的斷裂一連接反應(yīng)是最早出現(xiàn)的催化過程。為此，他們共同獲得了RNA分子命名為Ribozyme。很可能在原始生命中，1989年Nobel化學(xué)獎。T.Cech 和 S.AItman 各自分RNA所從大多數(shù)Ribozymw的結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)一些特征， 例如：錘頭狀結(jié)構(gòu)的如果它們中的堿基改變會使這種催化活性失去作用。根據(jù)這種特片，科學(xué)家們在體外沒計并人工合成這種 RNA分子，用于抗腫瘤及抗病毒的實驗中（圖RNA分子有13個保守的核苷酸序列,17-17 ）。C呼唸國? JXO圖17-17 錘頭結(jié)構(gòu)模式圖