開口箭提取物研究論文

1、開口箭提取物研究論文【摘要】目的通過體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，探討開口箭提取物的細(xì)胞毒活性，為進(jìn)行深層次研究提供依據(jù)。方法采用四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法。結(jié)果開口箭甲醇提取物、總皂苷、30%總皂苷和70%總皂苷對(duì)HL-60和Caski細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對(duì)照相比（P 【關(guān)鍵詞】開口箭；皂苷；MTT法；細(xì)胞毒活性 Abstract：ObjectiveToobservethecytotoxicitiesoftheextractsofTupistrachinensisBak.withinvitrocellculturetechnology,andprovideevidenceforthefurth

2、erresearch.MethodsThecytotoxicitieswereassayedbyMTTmethodsonHL-60andCaskitumorcells.ResultsTheinhibitioneffectoftheextractsofTupistrachinensisBak.,totalsaponins,30%totalsaponinsand70%totalsaponinsonHL-60andCaskicellswereallprominent,comparedwiththenegativemodelgroup(P Keywords：TupistrachinensisBak.；

3、Saponin；MTTmethod；Cytotoxicity 開口箭（TupistrachinensisBak.）系百合科Liliaceae鈴蘭族開口箭屬植物，為著名的傳統(tǒng)中藥，主治勞熱咳嗽、跌打損傷、風(fēng)濕痹痛等癥，民間用于治療咽喉炎、扁桃體炎等?，F(xiàn)證明開口箭具有祛痰、抗炎、抑菌及醒酒作用1，2。 本實(shí)驗(yàn)室通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)湖北省產(chǎn)開口箭含有甾體皂苷和甾體皂苷元,且含量較高3。皂苷具有增強(qiáng)免疫功能、抗輻射、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗炎、降血糖等廣泛的生物學(xué)活性,近年越來越受人們的普遍關(guān)注。有研究證實(shí)開口箭同屬植物皂苷成分有細(xì)胞毒活性4，5。本文旨在通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn),觀察開口箭提取物對(duì)HL-60和Caski細(xì)

4、胞的細(xì)胞毒活性,現(xiàn)報(bào)告如下。 1材料 1.1細(xì)胞株人急性淋巴細(xì)胞性白血病細(xì)胞（HL-60）、人宮頸鱗狀上皮癌細(xì)胞(Caski)均由三峽大學(xué)免疫教研室提供。 1.2藥品與儀器RPMI-1640為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；新生小牛血清為杭州四季青生物材料有限公司產(chǎn)品；HEPES為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，胰蛋白酶為美國(guó)GIBCO公司產(chǎn)品；四氮唑藍(lán)(MTT)為美國(guó)AMRESCO公司產(chǎn)品；絲裂霉素(MMC，浙江海正藥液股份有限公司，批號(hào)：051211)；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(GENIOSTECAN)；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；LD4-2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；96孔板(美國(guó)Cornning公司)。 開

5、口箭根莖于2002-07采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)三峽大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院陳發(fā)菊副教授鑒定為TupistrachinensisBak.，標(biāo)本存放于湖北省天然產(chǎn)物研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)：TC200207SNJ）。 1.3藥物制備開口箭根莖粉碎后，用甲醇回流提取3次，合并3次提取液，濃縮后經(jīng)石油醚脫脂用水飽和的正丁醇萃取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收正丁醇，濃縮液抽干后即得到開口箭總皂苷，配成水液，過大孔樹脂柱，水洗，30%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脫，得開口箭四部分皂苷。 分別取開口箭甲醇提取物、開口箭總皂苷、30%開口箭皂苷、70%開口箭皂苷4個(gè)樣品，用含10%滅活的新生小牛血清RPMI-1640

6、培養(yǎng)液將其配制成所需濃度，依次為62.5,125,250,500,1000,2000g/ml。絲裂霉素(MMC)用含10%滅活的新生小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液將其配置為250g/ml。所有受試樣品均用0.22m微孔濾膜過濾除菌。 2方法 2.1細(xì)胞培養(yǎng)HL-60和Caski細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)液（另加10mmol/LHEPES,2.0mg/mlNaHCO3，100U/ml青霉素，100g/ml鏈霉素和10%新生小牛血清），于CO2孵箱中37，5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)。貼壁細(xì)胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化傳代。 2.2MTT比色法6按Mosmann氏法略加改進(jìn)。將

7、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單個(gè)細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為0.8105個(gè)/ml,接種于96孔培養(yǎng)板,每孔接種180l，轉(zhuǎn)板6h后加20l受試藥,另設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥)、空白凋零組（只有培養(yǎng)基）和陽(yáng)性對(duì)照組（MMC組），每組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h后加MTT(5mg/ml)15l,繼續(xù)培養(yǎng)4h后,棄去上清液，加DMSO100l,用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于492nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(OD)值7,求出IC50。抑制率（%）=1-（實(shí)驗(yàn)組OD均值-空白組OD均值）/(對(duì)照組OD均值-空白組OD均值）100%。 2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以s表示，數(shù)據(jù)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。用Origin軟件，通

8、過半對(duì)數(shù)擬合直線求IC50值。 3結(jié)果 3.1開口箭總提取物和總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的影響結(jié)果見表1。 表1總提取物和總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用（略） 與陰性對(duì)照組比較，*P 由表1可知開口箭總提取物和總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對(duì)照組相比有顯著性差異（P 3.2開口箭30%總皂苷和開口箭70%總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的影響結(jié)果見表2。 表230%總皂苷和70%總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用（略） 與陰性對(duì)照組比較，*P 由表2可知開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對(duì)HL-60細(xì)胞的抑制作用顯著，與陰性對(duì)照組比有顯著性差異（P 3.3開口箭總提取物和總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞的

9、影響結(jié)果見表3。 表3開口箭總提取物和總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞的抑制作用（略） 與陰性對(duì)照組比較，*P 由表3可知開口箭總提取物和總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞抑制作用明顯，與陰性對(duì)照組比有顯著性差異（P 3.4開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞的影響結(jié)果見表4。 表430%總皂苷和70%總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞的抑制作用（略） 與陰性對(duì)照組比較，*P 由表4可知，開口箭30%總皂苷和70%總皂苷對(duì)Caski細(xì)胞抑制作用顯著，與陰性對(duì)照組比有顯著性差異（P 4討論 以上結(jié)果表明，開口箭甲醇提取物、總皂苷、30%皂苷和70%皂苷對(duì)體外培養(yǎng)的HL-60和Caski細(xì)胞株的抑制作用顯著，與陰性對(duì)照

10、組比均有顯著性差異（P 開口箭總皂苷上大孔樹脂柱所得95%開口箭皂苷部分量較少，目前正在研究之中。至于不同的開口箭部位細(xì)胞毒活性存在差異，應(yīng)與它們所含不同皂苷成分有關(guān)，還需要對(duì)其進(jìn)行深入研究。 從植物中尋找抗腫瘤藥物及抗腫瘤輔助藥物，在國(guó)內(nèi)外均為抗腫瘤藥物研究的重要組成部分。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道開口箭對(duì)HepG2和S180細(xì)胞株亦有明顯的抑制作用8,本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)開口箭對(duì)HL-60和Caski細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞毒作用，可見開口箭具有廣譜抗腫瘤作用，此外開口箭還有祛痰抗炎等作用。因此對(duì)開口箭的抗腫瘤作用及機(jī)制值得進(jìn)一步研究。 【參考文獻(xiàn)】 1楊春艷,鄒坤,楊興海,等.開口箭祛痰、抗炎和抑菌實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)民族民間醫(yī)藥雜志,2005，2:103. 2湯子春,鄒坤,汪鋆植,等.開口箭與筒鞘蛇菰提取物的醒酒作用的實(shí)驗(yàn)研究J.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2006,17(11):2163. 3黃麗,廖全斌,鄒坤,等.開口箭中甾體皂苷元含量的測(cè)定J.三峽大學(xué)學(xué)報(bào)自然科學(xué)版,2003,25(6):562. 4沈平，王三龍,楊崇仁,等.彎蕊開口箭中的多羥基甾體皂甙元J.植物學(xué)報(bào),2003,45(5):626. 5PanWb,ChangFR,WeiLM,etal.Newflavans,spirostanolsapogenins,andapregnamegeninfromTupistrachinensisandtheirc