微生物的硝化作用

1、微生物的硝化作用高級(jí)微生物學(xué)綜述微生物的硝化作用 學(xué)生姓名：任偉帆 學(xué) 號(hào)：161指導(dǎo)教師：唐文竹所在學(xué)院：生物工程學(xué)院專 業(yè)：生物學(xué)大連工業(yè)大學(xué)2016.10.10微生物的硝化作用摘要：本文主要介紹了硝化作用微生物的種類,包括氨氧化菌、亞硝酸氧化菌、異養(yǎng)氨氧化菌和厭氧氨氧化菌。分析了硝化微生物的系統(tǒng)發(fā)育，還介紹了在硝化作用微生物生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展，以及同類群細(xì)菌中與硝化作用相關(guān)的酶類。文章的最后還分析了微生物脫氮在污水處理中的應(yīng)用。關(guān)鍵詞：氨氧化細(xì)菌；系統(tǒng)發(fā)育分析；硝化作用；微生物脫氮Microbial nitrificationAbstract: This paper introduces t

2、he types of nitrifying microorganisms, including ammonia-oxidizing bacteria, nitrous acid, oxidizing bacteria, heterotrophic ammonia-oxidizing bacteria and anaerobic ammonium-oxidizing bacteria. The phylogenetic analysis of microbes was also studied, as well as advances in microbial ecology of nitri

3、fication and the enzymes associated with nitrification in the same group of bacteria. Finally, the application of microbial denitrification in sewage treatment was analyzed.Key words： ammonia-oxidizing bacteria; phylogenetic analysis; nitrification; microbial denitrification前言 氮元素在自然界中大量存在，是非常豐富的元素之

4、一,它在自然界中主要以分子氮、有機(jī)氮化合物和無(wú)機(jī)氮化合物的形式存在。它們?cè)谖⑸?、?dòng)物、植物體內(nèi)相互轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)化，構(gòu)成了氮循環(huán)1。而微生物在其中起著非常重要的作用，主要通過(guò)氨化作用、硝化作用、反硝化作用以及固氮作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而目前，水體污染越遠(yuǎn)越嚴(yán)重，處理難度越來(lái)越大，生物處理工藝受到了更多的重視。因此，通過(guò)深入分析硝化作用微生物的種類及作用機(jī)理，不斷改進(jìn)生物脫氮工藝具有重要意義。更多還原深入分 1 硝化作用的微生物種類及其系統(tǒng)發(fā)育分析 硝化作用分為兩個(gè)階段,即亞硝化(氨氧化)和硝化(亞硝酸氧化) , 分別由兩類化能自養(yǎng)微生物完成,亞硝化細(xì)菌進(jìn)行氨的氧化,硝化細(xì)菌完成亞硝酸氧化。在伯杰氏細(xì)菌鑒定

5、手冊(cè)第 9 版2中將它們統(tǒng)歸于硝化桿菌科9個(gè)屬:硝化桿菌屬(Nitrobacter)、硝化刺菌屬(Nitrospina)、硝化球菌屬(Nitrococcus)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)，硝化螺菌屬 Nitrospira 和亞硝化弧菌屬Nitrosovibrio共 20種。這些微生物廣泛分布于土壤、 湖泊及底泥、海洋等環(huán)境中。 除了上述專性化能自養(yǎng)微生物外, 有些異養(yǎng)微生物也能進(jìn)行硝化作用。如惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida) 、脫氮

6、副球菌(Paracoccus denitrificans) 、糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis) 3 等。 這些微生物可以在低碳條件下進(jìn)行硝化作用，也可以在有機(jī)土環(huán)境中進(jìn)行硝化作用。 此外,近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)了厭氧氨氧化的現(xiàn)象, 并證明是一個(gè)生物過(guò)程,是由一些厭氧或兼性厭氧微生物在厭氧條件下完成的 ,這些微生物以NO3-或 NO2- 為電子受體氧化氨獲得生長(zhǎng)所需能量，生長(zhǎng)非常緩慢，最短的倍增時(shí)間也要 11 d。迄今為止 ,雖然采取了各種辦法, 但未能分離到厭氧氨氧化的純培養(yǎng)物。盡管如此，還是可以對(duì)厭氧氨氧化微生物進(jìn)行富集和特性研究 ,采用熒光原位雜交技術(shù)( FISH)和16S r

7、DNA PCR 擴(kuò)增、序列測(cè)定, 證實(shí)了厭氧氨氧化微生物的存在,16S rDNA 序列同源性分析表明 ,它們是一群獨(dú)特的原核生物4。 基于 16S rRNA 基因序列同源性(相似性)的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,所有的自養(yǎng)氨氧化細(xì)菌(亞硝化細(xì)菌)系統(tǒng)發(fā)育比較單一,它們均屬于變形菌綱( Proteobacteria)亞綱 和亞綱 ,其中屬于亞綱的亞硝化細(xì)菌又可以分為兩個(gè)類群: 亞硝化單胞菌群(Nitrosomonas) ,包括歐洲亞硝化單胞菌(Nitrosomonas europaea)和運(yùn)動(dòng)亞硝化球菌(Nitrosococcus mobilis)；以及亞硝化螺菌群(Nitrososp ira) ,包括所

8、有的屬于亞硝化螺菌屬(Nitrosospira) 、亞硝化弧菌屬(Nitrosovibrio)和亞硝化葉菌屬(Nitrosolobus)的菌株,從進(jìn)化距離看,這 3個(gè)屬完全應(yīng)歸于 1個(gè)屬5。 與亞硝化細(xì)菌不同,硝化細(xì)菌(亞硝酸氧化菌)的系統(tǒng)發(fā)育則要復(fù)雜許多,研究結(jié)果表明, 硝化細(xì)菌的4個(gè)屬分屬于不同的 4 個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類型: 硝化桿菌屬(Nitrobacter)屬于變形菌綱的亞綱, 硝化刺菌屬(Nitrospina)屬于亞綱、硝化球菌屬(Nitrococcus)屬于亞綱，硝化螺菌屬 (Nitrospira)屬于硝化螺菌門(mén)( phylum Nitrospira)6。以上這些充分說(shuō)明了硝化作用微生物

9、在進(jìn)化上的系統(tǒng)發(fā)育起源的異源性。 2硝化作用微生物的分子生態(tài)學(xué)研究 由于亞硝化細(xì)菌、硝化細(xì)菌或厭氧氨氧化菌的生長(zhǎng)都非常緩慢，使得分離純化較為困難, 從而影響了對(duì)這類微生物研究的深入,而這類微生物的生態(tài)作用及其重要性又是不言而喻的。同時(shí)由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展、進(jìn)步以及在生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用,為避開(kāi)傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)直接對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)和研究開(kāi)辟了嶄新的途徑。有學(xué)者應(yīng)用特異引物的 PCR 擴(kuò)增方法,分析了水樣中-亞綱的氨氧化細(xì)菌,結(jié)果表明, 從南極等采集的樣品均可擴(kuò)增出 PCR 產(chǎn)物,特異性探針雜交表明, 所擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物為氨氧化細(xì)菌的 16S rRNA 基因7。說(shuō)明了該亞綱氨氧化細(xì)菌分布的廣泛性

10、。 沉積物中氨氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu),表明氨含量和污染程度越高其氨氧化細(xì)菌含量也越高,DGGE（變性梯度凝膠電泳）和 16S rDNA 分析表明主要是亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)類群的增加。Hastings 等8 應(yīng)用MPN、PCR、核酸探針雜交等分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)富營(yíng)養(yǎng)化的淡水湖的氨氧化作用進(jìn)行了季節(jié)變化的研究,表明夏天具有較強(qiáng)的硝化作用,水中的氨氧化細(xì)菌隨季節(jié)有較大的變化，主要是一些耐氨濃度較高的亞硝化螺菌(Nitrosospira)增加了, 而底泥的氨氧化細(xì)菌隨季節(jié)的變化不大。3硝化作用的機(jī)制及相關(guān)酶類 硝化作用是利用亞硝酸菌和硝酸菌將氨氮轉(zhuǎn)化為硝酸氮的過(guò)程，該過(guò)程的微生物為好氧化

11、能自養(yǎng)型微生物，利用氨氮、亞硝酸鹽為氮源，CO32-、 HCO-、 CO2 等作為無(wú)機(jī)碳源來(lái)獲得能量。其硝化過(guò)程的特征為：該過(guò)程是一個(gè)好氧的反應(yīng)，且需要大量的氧氣來(lái)完成；該反應(yīng)過(guò)程中微生物生長(zhǎng)率低，生物量濃度較低，且受環(huán)境條件較敏感；硝化過(guò)程是一個(gè)產(chǎn)酸的反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中需要補(bǔ)充大量的堿來(lái)保證反應(yīng)的順利進(jìn)行。 在專性化能自養(yǎng)硝化作用中, 反應(yīng)是由亞硝化細(xì)菌和硝化細(xì)菌分別完成的，其限速步驟是亞硝化細(xì)菌進(jìn)行的氨的氧化，因此亞硝化細(xì)菌在硝化作用研究中受到特別的關(guān)注。首先在氨單加氧酶(AMO)的催化下將氨氧化成羥氨(NH2OH)，再經(jīng)羥氨氧化還原酶(HAO)的催化下將羥氨氧化成亞硝酸(NH2-）， 進(jìn)

12、而由硝化細(xì)菌的亞硝酸鹽氧化還原酶催化形成硝酸(NH3-)。而在厭氧氨氧化細(xì)菌中的情況則較為復(fù)雜，首先是亞硝酸被還原為羥氨, 然后一分子氨和一分子羥氨在類氨單加氧酶的催化下被氧化為肼(N2H4), 進(jìn)而在類羥氨氧化還原酶的催化下被氧化為氮?dú)?0。 反應(yīng)過(guò)程涉及的酶類：氨單加氧酶( ammonia monooxygenase, AMO) 羥氨氧化還原酶( hydroxylamine oxidoreductase, HAO），亞硝酸鹽氧化還原酶( nitrite oxidoreductase, NOR），類氨單加氧酶( ammonia monooxygenase-like enzyme），類羥氨氧化

13、還原酶( hydroxylamine oxidoreductase-like enzyme)。4生物脫氮在污水治理中的應(yīng)用4.1微生物脫氮原理 微生物脫氮的過(guò)程基本上可以總結(jié)為三個(gè)過(guò)程: 氨化作用，即將有機(jī)氮化合物轉(zhuǎn)化為氨氮的一個(gè)過(guò)程硝化作用，可將氨態(tài)氮轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮，是專性化能自養(yǎng)菌(亞硝化和硝化)以及異養(yǎng)氨氧化菌進(jìn)行的硝化作用方式 反硝化，在厭氧或兼氧條件下以硝酸氮為電子受體，最終還原為氮?dú)饣蛘叩钠渌麣鈶B(tài)形式，此過(guò)程是厭氧氨氧化菌進(jìn)行的硝態(tài)氮的還原過(guò)程9。從反應(yīng)機(jī)理來(lái)看，硝化過(guò)程僅改變了廢水中氮素的存在形式，反硝化作用才是真正的脫氮過(guò)程。因此完整的氨氮去除過(guò)程需要在好氧條件下進(jìn)行硝化處理，

14、在厭氧條件下進(jìn)行反硝化處理。4.2 傳統(tǒng)生物脫氮工藝 生活污水中含有大量的有機(jī)氮和氨氮 ，當(dāng)污水中的有機(jī)物被生物降解氧化時(shí)其中的有機(jī)氮被轉(zhuǎn)化為氨氮。活性污泥法是應(yīng)用最早的生物脫氮技術(shù)，是利用氨化、硝化和反硝化最為典型的污水處理技術(shù)。主要構(gòu)筑物為曝氣池、硝化池、反硝化池和沉淀池，在曝氣池中進(jìn)行氨化作用和有機(jī)物的降解，然后在硝化池中氨氮在亞硝化菌和硝化菌的作用下轉(zhuǎn)化為亞硝酸氮和硝酸氮，在反硝化池中最終轉(zhuǎn)化為氮?dú)?；該工藝分別在各自的構(gòu)筑物中進(jìn)行脫氮反應(yīng)，反應(yīng)速度快且徹底，脫氮效果非常好，但是其存在的缺點(diǎn)是工藝流程長(zhǎng)、所需構(gòu)筑物多、投資高等11。 4.3 同步硝化反硝化脫氮工藝 傳統(tǒng)的研究結(jié)果表明硝化

15、反應(yīng)和反硝化反應(yīng)所需的環(huán)境不同，它們不能在同一個(gè)結(jié)構(gòu)單元中共同實(shí)現(xiàn)。但隨著對(duì)兩類細(xì)菌及脫氮工藝的深入研究，發(fā)現(xiàn)在好氧狀態(tài)下污水中有30%的總氮會(huì)被去除，這和傳統(tǒng)的理論截然不同。再進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在好氧的環(huán)境中也存在反硝化的現(xiàn)象，其存在著一種好氧反硝化的細(xì)菌。隨著同步硝化反硝化理論的出現(xiàn)，在一些污水處理工藝中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。目前對(duì)該理論的解釋有三種：（1）環(huán)境理論： 研究這認(rèn)為在好氧的構(gòu)筑物中，曝氣的不均勻，在環(huán)境中局部出現(xiàn)了缺氧、厭氧和好氧的環(huán)境，因此在工藝運(yùn)行過(guò)程中，會(huì)在局部出現(xiàn)適合反硝化反應(yīng)的條件。（2）微觀環(huán)境理論：該理論主要是針對(duì)顆粒污泥形式的微觀環(huán)境，研究著認(rèn)為在大于100m的

16、顆粒污泥中，在顆粒中回形成內(nèi)部缺氧或厭氧的環(huán)境，進(jìn)而在顆粒外部進(jìn)行硝化反應(yīng)，在內(nèi)部進(jìn)行反硝化作用，因此，可實(shí)現(xiàn)同步硝化反硝化。（3）微生物理論：認(rèn)為存在好氧環(huán)境進(jìn)進(jìn)行反硝化的細(xì)菌，即好氧反硝化菌。在好氧環(huán)境中硝化菌和好氧反硝化菌相互協(xié)作，實(shí)現(xiàn)了同步硝化反硝化12。 結(jié)論： 微生物脫氮在目前以及未來(lái)具有廣闊的應(yīng)用前景。雖然在這方面國(guó)內(nèi)已經(jīng)進(jìn)行了大量研究工作，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中不但就其微生物群落功能展開(kāi)研究，同時(shí)要考慮到水動(dòng)力學(xué)和生物工藝學(xué)包含的廣泛的科學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)，優(yōu)化處理方案的能力也是至關(guān)重要的，同時(shí)要應(yīng)該加強(qiáng)不同學(xué)科之間的交叉與合作,從工程應(yīng)用、生態(tài)學(xué)及微生物學(xué)等角度加大力度進(jìn)行研究，爭(zhēng)取有所突

17、破, 在環(huán)境治理上取得重大進(jìn)展。參考文獻(xiàn)：1 周德慶微生物學(xué)教程北京：高等教育出版社.2011.42 Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Stalely JT, Williams ST.Bergey s Manual of Determinative BacteriologyJ.9th Ed.Baltimore:The Will iams and Wilkins Company, 1994.447- 450.3 張光亞，方柏山，閔航，等好氧同時(shí)硝化反硝化菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析J應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)， 2005,11(2)：226-228.4 劉志培 劉雙江.硝化作用

18、微生物的分子生物學(xué)研究進(jìn)展J.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào).2004,10( 4): 521-525.5 Head IM , Hiorns D, Embley TM , McCarthy AJ, Saunders JR.The phylogeny of autotrophic ammonia-oxidizing bacteria as determined by analysis of 16S ribosomal RNA gene sequencesJ. J Gen Microbiol, 1993, 139.6 Bock E, Koops HP.The genus Nitrobacter and related genera. In Balows A, Trper HG, Dworkin M , et al ed. The ProkaryotesJ. 2nd ed. New York:Springer Verlag, 1992.7 Voy tek MA, Ward BB.Detection of ammonium-oxidizing bacteria of