第四章 生物化學(xué)-核酸化學(xué)

1、 4.64.6 核酸的分離、合成和鑒定核酸的分離、合成和鑒定 4.1 4.1 概述概述 4.2 核苷酸核苷酸 4.3 4.3 核酸的結(jié)構(gòu)核酸的結(jié)構(gòu) 4.4 4.4 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì) 4.54.5 核酸的生物學(xué)功能核酸的生物學(xué)功能 4.1 4.1 概述概述 n1.核酸（nucleic acid）的發(fā)現(xiàn) n1869年，F(xiàn). Miescher從細胞核中分離出核素。 nA.Kossel發(fā)現(xiàn)核素是蛋白質(zhì)和核酸的復(fù)合物， 并分析出核酸的組成及各組成成分的比例。 核酸核酸 核苷酸核苷酸 磷酸磷酸核苷核苷 戊糖戊糖堿基堿基 水水 解解 n 2. 核酸的組成和分類 n核酸分為： n脫氧核糖核酸（deoxyr

2、ibonucleic acid， DNA） 主要集中在細胞核，線粒體和 葉綠體中也有少量DNA； n核糖核酸（ ribonucleic acid，RNA） 90%分布在細胞質(zhì)中，10存在 于細胞核中。 n 3. 核酸的重要性 n 核酸是遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ) 1928: Griffith n1928年，英國軍醫(yī) Frederick Griffith (18811941) 以老鼠 實驗發(fā)現(xiàn)，將活的 良性肺炎雙球菌與 死的惡性肺炎雙球 菌混合，可以引起 轉(zhuǎn)型，得到活的惡 性菌，使老鼠死亡。 Oswald Avery (1877-1955) Microbiologist Avery led the team

3、 that showed that DNA is the unit of inheritance. One Nobel laureate has called the discovery the historical platform of modern DNA research, and his work inspired Watson and Crick to seek DNAs structure. 1944年完成的肺炎球菌轉(zhuǎn)化試驗， 證明DNA攜帶遺傳信息。 4.2 核苷酸(nucleotide) 核酸核苷酸 磷酸 核苷 戊糖 堿基 4.2.1 核苷酸的結(jié)構(gòu) n1. 戊糖 O H H

4、OH H OH OH H HOCH2 HOCH2 O H H OH H H OH H D-核糖D-2-脫氧核糖 n RNA中含D-核糖(ribose) n DNA中含D-2-脫氧核糖(deoxyribose) n2. 堿基(base) n包括嘧啶堿和嘌呤堿兩類 嘌呤 腺嘌呤 鳥嘌呤 N N N N H N N N N H HN N N N H NH2 H2N O (purine, Pu) (adenine, A) (guanine, G) 7 8 9 1 2 3 4 5 6 嘧啶胞嘧啶 尿嘧啶 胸腺嘧啶 N N N N H HN N H HN N H O O O O O CH3 NH2 (py

5、rimidine, Py) (cytosine, C) (uracil, U) (thymine, T) 1 2 4 5 6 3 嘌呤 嘧啶 腺嘌呤（A） 鳥嘌呤（G） 胞嘧啶（C） 尿嘧啶（U） 胸腺嘧啶（T） 兩種核酸均有 RNA有 DNA有 堿基 n 稀有堿基（minor base） 假尿嘧啶核苷假尿嘧啶核苷次黃嘌呤核苷次黃嘌呤核苷 二氫尿嘧啶核苷二氫尿嘧啶核苷甲基鳥嘌呤核苷甲基鳥嘌呤核苷 n3. 核苷（nucleoside） n戊糖和堿基縮合而成的糖苷稱為核苷。 N9 N1 1 1 腺嘌呤核苷 （adenosine，A） 胞嘧啶脫氧核苷 （deoxycytidine，dC） 戊 糖 C

6、1 和 嘧 啶 堿 N1 相 連 接 戊 糖 C1 和 嘌 呤 堿 N9 相 連 接 RNARNA中主要的核糖核苷中主要的核糖核苷DNADNA中主要的脫氧核糖核苷中主要的脫氧核糖核苷 腺嘌呤核苷 （adenosine，A） 腺嘌呤脫氧核苷 （deoxyadenosine，dA） 鳥嘌呤核苷 （guanosine，G） 鳥嘌呤脫氧核苷 （deoxyguanosine，dG） 胞嘧啶核苷 （cytidine，C） 胞嘧啶脫氧核苷 （deoxycytidine，dC） 尿嘧啶核苷 （uridine，U） 胸腺嘧啶脫氧核苷 （deoxythymidine，dT） 核糖核苷和脫氧核糖核苷 核苷常用單字母

7、符號表示：如腺苷用A表示，脫氧核苷在符 號前加小寫字母d，如脫氧腺苷用dA表示。 n稀有核苷（修飾核苷） OH N NH O O HOCH2 O OH 修飾堿基與核糖 或脫氧核糖連接 5，6-二氫尿苷 正常堿基與修 飾核糖連接 OCH3 HOCH2 O OH 2-O-甲基腺苷 堿基和核糖以 特殊方式連接 假尿嘧啶核苷 C5 n4. 核苷酸（nucleotide） n核苷中戊糖的羥基磷酸酯化就形成核苷酸 n核糖核苷酸：2-、3-和5-核苷酸 n脫氧核糖核苷酸：3-和5-脫氧核苷酸 自然界存在 的核苷酸為 5-核苷酸 核苷酸 DNARNA 核核 苷苷 酸酸 核核 苷苷 戊糖戊糖D-2-脫氧核糖D-

8、核糖 堿堿 基基 嘌呤堿嘌呤堿 嘧啶堿嘧啶堿 腺嘌呤、鳥嘌呤 胞嘧啶、胸腺嘧啶 腺嘌呤、鳥嘌呤 胞嘧啶、尿嘧啶 酸酸磷酸磷酸 兩類核酸的基本化學(xué)組成 4.2.2 4.2.2 核苷酸的性質(zhì)核苷酸的性質(zhì) n1.一般物理性質(zhì) n無色粉末或結(jié)晶； n易溶于水，不溶于有機溶劑； n酸性溶液中不穩(wěn)定，中性和堿性溶液中很穩(wěn)定； n具有旋光性 n 2. 互變異構(gòu)現(xiàn)象 n 堿基上帶有酮基的核苷酸能 轉(zhuǎn)化為烯醇式。 n3. 紫外吸收 n在240290nm有吸收， 最大值在260nm附近。 n 不同的核苷酸有不同的吸收特性。 n測定兩個波長的吸收值之比260/280，判斷樣品的純 度。 n 純DNA的值為1.8，純

9、RNA的值為2.0。樣品中如有雜 蛋白及苯酚，比值即明顯降低。 n 4. 核苷酸的兩性解離 4.2.3 4.2.3 核苷酸的重要衍生物核苷酸的重要衍生物 n1. 5-二磷酸核苷酸和5-三磷酸核苷酸 n核苷三磷酸化合物在生物體內(nèi)的能量代謝中起著 重要的作用。 n ATP （三磷酸腺苷）在生 物體內(nèi)化學(xué)能的儲存和利用 中起關(guān)鍵作用； n GTP參加蛋白質(zhì)和嘌呤的合成 n CTP參加磷脂的合成 n UTP參加多糖的合成 n 2. 環(huán)化核苷酸 n 核苷酸的5-磷酸與核糖 C3的羥基結(jié)合成環(huán)。 n 生理功能：作為激素作 用的媒介物，參與調(diào)節(jié)細 胞生理生化過程，控制生 物的生長、分化和細胞對 激素的效應(yīng)。

10、 n 3. 輔酶類核苷酸 輔酶A（ CoA） 3磷酸腺苷酸 泛酸氨基乙硫醇 ?；d體 輔酶I（Co I,NAD) 輔酶(Co II，NADP） 黃素腺嘌呤二 核苷酸（FAD） 煙酰胺 腺嘌呤核苷酸 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 4.3 4.3 核酸的結(jié)構(gòu)核酸的結(jié)構(gòu) n4.3.1 DNA4.3.1 DNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) n1. DNA的堿基組成 n四種主要的堿基：腺 嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶和胸腺嘧啶。 n規(guī)律： nChargaff 當(dāng)量規(guī)則： A=T；G=C； n19491949年年ChargaffChargaff發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)A A與與T T及及C C 與與G G配對現(xiàn)象。配對現(xiàn)象。 nErwin Charg

11、aff (1905-2002) Chargaff discovered the pairing rules of DNA letters, noticing that A matches to T and C to G. n 具有種屬特異性； n 沒有組織特異性。 n 2. DNA的一級結(jié)構(gòu) n 指DNA分子中核苷酸排列 的順序。 n 核酸中核苷酸之間是通過3， 5-磷酸二酯鍵連結(jié)。 P P A P C P C P T P G OH C P T P A P A 5 3 pApCpTpGpCpTpApApC-OH 3 5 ACTGCTAAC3 5 O OH O HH H CH2 H O PHOO

12、 P OHHO O O OH O HH H CH2 H O PHOO O OH OH HH H CH2 H O N N N N NH2 NH N N N O NH2 N N NH2 O C A G 5-端 3-端 5 5 5 3 3 3 H H Hp n3. DNA的二級結(jié)構(gòu) n1951年，Rosalind Franklin 得到DNA 分子的X-ray衍射照片，1953年， Watson與Crick解出了DNA的雙螺旋 結(jié)構(gòu)，此為分子生物學(xué)上的大進步。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點 n（1）DNA分子由兩條分子由兩條DNA單鏈組成。單鏈組成。 兩條鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右兩條

13、鏈沿著同一根軸平行盤繞，形成右 手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相手雙螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋中的兩條鏈方向相 反，即其中一條鏈的方向為反，即其中一條鏈的方向為53，而另，而另 一條鏈的方向為一條鏈的方向為35。 n（2）嘌呤堿和）嘌呤堿和 嘧啶堿基位于螺嘧啶堿基位于螺 旋的內(nèi)側(cè)，磷酸旋的內(nèi)側(cè)，磷酸 和脫氧核糖基位和脫氧核糖基位 于螺旋外側(cè)。堿于螺旋外側(cè)。堿 基環(huán)平面與螺旋基環(huán)平面與螺旋 軸垂直，糖基環(huán)軸垂直，糖基環(huán) 平面與堿基環(huán)平平面與堿基環(huán)平 面成面成90角。角。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點 n（3）螺旋橫截）螺旋橫截 面的直徑約為面的直徑約為2 nm，每條鏈相，每條鏈相 鄰兩個堿基平面

14、鄰兩個堿基平面 之間的距離為之間的距離為3.4 nm，每，每10個核苷個核苷 酸形成一個螺旋，酸形成一個螺旋， 其螺矩（即螺旋其螺矩（即螺旋 旋轉(zhuǎn)一圈）高度旋轉(zhuǎn)一圈）高度 為為34 nm。 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點雙螺旋結(jié)構(gòu)的要點 n（4）兩條）兩條DNA鏈通過氫鏈通過氫 鍵相互結(jié)合形成雙螺旋。鍵相互結(jié)合形成雙螺旋。 堿基的相互結(jié)合具有嚴格堿基的相互結(jié)合具有嚴格 的配對規(guī)律，即的配對規(guī)律，即A與與T結(jié)結(jié) 合，合，G與與C結(jié)合，這種配結(jié)合，這種配 對關(guān)系，稱為對關(guān)系，稱為堿基互補堿基互補。 A和和T之間形成兩個氫鍵，之間形成兩個氫鍵， G與與C之間形成三個氫

15、鍵。之間形成三個氫鍵。 n在在DNA分子中，嘌呤堿基分子中，嘌呤堿基 的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù)的總數(shù)與嘧啶堿基的總數(shù) 相等。相等。 DNA雙螺旋的穩(wěn)定性雙螺旋的穩(wěn)定性 nDNA雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理條件下是很穩(wěn)定的。雙螺旋結(jié)構(gòu)在生理條件下是很穩(wěn)定的。 n維持這種穩(wěn)定性的因素包括：維持這種穩(wěn)定性的因素包括： n氫鍵氫鍵：兩條：兩條DNA鏈之間可形成大量的氫鍵；鏈之間可形成大量的氫鍵； n堿基堆積力堿基堆積力：堿基上的芳香環(huán)具有疏水性質(zhì)，堿基：堿基上的芳香環(huán)具有疏水性質(zhì)，堿基 的堆積使堿基之間發(fā)生締合形成了堿基堆積力，芳的堆積使堿基之間發(fā)生締合形成了堿基堆積力，芳 香族堿基的堆積，在香族堿基的堆積，在DN

16、A分子內(nèi)部形成了一個疏水分子內(nèi)部形成了一個疏水 核心，消除了介質(zhì)中水分子對堿基之間氫鍵的影響，核心，消除了介質(zhì)中水分子對堿基之間氫鍵的影響， 有助于氫鍵的形成。有助于氫鍵的形成。 n離子鍵離子鍵：是磷酸殘基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子：是磷酸殘基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子 （如（如Na+、K+和和Mg2+）形成的鍵。從而降低了）形成的鍵。從而降低了DNA 鏈之間因負電荷而產(chǎn)生的的排斥力，增加了鏈之間因負電荷而產(chǎn)生的的排斥力，增加了DNA分分 子的穩(wěn)定性。子的穩(wěn)定性。 n改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。改變介質(zhì)條件和環(huán)境溫度，將影響雙螺旋的穩(wěn)定性。 nDNA雙螺旋的種類 nWatso

17、n-Crick的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是DNA鈉鹽在 相對濕度為92%時的一種狀態(tài)。 nM.Wilkins等將DNA的二級結(jié)構(gòu)分為A、B、C 三種不同類型。 類 型 結(jié)晶狀態(tài)螺距，nm每圈螺旋 堿基對數(shù) 堿基傾角 A B C 75%相對濕度，鈉鹽 92%相對濕度，鈉鹽 66%相對濕度，鋰鹽 2.8 3.4 3.1 11 10 9.3 20 0 6 n左手螺旋DNA n1979年，A.Rich等 從d（GCGCGC） 的X-射線衍射結(jié)果 中發(fā)現(xiàn)，該片段以 左手螺旋存在于晶 體中，提出了左手 螺旋的Z-DNA模型。 A-DNA、B-DNA及Z-DNA的比較 A-DNAB-DNAZ-DNA 外形外形 每圈

18、螺旋堿基對數(shù)每圈螺旋堿基對數(shù) 螺距螺距 螺旋直徑螺旋直徑 堿基傾角堿基傾角 右手，粗短 11 2.8 2.6 19 右手，適中 10 3.4 2 0 左手，細長 12 4.46 1.8 9 與DNA堿基順序相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu) n回文結(jié)構(gòu) n堿基順序顛倒重復(fù)，具有2倍對稱的DNA段落。 n鏡像重復(fù) n顛倒重復(fù)存在與同一條鏈顛倒重復(fù)存在與同一條鏈 nH-DNA nDNA順序具有多嘧啶-多嘌呤的特點， 并具有鏡像重復(fù)。 19531953年初提出了年初提出了DNADNA的三螺旋模型的三螺旋模型 Linus Pauling (1901-94) The titan of twentieth-century c

19、hemistry. Pauling led the way in working out the structure of big biological molecules, and Watson and Crick saw him as their main competitor. In early 1953, working without the benefit of X-ray pictures, he published a paper suggesting that DNA was a triple helix. n4. DNA的三級結(jié)構(gòu) nDNA的三級結(jié)構(gòu)：雙螺旋鏈的扭曲或再次螺

20、旋。 n如：超螺旋結(jié)構(gòu) 線狀DNA形成的超螺旋環(huán)狀DNA形成的超螺旋 真核生物真核生物DNADNA的存在形式的存在形式 真核生物真核生物DNADNA的三級結(jié)構(gòu)是該的三級結(jié)構(gòu)是該DNADNA雙鏈盤繞在組蛋白雙鏈盤繞在組蛋白 上形成的負超螺旋。這種以組蛋白為核心繞以上形成的負超螺旋。這種以組蛋白為核心繞以DNADNA片段片段 的顆粒稱為的顆粒稱為核小體核小體（nucleosomenucleosome）。）。 完整的核小體由兩部分組成，即核小體核心完整的核小體由兩部分組成，即核小體核心 （nucleosome corenucleosome core），以及連接各核心顆粒之間的區(qū)），以及連接各核心顆粒

21、之間的區(qū) 域稱連接區(qū)（域稱連接區(qū)（linkerlinker）。）。 DNADNA雙螺旋雙螺旋核小體核小體串珠狀多核小體細絲串珠狀多核小體細絲 螺線管螺線管超螺線管超螺線管染色單體染色單體 n1. RNA的堿基組成 nRNA中含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和 尿嘧啶四種基本堿基。 n堿基配對：A=U；G=C 4.3.2 4.3.2 RNARNA的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) n 2. RNA的一級結(jié)構(gòu) n RNA分子一級結(jié)構(gòu)： 指各核苷酸鏈中核苷酸 的排列順序。 n 核苷酸間通過3，5- 磷酸二酯鍵連接 n3. RNA的類型 核糖體RNA （ r RNA ） 信使RNA （mRNA ） 轉(zhuǎn)移RNA （t RNA ）

22、含量 80%5%10-15% 功能 和蛋白質(zhì)一起組裝成 核糖體，是細胞內(nèi)蛋白 質(zhì)合成的場所 蛋白質(zhì)合 成的模板 在蛋白質(zhì)生物合 成中起轉(zhuǎn)運氨基酸 到核糖體的作用 4. RNA的高級結(jié)構(gòu) n大多數(shù)天然RNA分子是單鏈的，多數(shù)核苷酸鏈 發(fā)生自身回折，形成雙螺旋區(qū)；不能配對的堿 基形成環(huán)狀突起。這種構(gòu)象就是RNA的二級結(jié) 構(gòu)。 ntRNA的三葉草形二級結(jié)構(gòu) n特征：tRNA分子一般由四臂四環(huán)組成； 氨基酸臂 反密碼臂 二氫尿嘧啶臂 TC臂 反密碼環(huán) 二氫尿嘧啶環(huán)（DHU環(huán)） TC環(huán) 可變環(huán)（額外環(huán)） HNNH O O R 5 1 HN N N N HNCH2 CH2 NO O 7 O R I R D

23、HU N N N N OH R mG H2N CH3 反密碼子 7 對 5 對 4對 5對 ntRNA的三級結(jié)構(gòu) 在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對的堿在三葉草型二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，突環(huán)上未配對的堿 基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的基由于整個分子的扭曲而配成對，目前已知的tRNA 的三級結(jié)構(gòu)均為倒的三級結(jié)構(gòu)均為倒L型型 T C環(huán) DHU環(huán) 反密碼環(huán) nmRNA 的結(jié)構(gòu) 53 m7GpppAAAAn 編編碼碼區(qū)區(qū) AUGU A A 多聚腺苷酸(polyA) 帽子結(jié)構(gòu) 7-甲基鳥嘌呤核苷三磷酸 真核細胞真核細胞mRNA的的3 -末端有一段長達末端有一段長達200個核苷酸左右的個核苷酸左

24、右的 聚腺苷酸聚腺苷酸(polyA)，稱為，稱為 “尾結(jié)構(gòu)尾結(jié)構(gòu)” ，5 -末端有一個甲基末端有一個甲基 化的鳥苷酸，稱化的鳥苷酸，稱“ 帽結(jié)構(gòu)帽結(jié)構(gòu)” 。 真核生物真核生物mRNAmRNA的特殊結(jié)構(gòu)：的特殊結(jié)構(gòu)： 5-5-末端的帽結(jié)構(gòu)：末端的帽結(jié)構(gòu)：m m7 7G-ppp5-Nmp G-ppp5-Nmp 促進核糖體與促進核糖體與mRNAmRNA的結(jié)的結(jié) 合合 加速翻譯的起始速度加速翻譯的起始速度 增強增強mRNAmRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定性 3-3-末端的末端的polyApolyA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu): : 參與參與mRNAmRNA從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移從核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移 增強增強mRNAmRNA的穩(wěn)定性的穩(wěn)定

25、性 真核生物真核生物mRNAmRNA含有內(nèi)含子含有內(nèi)含子: :在核內(nèi)需經(jīng)過一系列的加工、修飾在核內(nèi)需經(jīng)過一系列的加工、修飾 及剪接等去除內(nèi)含子，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓募凹艚拥热コ齼?nèi)含子，轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓膍RNAmRNA，進入胞漿。，進入胞漿。 nrRNA 的二級結(jié)構(gòu) n原核生物核糖體中有三類rRNA ：5S rRNA、16SrRNA和 23SrRNA； n真核生物核糖體中有四類rRNA ：5S rRNA、5.8SrRNA 、 18SrRNA和 28SrRNA； 大腸桿菌16S rRNA 大腸桿菌5S rRNA 真核生物18S rRNA 4.3.3 4.3.3 核酸中核苷酸順序的測定核酸中核苷酸順序的測定 n

26、1.核酸酶（nucleases） n能水解核酸的酶稱為核酸酶。催化在水參與 下磷酸二酯鍵的切斷。 a b ACGTA OH PPPPP 5 end3 end a產(chǎn)生5磷酸末端b產(chǎn)生3磷酸末端 核酸酶底物作用點 外切 核酸酶 蛇毒磷酸二酯酶 牛脾磷酸二酯酶 RNA、DNA RNA、DNA a b 內(nèi)切 核酸酶 RNase A 枯草桿菌Rnase Rnase T1 Rnase T2 Dnase I Dnase II RNA-Py RNA RNA-G RNA DNA DNA b b b b a b n 脫氧核糖核酸酶（DNase） n 核糖核酸酶（Rnase） n 非特異性核酸酶 限制性內(nèi)切酶（re

27、striction endonuclease） n對DNA具有較高的堿基專一性，能使別DNA分 子中特定的堿基順序，并在特定的位置切割。 產(chǎn)生粘性末端 產(chǎn)生平整末端 4.4 4.4 核酸的性質(zhì)核酸的性質(zhì) n1. 性狀和溶解度 nDNA為白色纖維狀固體；RNA為白色粉末； n微溶于水；不溶于有機溶劑； n鈉鹽易溶于水 n2. 粘度 nDNA溶液粘度極大；RNA比DNA粘度小。 n3. 分子大小 n相對分子量都很大，DNA相對分子量的比RNA的大。 n可用紫外分光光度計測定樣品是否純品： n 純DNA: A260/A280 = 1.8 n 純RNA: A260/A280 = 2.0 n核酸含量 n

28、 1A相當(dāng)于50ug/ml雙螺旋DNA n 或40 ug/ml單螺旋DNA（或RNA） n 或20 ug/ml寡核苷酸。 n 4. 吸收光譜 n 核酸在240290nm有 紫外吸收，一般在 260nm左右有最大吸 收。 n摩爾磷吸收系數(shù)E（P）：以每升核酸溶液中 1mol磷為標準，計算核酸的吸收系數(shù)。 E(p) = A CL C = W P E(p) = 30.98A WL n W每升溶液中磷的重量（g） nDNA：E（p）=60008000 n RNA：E（p）=700010000 5. 變性、復(fù)性和雜交 n核酸的變性（denaturation） n引起核酸變性的因素 n溫度升高； n酸、堿

29、、射線； n尿素等變性劑。 n變性后現(xiàn)象 n260nm紫外吸收值升高（增色 效應(yīng)）； n粘度降低； n沉降速度增加； n失去部分或全部生物活性。 n DNA的變性溫度：加熱DNA溶液，使其對260nm 紫外光的吸收度突然增加，達到其最大值一半時 的溫度為DNA的變性溫度（熔解溫度，熔點Tm）。 nDNA的Tm值大小與下列因素有關(guān) n G-C含量 （G+C）% =（Tm-69.3）2.44 nDNA的均一性 n均一性高， Tm較低。 n介質(zhì)中的離子強度 n離子強度較低的介質(zhì)中，DNA的Tm較低。 大腸桿菌DNA在不同濃度KCl中的熔解 n復(fù)性復(fù)性（renaturation renaturatio

30、n ）變性變性DNA在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼在適當(dāng)?shù)臈l件下，兩條彼 此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過此分開的單鏈可以重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過 程稱為復(fù)性。程稱為復(fù)性。 nDNA的復(fù)性主要受以下因素影響： nDNA的復(fù)雜程度：越簡單越容易復(fù)性； nDNA濃度的大?。涸礁咴揭讖?fù)性； nDNA片段的大?。涸叫≡揭讖?fù)性； n溫度：比Tm低25C左右最易復(fù)性，如 超過Tm再迅速冷卻不能復(fù)性，熱變性 DNA緩慢冷卻時才可復(fù)性。 n雜交（hybridization）兩種來源不同具有互補堿基序列的 多核苷酸片斷在溶液中冷卻時可以再形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。 雜交DNA分子DNA/RNA雜交分子 6、

31、沉降 n密度： nRNA雙鏈DNA； n環(huán)狀DNA 開環(huán)、線狀 DNA n單鏈DNA 雙鏈DNA n沉降速度： nRNA 環(huán)狀DNA 開環(huán)、線 狀DNA 4.5 核酸的生物學(xué)功能 n4.5.1 DNA是生物遺傳的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。 DNA DNARNA DNA的復(fù)制方式 半保留復(fù)制 4.5.2 RNA與生物遺傳信息的表達與生物遺傳信息的表達 n首先，首先，DNA通通 過轉(zhuǎn)錄作用，將過轉(zhuǎn)錄作用，將 其所攜帶的遺傳其所攜帶的遺傳 信息（基因）傳信息（基因）傳 遞給遞給 mRNA, 在在 mRNA、tRNA 和和rRNA的共同的共同 作用下，完成蛋作用下，完成蛋 白質(zhì)的合成。白質(zhì)的合成。 中心法則中心法

32、則 n生物的遺傳信息從生物的遺傳信息從 DNA傳遞給傳遞給 mRNA的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù)的過程稱為轉(zhuǎn)錄。根據(jù) mRNA鏈上的遺傳信息合成蛋鏈上的遺傳信息合成蛋 白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和白質(zhì)的過程，被稱為翻譯和 表達。表達。1958年年Crick將生物將生物 遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。遺傳信息的這種傳遞方式稱為中心法則。 DNA RNA蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)錄 反轉(zhuǎn)錄 翻譯 復(fù)制 復(fù)制 nmRNA 是是DNA的轉(zhuǎn)錄本，攜帶有合成蛋的轉(zhuǎn)錄本，攜帶有合成蛋 白質(zhì)的全部信息。蛋白質(zhì)的生物合成實白質(zhì)的全部信息。蛋白質(zhì)的生物合成實 際上是以際上是以mRNA作為模板進行的。作為模板進行的。 遺傳密碼遺傳密碼

33、4.5.3 蛋白質(zhì)的生物合成蛋白質(zhì)的生物合成 4.5.4 遺傳變異的化學(xué)本質(zhì)遺傳變異的化學(xué)本質(zhì) nDNA結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的改變將導(dǎo)致相應(yīng)蛋白質(zhì)一級 結(jié)構(gòu)（氨基酸順序）的變化，從而引起結(jié)構(gòu)（氨基酸順序）的變化，從而引起 生物特征或性狀發(fā)生變異。生物特征或性狀發(fā)生變異。 n所以，一切生物的變異和進化都可以認所以，一切生物的變異和進化都可以認 為是由于為是由于DNA結(jié)構(gòu)的改變而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而引起蛋白質(zhì) 組成和性質(zhì)變化的結(jié)果。組成和性質(zhì)變化的結(jié)果。 DNA結(jié)構(gòu)變化的類型及影響因素結(jié)構(gòu)變化的類型及影響因素 nDNA遺傳密遺傳密 碼的改變主碼的改變主 要有如下幾要有如下幾 種類型

34、：種類型： n 堿基順堿基順 序顛倒，序顛倒， 如如TA被顛被顛 倒成倒成AT； n 某個堿某個堿 基被調(diào)換，基被調(diào)換， 如如AT換換 成成GC； n 少了或多了一對或幾對堿基，少了或多了一對或幾對堿基，例如：例如： n5 ATGGCTATGC 3 變成變成 5 ATGGTATGC 3 3 TACCGATACG 5 3 TACCATACG 5 基因突變基因突變 n由于由于DNA堿基順序的改變引起生物遺傳堿基順序的改變引起生物遺傳 性狀顯著變化的現(xiàn)象，稱為基因性狀顯著變化的現(xiàn)象，稱為基因“突突 變變”。 (1) DNA分子中堿基互變異構(gòu)分子中堿基互變異構(gòu) nDNA分子的堿基，存在酮式分子的堿基，

35、存在酮式烯醇式或烯醇式或 氨式氨式亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異亞胺式互變異構(gòu)。不同的互變異 構(gòu)體形成氫鍵的方向和能力不同，有可構(gòu)體形成氫鍵的方向和能力不同，有可 能導(dǎo)致復(fù)制時出現(xiàn)錯誤。能導(dǎo)致復(fù)制時出現(xiàn)錯誤。 n例如在正常情況下，例如在正常情況下，A（氨式結(jié)構(gòu)）與（氨式結(jié)構(gòu)）與T （酮式結(jié)構(gòu)）配對；當(dāng)（酮式結(jié)構(gòu)）配對；當(dāng)A以亞胺式存在以亞胺式存在 時（幾率非常?。瑒t與時（幾率非常?。?，則與C配對。配對。 (2) 物理因素物理因素 n能夠引起基因突變的物理因素主要包括：能夠引起基因突變的物理因素主要包括： 紫外線（紫外線（UV）、高能射線和電離輻射等。）、高能射線和電離輻射等。 n當(dāng)當(dāng)DNA受到

36、大劑量紫外線（波長受到大劑量紫外線（波長260nm附近）照附近）照 射時，可引起射時，可引起DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價鏈上相鄰的兩個嘧啶堿基共價 聚合，形成二聚體，例如聚合，形成二聚體，例如TT二聚體。二聚體。 光聚合反應(yīng)光聚合反應(yīng) n胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以發(fā)生二聚加成反胸腺嘧啶堿基在紫外光照射下，可以發(fā)生二聚加成反 應(yīng)：應(yīng)： n n在在DNA分子中，如果兩個胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外分子中，如果兩個胸腺嘧啶堿基相鄰，在紫外 光照射下，可能發(fā)生上述聚合反應(yīng)，其結(jié)果是破壞了光照射下，可能發(fā)生上述聚合反應(yīng)，其結(jié)果是破壞了 正常復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。正常復(fù)制或轉(zhuǎn)錄。 N CH3 HN O O R

37、 NH N O O R CH3 NH N O O R CH3 N CH3 HN O O R OH NH N O R CH3 OH UV R O O HN CH3 N H2O (3) 化學(xué)因素化學(xué)因素 n化學(xué)因素是引起化學(xué)因素是引起DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的最結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的最 常見因素，主要包括：常見因素，主要包括： n烷基化試劑烷基化試劑 n亞硝酸鹽亞硝酸鹽 n堿基類似物堿基類似物 烷基化反應(yīng)烷基化反應(yīng) n由于含氧堿基存在酮式和烯醇式的互變由于含氧堿基存在酮式和烯醇式的互變 異構(gòu)，烯醇式中的羥基可以被烷基化轉(zhuǎn)異構(gòu)，烯醇式中的羥基可以被烷基化轉(zhuǎn) 變?yōu)榉€(wěn)定的烯醇醚。變?yōu)榉€(wěn)定的烯醇醚。 n鳥嘌呤核苷烷基化

38、形成鳥嘌呤核苷烷基化形成6-甲氧基鳥嘌呤甲氧基鳥嘌呤 核苷后，不再與核苷后，不再與C配對，而與配對，而與T配對。配對。 n這種情況將引起這種情況將引起DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及信的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及信 息表達出現(xiàn)錯誤。息表達出現(xiàn)錯誤。 環(huán)外氨基的反應(yīng)環(huán)外氨基的反應(yīng) n胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉(zhuǎn)胞嘧啶核苷在亞硝酸作用下，可以形成重氮鹽，再轉(zhuǎn) 變?yōu)槟蜞奏ず塑?。因此生物體內(nèi)亞硝酸的存在有可能變?yōu)槟蜞奏ず塑?。因此生物體內(nèi)亞硝酸的存在有可能 改變改變DNA的堿基組成。的堿基組成。 n腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應(yīng)，分別腺嘌呤核苷和鳥嘌呤核苷也能發(fā)生類似的反應(yīng)，分別 形成次黃嘌呤核苷（形

39、成次黃嘌呤核苷（I）和黃嘌呤核苷（）和黃嘌呤核苷（X）。）。 N N NH2 O R HONO N N N2+ O R H2O N N OH O R HN NO R O n堿基類似物是一類結(jié)構(gòu)與核酸堿基相似堿基類似物是一類結(jié)構(gòu)與核酸堿基相似 的人工合成或天然化合物，由于它們的的人工合成或天然化合物，由于它們的 結(jié)構(gòu)與核酸的堿基相似，當(dāng)這些物質(zhì)進結(jié)構(gòu)與核酸的堿基相似，當(dāng)這些物質(zhì)進 入細胞后能夠摻入到入細胞后能夠摻入到DNA鏈中，干擾鏈中，干擾 DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。 4.6 4.6 核酸的分離、合成和鑒定原理核酸的分離、合成和鑒定原理 n4.6.1 4.6.1 核酸的分離和純化核酸的分離和純化 n提取分離核酸的一般原則： n破碎細胞，提取核蛋白使其與其他細胞成分分離； n用蛋白質(zhì)變性劑或蛋白酶處理除去蛋白質(zhì)； n獲得的核酸溶液用乙醇等使其沉淀。 n4.6.2 4.6.2 合成合成 n酶促合成法 n化學(xué)合成法 4.6.3 4.6.3 鑒定和含量測定鑒定和含量測定 n含量測定 n1、定磷法 nRNA平均含磷量：9.0% nDNA平均含磷量：9.2%