干細(xì)胞與組織工程：Hematopoietic Stem Cell and HSCT

1、Hematopoietic Stem Cell and HSCTHematopoietic Stem Cell (HSC) 主要存在于造血器官的、具有自我更新（self-renewal）和多向分化潛能（multi-differentiation）,能夠分化發(fā)育為各種外周血細(xì)胞的幼稚細(xì)胞。HSC的起源的起源(yolk sac)羊膜囊羊膜囊絨毛絨毛體蒂體蒂上胚層上胚層卵黃囊卵黃囊胚外中胚胚外中胚層層胚外體腔胚外體腔絨毛膜絨毛膜下胚層下胚層卵黃囊卵黃囊(yolk sac) 是位于胚體腹側(cè)包圍在卵黃外的具有豐富血管是位于胚體腹側(cè)包圍在卵黃外的具有豐富血管的膜囊。的膜囊。 鳥類卵黃囊隨胚體的增長及卵黃的

2、消耗而逐漸鳥類卵黃囊隨胚體的增長及卵黃的消耗而逐漸萎縮，最終被吸收，形成小腸的一部分。萎縮，最終被吸收，形成小腸的一部分。 第第5周末人胚胎卵黃囊與原腸斷離，逐漸退化，周末人胚胎卵黃囊與原腸斷離，逐漸退化，至第至第7周成為小于周成為小于5毫米的小囊，殘存于胎盤表毫米的小囊，殘存于胎盤表面。面。 人卵黃囊上的胚外中胚層在第人卵黃囊上的胚外中胚層在第3周形成血島，周形成血島，是胚胎最早形成是胚胎最早形成血管血管和和血細(xì)胞血細(xì)胞的部位的部位 胚胎原始生殖細(xì)胞胚胎原始生殖細(xì)胞最早也出現(xiàn)于卵黃囊壁，最早也出現(xiàn)于卵黃囊壁，骨髓與血竇骨髓與血竇HSC NichesHSC NichesHSC NichesDe

3、velopment of HSC胚胚 胎胎 全全 能能 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 ESC） 造造 血血 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 骨髓骨髓 基基 質(zhì)細(xì)質(zhì)細(xì) 胞胞 成纖維細(xì)胞 脂肪細(xì)胞 巨噬細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 網(wǎng)狀細(xì)胞 外外 胚胚 層層 干干 細(xì)細(xì) 胞胞內(nèi)內(nèi) 胚胚 層層 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 中中 胚胚 層層 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 間間 充充 質(zhì)質(zhì) 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 Mesenchymal Stem Cell ( M S C ) 間間 充充 質(zhì)質(zhì)(祖祖) 細(xì)細(xì) 胞胞 Mesenchymal Cells (MC) SH 2 / 3 / 4 (+) CD 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106

4、, 166 (+) CD 34, 133, 45, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) 成骨細(xì)胞 血管平滑肌細(xì)胞 軟骨細(xì)胞 血管外層細(xì)胞 肌腱細(xì)胞 血管內(nèi)皮細(xì)胞 The differentiation and maturation of HSC HSC HPC Precursor Matured blood cellHSC:主要存在于造血組織中，具備分化主要存在于造血組織中，具備分化 為各種血細(xì)胞潛能的原始細(xì)胞為各種血細(xì)胞潛能的原始細(xì)胞 PHC 造血祖細(xì)胞（造血祖細(xì)胞（ hematopoietic Progenitor Cell (HPC)

5、 precursor cell 造血前體細(xì)胞造血前體細(xì)胞 形態(tài)可辨形態(tài)可辨Development of HSCCharacteristics of HSC 1. Self-renewal (or self-maintenance) Concept dormancy(G0 phase) cell cycle Proliferation Proliferation differentiation 1個(gè)HSC經(jīng)過1719次分裂，可形成170 000720 000個(gè)成熟的血細(xì)胞Characteristics of HSC 1. Self-renewal (or self-maintenance) di

6、fferent HSC has different self-renewal abilities 脾結(jié)節(jié)連續(xù)移植實(shí)驗(yàn) 骨髓連續(xù)移植實(shí)驗(yàn) 體外集落轉(zhuǎn)移分析 Characteristics of HSC2.multiple differentiation Concept About Differentiation multiple differentiationCharacteristics of HSC2.multiple differentiation Characteristics of DifferentiationHSC HPC Precursor,matured blood cells

7、 Multiple limited noneCharacteristics of HSC 3.其他特征 形態(tài)學(xué)上難于辨認(rèn) 高度靜止90% - 99.5%處于G0期 高度不均一，存在“年齡” 結(jié)構(gòu) HPC multipotential haemetopoietic progenitor cell (mHPC) HPC committed haemetopoietic progenitor cell (cHPC)mHPC and cHPC LTC-IC(long-term culture-initiating cell HPP-CFC(high proliferative potential mH

8、PC colony-forming unit) CFU-mix(35 cell lineages) mHPC more than 3 cell lineages limited self-renewal (secondary colony transplantation) mHPC and cHPC BFU-E(burst forming unit-erythrocyte) CFU-E (colony forming unit-erythrocyte) CFU-G(colony forming unit-granulocyte) cHPC CFU-GM(colony forming unit-

9、 granulocyte-macrophage) CFU-Meg(colony forming unit- megakaryocyte) CFU-TL,CFU-BL(T,B-Lymphocyte)mHPC and cHPC Summary Differentiation: multiple cell lineage limited cell lineage single cell lineage . Accordingly, the self-renewal ability would be limited mHPC and cHPC Summary Proliferation: the ea

10、rlier the HPC is, the stronger proliferative ability it has, the bigger its colony would be. Accordingly, the longer the colony can be seen,the fewer the colony number would beDifferences between HSC and HPC HSC: unlimited self-renewal ability HPC: limited self-renewal ability (HSC,G0 phase) HSC HSC

11、 HPC maturedMolecular marks of HSC CD(Cluster of differentiation)（白）細(xì)胞分化白）細(xì)胞分化抗原，在細(xì)胞的不同發(fā)育階段出現(xiàn)抗原，在細(xì)胞的不同發(fā)育階段出現(xiàn) CD34+ HSC CD38- lineage- (lineage specific antigen, 系別抗原，某個(gè)系列細(xì)胞共有的系別抗原，某個(gè)系列細(xì)胞共有的 抗原抗原, 如，粒系為如，粒系為CD11，13， 15， 16； B淋巴系為淋巴系為CD19，20，21， 22；紅系為紅系為CD47，59，71；）人造血干祖細(xì)胞的表型人造血干祖細(xì)胞的表型 (1) 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 祖

12、祖 細(xì)細(xì) 早期早期 胞胞 晚期晚期CD 34 + + + + +Thy-1 + + + C-kit + + +AC-133 + + CD 33 + +CD 38 + +CD 45RO + + + 干干 細(xì)細(xì) 胞胞 祖祖 細(xì)細(xì) 早期早期 胞胞 晚期晚期Lin: + +(G) CD 11, 13, 15, 16 + +(M) CD 12, 14 + +(T/ NK) CD 2, 25, 7, 56, 45RA + +(B) CD 19, 20, 21, 22, 45RB + +(Mk) CD 31, 41, 42, 61, 107 + +HLA-DR + + + 人人 造造 血血 干干 祖祖 細(xì)細(xì)

13、 胞胞 的的 表表 型型 (2)造血干細(xì)胞的檢測造血干細(xì)胞的檢測- 至今尚無與體內(nèi)重建造血法完全吻合的造血干細(xì)胞體至今尚無與體內(nèi)重建造血法完全吻合的造血干細(xì)胞體外檢測法外檢測法 體外用多參數(shù)法：體外用多參數(shù)法：CD34+， 38 ,33，45RO 臨床移植成功后供者標(biāo)志在受者體內(nèi)維持一年以上為臨床移植成功后供者標(biāo)志在受者體內(nèi)維持一年以上為干細(xì)胞植入干細(xì)胞植入 在在NOD-SCID(nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency disease)小小鼠植入，外周血長期出現(xiàn)人類髓系和淋巴系細(xì)胞，證鼠植入，外周血長期出現(xiàn)人類髓系和淋巴系細(xì)胞，證實(shí)

14、為人類干細(xì)胞植入實(shí)為人類干細(xì)胞植入 人綿羊嵌合實(shí)驗(yàn)人綿羊嵌合實(shí)驗(yàn)HCS的檢測方法的檢測方法CFU-S AssayHematopoietic Colonies造血干細(xì)胞移植造血干細(xì)胞移植(HSC Transplantation,HSCT) 將富含造血干細(xì)胞血液輸入經(jīng)特殊將富含造血干細(xì)胞血液輸入經(jīng)特殊處理的受體（患者），以期重新建立受處理的受體（患者），以期重新建立受損的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)或矯正異常造損的造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)或矯正異常造血的過程。血的過程。 hematopoietic reconstitution immunological reconstitutionHSCT的適應(yīng)癥的適應(yīng)癥 血液

15、系統(tǒng)惡性腫瘤血液系統(tǒng)惡性腫瘤 造血衰竭性疾病：造血衰竭性疾?。篈A，MDS等等 非血液系統(tǒng)惡性腫瘤非血液系統(tǒng)惡性腫瘤 其他：放射病，遺傳病，自身免疫性疾病其他：放射病，遺傳病，自身免疫性疾病, 基因治療載體基因治療載體;AIDS?等等 HSCHSC移植分類移植分類一、根據(jù)一、根據(jù)HSCHSC來源分類來源分類1 骨髓移植（BMT） 2 外周血造血干細(xì)胞移植（peripheral blood peripheral blood hematopoietic stem celltransplantationhematopoietic stem celltransplantation，PBHSCTPBHS

16、CT）3 臍帶血造血干細(xì)胞移植（CBHCST）4 CD34細(xì)胞移植（CD34 T）二、根據(jù)供者分類二、根據(jù)供者分類1 同基因同基因(synogeneic) 2 異基因異基因( allogeneic) 3 自體自體 （autologous）HSC移植分類移植分類三、根據(jù)預(yù)處理的方法分類三、根據(jù)預(yù)處理的方法分類1 清除骨髓性干細(xì)胞移植（清除骨髓性干細(xì)胞移植（MSCT） Myeloablative stem cell transplatation2 非清除骨髓性干細(xì)胞移植（非清除骨髓性干細(xì)胞移植（NSCT） Nonmyeloablative stem cell transplatationHSCHS

17、C移植分類移植分類HSCT的基本過程 BMHSC 組織配型：組織配型： ABO血型；血型；HLA 術(shù)前準(zhǔn)備：術(shù)前準(zhǔn)備：健康檢查；遺傳病、傳染病篩查健康檢查；遺傳病、傳染病篩查 自體輸血準(zhǔn)備：自體輸血準(zhǔn)備：備用自體血備用自體血600ml800ml; 麻醉：麻醉：連續(xù)硬膜外麻連續(xù)硬膜外麻 采骨髓：采骨髓：髂前后上棘、胸骨穿刺髂前后上棘、胸骨穿刺 保存液：保存液：肝素肝素+RPMI1640/TC199HSCHSC采集采集HSC采集 PBHSCT1、HSC Mobilization： 正常成人正常成人PBSC占外周血液單個(gè)核細(xì)胞的占外周血液單個(gè)核細(xì)胞的1左右，經(jīng)左右，經(jīng)適當(dāng)動(dòng)員處理可提高至適當(dāng)動(dòng)員處理

18、可提高至10 ;動(dòng)員劑動(dòng)員劑HSCHSC采集采集腫瘤化療藥物：腫瘤化療藥物：如環(huán)磷酰胺、馬利蘭、如環(huán)磷酰胺、馬利蘭、柔紅霉素、阿糖胞苷等柔紅霉素、阿糖胞苷等造血細(xì)胞刺激因子：造血細(xì)胞刺激因子：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6和和SCF等等 HSC Mobilization： 動(dòng)員方法：動(dòng)員方法：于PBSC單采前5d，皮下注射重組細(xì)胞集落刺激因子，如G-CSF2.55.0g/（kg.d）；采集當(dāng)天皮下注射較高劑量重組細(xì)胞集落刺激因子（如G- CSF5g/kg），直至白細(xì)胞總數(shù)達(dá)20109 9/L，血小 板達(dá)20109 9/L后，靜脈推注地塞米松10mg后1-2h 開始單采

19、外周血造血干細(xì)胞一般需單采5-7次，每次均須計(jì)數(shù)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)，測定CD34+ +細(xì)胞百分率 HSCHSC采集采集 HSC Collection: 設(shè)備：設(shè)備：CS-3000plus; MSC+血細(xì)胞分離機(jī)；血細(xì)胞分離機(jī)；抗凝劑：枸櫞酸枸櫞酸鈉葡萄糖（抗凝劑：枸櫞酸枸櫞酸鈉葡萄糖（ACD）采集量：采集量：MNC采集量約采集量約2108/Kg體重，體重，MNC總數(shù)約總數(shù)約121010, 血液總體積血液總體積50100mlHSCHSC采集采集血細(xì)胞分離血細(xì)胞分離HSC保存與運(yùn)輸保存與運(yùn)輸 非冷凍保存非冷凍保存: 1、冷藏保存：、冷藏保存：肝素抗凝肝素抗凝,加適量加適量TC199培培 養(yǎng)液養(yǎng)液,4保存保存, 盡早使用盡早使用,最高期限最高期限7天天; 超過超過3天效果較差。天效果較差。 2、培養(yǎng)保存：、培養(yǎng)保存：假如足夠營養(yǎng)成分，假如足夠營養(yǎng)成分，33 37 孵箱培養(yǎng)保存孵箱培養(yǎng)保存 HSC 成熟度高，生存期短；成熟度高，生存期短； 原始程度越高，存活期越長原始程度越高，存活期越長。 冷凍保存冷凍保存 1、預(yù)處理：、預(yù)處理： 去脂肪：去脂肪：BMHSC靜置或離心去脂肪；靜置或離心去脂肪； 去紅細(xì)胞：去紅細(xì)胞：CS3000，Cobe離心分離；離心分離；羥已基淀粉沉淀羥已基淀粉沉淀RBC，洗滌；，洗滌； 淋巴細(xì)胞分離液離心分離；淋巴細(xì)胞分離液離心分離； 去去T細(xì)胞：細(xì)胞：Mab處