琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制ppt課件

1、LOGO由PowerBar模板組提供琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制 LOGOPage 2n 學習動物的處死與組織勻漿的方法。學習動物的處死與組織勻漿的方法。n 學習離心機的運用方法。學習離心機的運用方法。n 進一步了解酶的競爭抑制原理。進一步了解酶的競爭抑制原理。實驗目的：實驗目的：LOGOPage 3實驗原理：實驗原理：n 競爭性抑制是指分子構造與底物類似的抑制劑可與底物競競爭性抑制是指分子構造與底物類似的抑制劑可與底物競爭性結合酶的活性中心，抑制酶的活力。競爭性抑制劑的爭性結合酶的活性中心，抑制酶的活力。競爭性抑制劑的抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例。抑

2、制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例。n 草酸與琥珀酸的分子構造類似，是琥珀酸脫氫酶的競爭草酸與琥珀酸的分子構造類似，是琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。性抑制劑。琥珀酸脫氫酶催化琥珀酸脫氫生成延胡索酸。在體內，琥珀酸脫下的在體內，琥珀酸脫下的2H 經電子傳送鏈傳送，最后與氧經電子傳送鏈傳送，最后與氧結合生成水，并釋放出能量。在體外那么可用甲烯藍藍結合生成水，并釋放出能量。在體外那么可用甲烯藍藍色作為受氫體，甲烯藍接受琥珀酸脫下的色作為受氫體，甲烯藍接受琥珀酸脫下的2H 而被復原而被復原為甲烯白無色。在甲烯蘭含量一定的條件下，藍色衰為甲烯白無色。在

3、甲烯蘭含量一定的條件下，藍色衰退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活力，因此，可根據退的快慢程度可指示琥珀酸脫氫酶的活力，因此，可根據藍色衰退時間來判別該酶活力被抑制的程度。藍色衰退時間來判別該酶活力被抑制的程度。LOGOPage 4二、實驗原理 抑制劑和底物的構造類似，可與底物競抑制劑和底物的構造類似，可與底物競爭酶的活性中心，妨礙酶爭酶的活性中心，妨礙酶-底物復合物的構底物復合物的構成。成。抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力以及抑抑制程度取決于抑制劑與酶的相對親和力以及抑制劑與底物濃度的相對比例制劑與底物濃度的相對比例I/SI/SLOGOPage 5HOOCCH2CH2COOHHOOCCH=

4、CHCOOHFADFADH2MBH2MBH2甲烯白無色甲烯白無色MB甲烯藍藍色甲烯藍藍色在無氧條件下，以甲烯藍褪色時間來判別琥珀酸脫氫在無氧條件下，以甲烯藍褪色時間來判別琥珀酸脫氫酶活性的改動。酶活性的改動。草酸草酸HOOCCOOHHOOCCOOHn 琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶LOGOPage 6實驗器材與試劑實驗器材與試劑: 一試劑一試劑pH=7.4的磷酸緩沖液的磷酸緩沖液0.25%琥珀酸鈉溶液琥珀酸鈉溶液0.5%草酸鈉溶液草酸鈉溶液0.01%甲烯藍溶液甲烯藍溶液生理鹽水生理鹽水液體石蠟液體石蠟LOGOPage 7實驗器材與試劑：實驗器材與試劑：二器材二器材研缽研缽.手術剪手術剪.手術鑷子手術

5、鑷子2mL移液管移液管1000 uL微量可調儀器微量可調儀器10mL離心管離心管低速離心機低速離心機LOGOPage 8實驗操作：實驗操作：n (1)肝糜液的制備肝糜液的制備n 用頸椎脫臼法處死小白鼠用頸椎脫臼法處死小白鼠n 將肝臟取出置于研缽，用生理鹽水洗凈，剪碎肝臟充將肝臟取出置于研缽，用生理鹽水洗凈，剪碎肝臟充分研磨至糊狀分研磨至糊狀n 分批參與磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共分批參與磷酸緩沖液，邊加邊磨，總共7mln 攪勻后倒入圓底離心管，離心攪勻后倒入圓底離心管，離心3分鐘分鐘n 將上清液倒入一支試管中備用，即為含有琥珀酸脫氫將上清液倒入一支試管中備用，即為含有琥珀酸脫氫酶的肝糜液酶的肝糜

6、液LOGOPage 9實驗操作：實驗操作：另取中試管另取中試管5支，標號支，標號 琥珀酸脫氫酶活力的測定琥珀酸脫氫酶活力的測定編號編號123450.25%琥珀酸鈉溶液/ml0.500.502.000.500.5%草酸鈉溶液/ml0.500.500.502.00蒸餾水/ml2.002.001.50肝糜液/ml1.001.001.001.001.0甲烯藍/ml0.200.200.200.200.20搖勻，靜置于搖勻，靜置于3737攝氏度的水浴中以后再勿搖動留意察看各管的顏色變化，記攝氏度的水浴中以后再勿搖動留意察看各管的顏色變化，記錄各管顏色衰退的順序和時間，分析緣由，振蕩褪色的反響液，察看實驗景

7、象并錄各管顏色衰退的順序和時間，分析緣由，振蕩褪色的反響液，察看實驗景象并分析產生該景象的緣由。分析產生該景象的緣由。LOGOPage 10n 1肝臟一定要充分研磨至糊狀，一使琥珀酸脫氫肝臟一定要充分研磨至糊狀，一使琥珀酸脫氫酶盡量釋放到溶液里酶盡量釋放到溶液里n 2離心時留意離心管一定要準確平衡，并將重要離心時留意離心管一定要準確平衡，并將重要相等的離心管對稱放置相等的離心管對稱放置n 3離心終了后拿取離心管時動作要輕柔，不要振離心終了后拿取離心管時動作要輕柔，不要振蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁蕩離心管，以免肝糜液重新變渾濁本卷須知：本卷須知：LOGOPage 11思索題：思索題：n 1:

8、為什么反響開場后，反響液必需靜止，不能在為什么反響開場后，反響液必需靜止，不能在搖動搖動?n 防止空氣中的氧接觸反響溶液，使的復原性的甲防止空氣中的氧接觸反響溶液，使的復原性的甲烯白重新氧化成甲烯藍烯白重新氧化成甲烯藍LOGOPage 12思索題：思索題：n 2:本實驗為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶？本本實驗為何選擇肝臟來提取琥珀酸脫氫酶？本實驗勝利的關鍵是什么？實驗勝利的關鍵是什么？LOGOPage 13思索題：思索題：n 3：抑制劑還可以選用什么物質？：抑制劑還可以選用什么物質？n 還可以選用丙二酸還可以選用丙二酸n 4：利用本實驗的數據，闡明酶競爭性抑制的特點：利用本實驗的數據，闡明酶競

9、爭性抑制的特點？n 競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產物競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產物；b.抑制劑與酶的結合部位與底物與酶的結合部抑制劑與酶的結合部位與底物與酶的結合部位一樣；位一樣；c.抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減小；但添加底物濃度可使抑制程度減??；d.動力學動力學參數：參數：Km值增大，值增大，Vm值不變。值不變。LOGOPage 14思索題：思索題：n 5：本實驗在設計上存在某些缺陷，指出存在的缺：本實驗在設計上存在某些缺陷，指出存在的缺陷與改良方案？陷與改良方案？LOGOPage 15補充：補充：n 琥

10、珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶Succinatedehydrogenase，簡，簡稱稱SDH，黃素酶類，是線粒體內膜的結合酶，黃素酶類，是線粒體內膜的結合酶，屬膜結合酶，是銜接氧化磷酸化與電子傳送的樞屬膜結合酶，是銜接氧化磷酸化與電子傳送的樞紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需紐之一，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標氧和產能的呼吸鏈提供電子，為線粒體的一種標志酶。志酶。n 琥珀酸脫氫酶有兩種，一種是以泛醌作為受琥珀酸脫氫酶有兩種，一種是以泛醌作為受體的，另一種是作用于一切受體。體的，另一種是作用于一切受體。 LOGOPage 16n琥珀酸脫氫酶活力測定

11、方法目前主要有五種琥珀酸脫氫酶活力測定方法目前主要有五種 n1.硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯吩嗪PMS反響法反響法 n2.鐵氰化鉀鐵氰化鉀K3FeCN6復原法復原法 n3.TTC氯化三苯四氮唑法氯化三苯四氮唑法 n4.MTT法法 n5.NBT氯化硝基四氮唑藍法氯化硝基四氮唑藍法 LOGOPage 17n 1.硫酸甲酯吩嗪硫酸甲酯吩嗪PMS反響法反響法n 琥珀酸脫氫酶能經過一系列人工電子受體，如與琥珀酸脫氫酶能經過一系列人工電子受體，如與PMS吩嗪吩嗪二甲酯硫酸鹽，二甲酯硫酸鹽，DCPIP2，6-二氯酚靛酚等發(fā)生反響催二氯酚靛酚等發(fā)生反響催化琥珀酸的氧化，而借助這些中間產物的顏色變化，經過分光化琥珀酸的

12、氧化，而借助這些中間產物的顏色變化，經過分光光度計檢測即可加以定量反映，其反響式為：光度計檢測即可加以定量反映，其反響式為：SuccinatePMSFumaratePMSH2；PMSH2DCPIPPMSDCPIPH2。DCPIP呈藍色，規(guī)范的吸收光譜在呈藍色，規(guī)范的吸收光譜在600nm處，這處，這種色澤可因其復原而漸次變淡，從而種色澤可因其復原而漸次變淡，從而600nm處的光密度的變處的光密度的變化與化與DCPIP含量成正比，測定含量成正比，測定2.6-DPIP的復原速度可以推算出的復原速度可以推算出SDH的活力。一分子的活力。一分子DCPIP被復原，即代表一分子琥珀酸被被復原，即代表一分子琥

13、珀酸被氧化。故可測定此反響系統(tǒng)在氧化。故可測定此反響系統(tǒng)在600nm處的吸收光度變化，來處的吸收光度變化，來計算計算SDH的活性。的活性。SDH活性計算：規(guī)范測定活性計算：規(guī)范測定/規(guī)范規(guī)范=mol/min/mg。 LOGOPage 18n 2.鐵氰化鉀鐵氰化鉀K3FeCN6復原法復原法 n 以鐵氰化鉀以鐵氰化鉀K3FeCN6和琥珀酸鈉為底和琥珀酸鈉為底物，使琥珀酸脫氫酶催化反響將鐵氰化鉀復原為物，使琥珀酸脫氫酶催化反響將鐵氰化鉀復原為亞鐵氰化鉀亞鐵氰化鉀K4FeCN6，K4FeCN6再與再與Fe3作用生成普魯士藍，在作用生成普魯士藍，在700nm波長測定吸波長測定吸光值，以檢測普魯士藍之生成

14、量，作為琥珀酸脫光值，以檢測普魯士藍之生成量，作為琥珀酸脫氫酶的復原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活氫酶的復原力，吸光值愈高表示琥珀酸脫氫酶活力愈強。力愈強。 LOGOPage 19n 3.TTC氯化三苯四氮唑法氯化三苯四氮唑法 n 無色無色TTC2，3，5-氯化三苯基四唑作為氯化三苯基四唑作為人造受氫體，它在細胞呼吸過程中接受氫，復原人造受氫體，它在細胞呼吸過程中接受氫，復原成三苯基甲膳成三苯基甲膳TF。后者以紅色晶體的方式存。后者以紅色晶體的方式存在于細胞內，采用有機溶劑如甲苯、乙酸乙醋在于細胞內，采用有機溶劑如甲苯、乙酸乙醋、三氯甲烷、丙酮或乙醇等進展萃取。萃取液、三氯甲烷、丙酮或乙醇等

15、進展萃取。萃取液測定測定485nm吸光度后，以吸光度后，以TTC復原量表示脫氫酶復原量表示脫氫酶活性，根據規(guī)范曲線計算活性，根據規(guī)范曲線計算TF生成量，進而求出生成量，進而求出TTC-脫氫酶活性脫氫酶活性 LOGOPage 20n 4.MTT法法 n MTT是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中是一種黃顏色的染料?；罴毎€粒體中琥珀酸脫氫酶可以代謝復原琥珀酸脫氫酶可以代謝復原MTT，同時在細胞色，同時在細胞色素素C的作用下生成藍色或藍紫色不溶于水的的作用下生成藍色或藍紫色不溶于水的甲臜甲臜Formazana，經異丙醇作用顆粒溶解顯，經異丙醇作用顆粒溶解顯色。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數成正色

16、。在通常情況下，甲臜生成量與活細胞數成正比，因此可根據光密度比，因此可根據光密度570nm處處OD值推測出活值推測出活細胞的數目。細胞的數目。 LOGOPage 21n 5.NBT氯化硝基四氮唑藍法氯化硝基四氮唑藍法 n NBT易溶于水，呈淡黃色，以易溶于水，呈淡黃色，以NBT為受氫體為受氫體，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進而，接受由琥珀酸鈉鹽被酶作用而脫下的氫，進而構成紫藍色的沉淀，于反響體系中參與構成紫藍色的沉淀，于反響體系中參與PMS，混，混勻，勻，37保溫保溫30min，之后參與，之后參與TCA終止反響。終止反響。加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于加異丙醇溶解顯色，混勻，即可于54

17、8nm測測OD值。規(guī)定：值。規(guī)定：30min內內548nm下下OD值為值為1.0時的酶時的酶量為量為1個活力單位。比活力個活力單位。比活力=活力單位數活力單位數/毫克蛋白毫克蛋白。LOGOPage 22競爭性抑制的機理競爭性抑制的機理 n 競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產競爭性抑制劑往往是酶的底物類似物或反響產物；物；n 抑制劑與酶的結合部位活性中心與底物與抑制劑與酶的結合部位活性中心與底物與酶的結合部位一樣；酶的結合部位一樣；n 抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大；但添加抑制劑濃度越大，那么抑制造用越大；但添加底物濃度可使抑制程度減??；底物濃度可使抑制程度減?。籲 動力學參數：動力學參數：Km值增大，值增大，Vm值不變。抑制程值不變。抑制程度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比度取決于抑制劑與酶的親和力及與底物的相對比例例n 留意：結合在酶的同一部位以及構造類似并留意：結合在酶的同一部位以及構造類似并不是競爭性抑制的必要條件，抑制劑結合的部位不是競爭性抑制的必要條件，抑制劑結合的部位妨礙底物和酶的結合，即產生空間位阻也可以呵妨礙底物和酶的結合，即產生空間位阻也可以呵斥競爭性抑制。斥競爭性抑制。 LOGOPage 23琥珀酸脫氫酶琥珀酸脫氫酶n 琥珀酸脫氫酶是獨一嵌入到線粒體內膜的酶，是琥珀酸脫氫酶是獨一嵌入到線粒體內膜的酶，是線粒體內膜的一個重要部分，其它酶