激光共聚焦顯微鏡原理和操作

1、激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 樣品要求樣品要求 原理原理 功能功能 在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)人眼分辨率：人眼分辨率：0.2mm光學(xué)顯微鏡分辨率：光學(xué)顯微鏡分辨率：0.25m25mm電子顯微鏡分辨率：電子顯微鏡分辨率：0.2nm共焦顯微鏡分辨率：共焦顯微鏡分辨率：0.18m mm 二、二、 原理原理激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微

2、鏡技術(shù)原理小結(jié)原理小結(jié):Confocal 利用放置在光源后的利用放置在光源后的照明針孔照明針孔和放置在檢測和放置在檢測器前的器前的探測針孔探測針孔實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)點(diǎn)點(diǎn)照明照明和和點(diǎn)點(diǎn)探測探測，來自光源的光通過照，來自光源的光通過照明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)明針孔發(fā)射出的光聚焦在樣品焦平面的某個(gè)點(diǎn)上，該點(diǎn)所發(fā)射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探射的熒光成像在探測針孔上，該點(diǎn)以外的任何發(fā)射光均被探測針孔阻擋。測針孔阻擋。照明針孔照明針孔與與探測針孔探測針孔對對被照射點(diǎn)被照射點(diǎn)或或被探測點(diǎn)被探測點(diǎn)來來說是說是共軛共軛的，因此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面的，因

3、此被探測點(diǎn)即共焦點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)即共焦平面。計(jì)算機(jī)以像點(diǎn)的方式將被探測點(diǎn)顯示在計(jì)算機(jī)屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像共焦圖像。只要載。只要載物臺沿著物臺沿著Z軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平軸上下移動(dòng)，將樣品新的一個(gè)層面移動(dòng)到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移軸的不斷移動(dòng)，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像動(dòng)，就可

4、得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像 。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別2. 具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片具有更高的軸向分辨率，并可獲取連續(xù)光學(xué)切片conventionalconfocal激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯

5、微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別3. 增加側(cè)向分辨率增加側(cè)向分辨率d2alconventionconfocaldd激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)別區(qū)別4. 由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響由于點(diǎn)對點(diǎn)掃描去除了雜散光的影響激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)三三. 激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn)激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計(jì)特點(diǎn):1.點(diǎn)照明點(diǎn)照明2.具有照明具有照明pinhole和探測和探測pinhole3.照明照明pinhole和探測和探測pinhole共軛共軛(共焦共焦), 共焦點(diǎn)即共焦點(diǎn)即被

6、探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面被探測點(diǎn)，被探測點(diǎn)所在的平面為共焦平面4.具有掃描系統(tǒng)具有掃描系統(tǒng) 逐點(diǎn)掃描成像逐點(diǎn)掃描成像 5.具有多個(gè)（四個(gè)）具有多個(gè)（四個(gè)） 熒光通道，可同時(shí)探測多個(gè)熒光通道，可同時(shí)探測多個(gè)被標(biāo)記物被標(biāo)記物 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù) 技術(shù)指標(biāo)（技術(shù)指標(biāo)（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x 傳統(tǒng)顯微鏡傳統(tǒng)顯微鏡: Rxy=0.61 /NA （0.25 m mm ) Confocal: Rxy=0.4 /NA（0.18 m mm )2. 樣品的最大厚度樣品的最大厚度: 取決于取決于: 物鏡的物鏡

7、的NA、物鏡的、物鏡的工作距離工作距離 激光的穿透力、樣品的透明度激光的穿透力、樣品的透明度 Z軸的最大移動(dòng)范圍軸的最大移動(dòng)范圍(166m mm、Z-wide)3. 樣品的最小光切厚度樣品的最小光切厚度: (載物臺最小移動(dòng)距離為載物臺最小移動(dòng)距離為40nm） 取決于取決于: 物鏡的物鏡的NA、針孔大小、針孔大小 Z軸的最小移動(dòng)步距軸的最小移動(dòng)步距: 40nm Z軸的分辨率軸的分辨率: 0.35 m mm 激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)4. 激光器激光器 Ar激光器激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm

8、Ar激光器激光器(UV): 361nm 激光器的特點(diǎn)激光器的特點(diǎn): 1) 方向性好方向性好: 激光基本延直線傳播激光基本延直線傳播 2) 單色性好單色性好 :=10-8nm 3) 高亮度高亮度: 激光方向性好激光方向性好, 其在空間上的能量分布是高度其在空間上的能量分布是高度 集中的。集中的。 4) 偏振性偏振性: 激光為平面偏振光激光為平面偏振光, 光纖耦合光纖耦合激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)5. 四個(gè)熒光通道四個(gè)熒光通道, 一個(gè)透射光通道一個(gè)透射光通道 即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外即除了可同時(shí)采集多標(biāo)記熒光圖像外還可以同時(shí)采集透射光圖像還可以同時(shí)采集透射光圖像,但透射光

9、但透射光圖像為圖像為非共焦圖像非共焦圖像。激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)6.掃描速度掃描速度: slow 220lines/s 512 512 2-3秒秒 slow2 440lines/s（2：雙向掃描）：雙向掃描） medium 450lines/s 512 512 1.7秒秒 medium2 900lines/s fast 1000lines/s 512 512 0.7秒秒 128 128 0.2秒秒 fast2 2000lines/s7. 掃描密度掃描密度: 64 64 128 128 512 512 1024 1024 2048 2048 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯

10、微鏡技術(shù)的應(yīng)用技術(shù)的應(yīng)用The application of Confocal Laser Scanning Microscopy激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 功能功能.1.多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集多熒光標(biāo)記樣品的高清晰度、高分辨率圖像采集2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”3.真正的三維重組真正的三維重組4.假三維圖的顯示假三維圖的顯示5.可沿可沿Z軸（軸（xy平面）和平面）和Y軸（軸（xz平面）方向進(jìn)行光切平面）方向進(jìn)行光切6.定量分析定量分析7.時(shí)間序列掃描時(shí)間序列掃描: xyt 、xyzt 和和 xt 掃描掃描8.圖像處理圖

11、像處理9. 旋轉(zhuǎn)掃描旋轉(zhuǎn)掃描10.感興趣區(qū)域掃描感興趣區(qū)域掃描11.光譜掃描光譜掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用應(yīng)用應(yīng)用 定位、定量定位、定量 三維重組三維重組 動(dòng)態(tài)測量動(dòng)態(tài)測量 活細(xì)胞或組織內(nèi)游離活細(xì)胞或組織內(nèi)游離Ca2+分布和濃度的變化分布和濃度的變化 測量測量 (Mg2+ 、Zn+ 、Na+ 、K+) 自由基的檢測自由基的檢測 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程、定位分布及定量 蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 活細(xì)胞內(nèi)活細(xì)胞內(nèi)H+濃度（濃度（ pH值值）的測量）的測量 線粒體線粒體膜電位膜電位的測量的測量

12、熒光漂白恢復(fù)（熒光漂白恢復(fù)（FRAP）的測量）的測量 籠鎖解籠鎖的測量籠鎖解籠鎖的測量 熒光能量共振轉(zhuǎn)移（熒光能量共振轉(zhuǎn)移（FRET）的測量）的測量 其他應(yīng)用其他應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用一、定位、定量一、定位、定量 免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三免疫熒光標(biāo)記（單標(biāo)、雙標(biāo)或三 標(biāo)）的定位、標(biāo)）的定位、定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布，定量：如：細(xì)胞膜受體或抗原的分布， 微絲、微管的分布、微絲、微管的分布、 兩種或三種蛋兩種或三種蛋 白的白的共存共存與與共定位共定位、蛋白與細(xì)胞器的、蛋白與細(xì)胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細(xì)胞的 增值、分化增

13、值、分化 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI 末端原位雜交末端原位雜交-fitc + PI 熒光原位雜交：熒光原位雜交： 染色體基因定位染色體基因定位 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 定位、定量研究中常用熒光探針定位、定量研究中常用熒光探針1.Amine-Reactive Probes 與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標(biāo)記等 Green Red Fura-red FITC 494/5

14、18 TRITC 544/572 Cy5 650/690 (異硫氰基熒光素異硫氰基熒光素) (四甲基異硫氰基羅丹明四甲基異硫氰基羅丹明)Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578 (藻紅蛋白藻紅蛋白) Texas Red 595/615 (德州紅德州紅) Cy3 558/568BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR 592/618激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用1)細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白細(xì)胞表面抗原、胞內(nèi)某種蛋白 免役熒光標(biāo)記：免役熒光標(biāo)記： 與抗體耦聯(lián)與抗體耦聯(lián), 直標(biāo)直標(biāo): 一抗一抗+熒光探針熒

15、光探針 間標(biāo)間標(biāo): 二抗二抗+熒光探針熒光探針 如如: 微管蛋白微管蛋白tublin ( 抗抗 tublin抗體抗體+熒光探針熒光探針) 肌動(dòng)蛋白肌動(dòng)蛋白actin ( Palloidine+熒光探針熒光探針)2)細(xì)胞膜表面受體細(xì)胞膜表面受體配體配體+熒光探針熒光探針 如如: nAchR、mAchR、多巴胺受體、多巴胺受體(D1,D2) 標(biāo)記標(biāo)記 Gm1: 霍亂毒素受體霍亂毒素受體 霍亂毒素霍亂毒素+FITC 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2.標(biāo)記標(biāo)記細(xì)胞器細(xì)胞器熒光探針熒光探針1)線粒體線粒體 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活細(xì)胞，陽離

16、子，可染活細(xì)胞，陽離子, 可檢可檢 測線粒體膜電位測線粒體膜電位, 且在多數(shù)細(xì)胞中停留且在多數(shù)細(xì)胞中停留 時(shí)間短時(shí)間短 JC1 線粒體膜電位低時(shí)為單體線粒體膜電位低時(shí)為單體 490/527 發(fā)綠光發(fā)綠光 線粒體膜電位高時(shí)為多聚體線粒體膜電位高時(shí)為多聚體 490/590 發(fā)紅光發(fā)紅光 可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最可標(biāo)記活細(xì)胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最 佳探針佳探針Mitotracker Green FM 490/516, 染活細(xì)胞或固定細(xì)胞染活細(xì)胞或固定細(xì)胞 , 穩(wěn)定不漏出穩(wěn)定不漏出Mitotracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型氧化型)Mito

17、tracker Orange 還原型還原型, 只能染活細(xì)胞只能染活細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用2)溶酶體溶酶體 Lysosome 中性紅中性紅 541/640: 微偏堿性微偏堿性, 可標(biāo)記溶酶體等酸性器官可標(biāo)記溶酶體等酸性器官 為非特異性為非特異性 AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活細(xì)胞染活細(xì)胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特異性非特異性, 較較高高濃度標(biāo)記濃度標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 較較低低濃度標(biāo)記

18、濃度標(biāo)記線粒體線粒體4)高爾基體高爾基體 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死細(xì)胞可染活或死細(xì)胞 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞器的單克隆抗體細(xì)胞器的單克隆抗體5)細(xì)胞核細(xì)胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細(xì)胞死細(xì)胞碘化丙啶碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細(xì)胞死細(xì)胞Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞活細(xì)胞Hochest 33258 352/461 DNA A-T 活細(xì)胞活細(xì)胞DAPI 358/4

19、61 DNA A-T 半通透細(xì)胞半通透細(xì)胞Chromomycin A3 450/470 DNA G-CAO 500/526 DNA 活細(xì)胞活細(xì)胞 560/650 RNATOTO-1 514/533 DNA 死細(xì)胞死細(xì)胞SYTO1116 2024 488/ 520 活細(xì)胞活細(xì)胞SYTO1116 2024 521/ 556 活細(xì)胞活細(xì)胞SYTO 17 621/634 活細(xì)胞活細(xì)胞3. GFP 綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白GFP的的發(fā)現(xiàn)：的的發(fā)現(xiàn)：60年代，年代，Shimomura等首先從水母中分離出一等首先從水母中分離出一種種水母發(fā)光蛋白水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)，

20、該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)生藍(lán)色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證實(shí)在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白綠色熒光蛋白 GFP, 后后經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)經(jīng)研究表明，在水母體內(nèi)CaCa2+2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍(lán)色熒光，GFPGFP在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色在藍(lán)光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光熒光 。 將外源基因與將外源基因與GFP DNA 相連相連, GFP可作為外源基因的報(bào)告基可作為外源基因的報(bào)告基因?qū)崟r(shí)監(jiān)

21、測外源基因的表達(dá)因?qū)崟r(shí)監(jiān)測外源基因的表達(dá).激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用GFP主要應(yīng)用主要應(yīng)用: 對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察對活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)觀察 可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中可實(shí)時(shí)原位跟蹤特定蛋白在細(xì)胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá)或外界刺激因子的作用下的時(shí)空表達(dá), 如某種轉(zhuǎn)錄因子的如某種轉(zhuǎn)錄因子的核核轉(zhuǎn)位轉(zhuǎn)位、蛋白激酶、蛋白激酶C的的膜轉(zhuǎn)位膜轉(zhuǎn)位等。等。 GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 可動(dòng)態(tài)觀察可動(dòng)態(tài)觀察 該分泌

22、蛋白分泌到細(xì)胞外的過程該分泌蛋白分泌到細(xì)胞外的過程 GFP基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連基因與定位于某一細(xì)胞器特殊蛋白基因相連,就能顯就能顯 示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器示活細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)及病理過程的結(jié)構(gòu)及病理過程 可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)（可用于觀察分子的運(yùn)動(dòng)（FRAP） 蛋白之間的相互作用（蛋白之間的相互作用（FRET）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用三三.動(dòng)態(tài)測量動(dòng)態(tài)測量Physiology:細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測量細(xì)胞內(nèi)離子動(dòng)態(tài)變化測量1).游離游離Ca2+測量測量 檢測游離檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這

23、類探針多為變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯結(jié)合時(shí)不發(fā)熒光，通常也不能進(jìn)入細(xì)胞膜，只有與乙酰甲酯AM相相連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒連方可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，被細(xì)胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。光。Kd值為值為Ca2+解離常數(shù)，表明檢測解離常數(shù)，表明檢測Ca2+濃度的范圍濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd, Kd和很多因素有關(guān)，如和很多因素有關(guān)，如pH、 Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值濃度值(10-100

24、n M)，細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的濃度的1010倍倍左右）左右） 熒光探針熒光探針 激發(fā)波長激發(fā)波長發(fā)射波長發(fā)射波長 KdFLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nMFluo4 506nm 525nmCalcium Green-1 507nm 530nm 190nMCalcium Green-2 507nm 535nm 550nMFura red 420/480nm 637nm 140nMOregon Green 488 494nm520nm 20,000nMCalcium Crimson 583nm 602nm 3

25、28nMIndo-1 356nm 405/458nm 230nMFura-2 340/380 476nm 145nM激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用程序化測量：用程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測中的編程按鈕可進(jìn)行不同時(shí)間序列的掃描測 量。量。 F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)Ca2+濃度絕對測量濃度絕對測量1）單波長公式法）單波長公式法Fluo3: 530nm Kd=450nMCa2+I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)Fmin: 細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度細(xì)胞內(nèi)無鈣時(shí)的熒光強(qiáng)度( MnCl2)Fmax：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒

26、光強(qiáng)度：細(xì)胞內(nèi)鈣飽和時(shí)的熒光強(qiáng)度(A23187)測量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息測量時(shí)切記細(xì)胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低（濃度的相對熒光強(qiáng)度值不能太低（F值值不低于不低于40）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用細(xì)胞內(nèi)生理細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的濃度的1010倍左右）倍左右）2 2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法）標(biāo)準(zhǔn)曲線法根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同根據(jù)儀器條件和負(fù)載條件，以不同CaCa2+2+濃度的濃度的Buffer(EGTA- Buffer(EGTA- CaCa2+2+) )做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為

27、做標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫軸為CaCa2+2+濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度濃度，縱軸為熒光強(qiáng)度3 3）比例熒光的測量）比例熒光的測量.雙波長雙波長(比例熒光：比例熒光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)Ca2+I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用快速快速Ca2+變化的測量變化的測量1.改變掃描速度改變掃描速度2.采用雙向掃描采用雙向掃描3.減少采樣點(diǎn)數(shù)減少采樣點(diǎn)數(shù)(犧牲空間分辨率）犧牲空間分辨率）4.采用線掃描采用線掃描(xt)細(xì)胞器的細(xì)胞器的C

28、a2+測量測量1.線粒體內(nèi)游離線粒體內(nèi)游離Ca2+測量測量 Fluo-3 + TMRM(線粒體熒光探針，紅色）線粒體熒光探針，紅色）2. 特異定位的重組水母發(fā)光蛋白特異定位的重組水母發(fā)光蛋白 水母發(fā)光蛋白與水母發(fā)光蛋白與 Ca2+結(jié)合后發(fā)藍(lán)光結(jié)合后發(fā)藍(lán)光 用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體用含有水母發(fā)光蛋白和含有特定細(xì)胞器蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離轉(zhuǎn)染細(xì)胞，可測定亞細(xì)胞器內(nèi)的游離Ca2+變化變化 目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核目前已商品化的探針可檢測：線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核內(nèi)的游離內(nèi)的游離Ca2+，因生物發(fā)光很弱不能使用，因生物發(fā)光很弱不能使

29、用Confocal檢測檢測 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 細(xì)胞內(nèi)游離細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+測量的應(yīng)用測量的應(yīng)用l鈣的特性鈣的特性1細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度細(xì)胞內(nèi)外的電化學(xué)梯度10103 3-10-104 4倍倍2 2細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性稍有改變或鈣庫釋放稍有增加，導(dǎo)致 胞內(nèi)鈣明顯升高胞內(nèi)鈣明顯升高3 3細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活細(xì)胞內(nèi)鈣為細(xì)胞激活“開關(guān)開關(guān)”l細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用細(xì)胞內(nèi)鈣的生理作用1肌肉的興奮收縮肌肉的興奮收縮-收縮偶聯(lián)收縮偶聯(lián)2神經(jīng)遞質(zhì)的釋放神經(jīng)遞質(zhì)的釋放3學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶的增強(qiáng)4卵子受精卵子受精5細(xì)胞分裂和再生細(xì)胞分裂和再生6細(xì)胞調(diào)亡

30、細(xì)胞調(diào)亡7細(xì)胞間通訊細(xì)胞間通訊激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用8細(xì)胞信號傳導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)9. DNA合成合成10. 基因表達(dá)基因表達(dá)l細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病細(xì)胞內(nèi)鈣超載與疾病1高血壓、腦缺血、心臟病、內(nèi)分泌病胞內(nèi)鈣濃度異常2糖尿病、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化病胞內(nèi)鈣濃度增高3人體缺鈣骨鈣大量丟失，神經(jīng)細(xì)胞的鈣濃度增高4老化和老年性癡呆-神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度增高 細(xì)胞內(nèi)生理Ca2+濃度值（10-8 -10-7 M）細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載濃度值（基礎(chǔ)Ca2+濃度的10倍左右）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用電刺激引起骨骼肌 細(xì)胞的Ca2+振蕩激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激

31、光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 pH值的檢測：值的檢測： BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-1-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0自由基的檢測自由基的檢測熒光探針：熒光探針：H H2 2DCF-DA（504nm/529nm）2-2-氫，氫，2 2氯熒光素乙酰乙酸鹽氯熒光素乙酰乙酸鹽 胞外胞外H H2 2DCF-DA DCF-DA 擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 酯酶脫乙酰酯酶脫乙酰DCF-H(DCF-H(不熒發(fā)光）不熒發(fā)光） DCFDCF（發(fā)熒光（發(fā)熒光）* *樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察樣品不能在鏡下用汞燈照射及觀察 Dihydr

32、orhodamine 123（507nm/529nm）H H2 2rhod123 rhod123 被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi)被動(dòng)擴(kuò)散入細(xì)胞內(nèi) 在細(xì)胞內(nèi)被氧化成在細(xì)胞內(nèi)被氧化成rod123rod123（發(fā)光）（發(fā)光）激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用 藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程及定位分布藥物進(jìn)入細(xì)胞的動(dòng)態(tài)過程及定位分布 xyzt 掃描掃描 激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用四四. . 膜電位的測量膜電位的測量標(biāo)記膜電位探針標(biāo)記膜電位探針( (慢反應(yīng)）：慢反應(yīng)）：JC1 510nm 530/590nmDioc5(3) 548nm 573nmDioc6(3) 484nm 500nm快反應(yīng)探針：快反應(yīng)探針：Di-4-ANEPPS 496nm