免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點

1、免疫組化技術(shù)的原理、分類和優(yōu)點 點擊次數(shù)： 3565 發(fā)表于： 2008-06-15 11:58 轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園 來源：互聯(lián)網(wǎng) 一、免疫組化技術(shù)的基本原理 應(yīng)用免疫學(xué)及組織化學(xué)原理，對組織切片或細胞標本中的某些化學(xué)成分進行原位的定 性、定位或定量研究，這種技術(shù)稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細胞化學(xué)技術(shù)。 眾所周知，抗體與抗原之間的結(jié)合具有高度的特異性。免疫組化正是利用這一特性， 即先將組織或細胞中的某些化學(xué)物質(zhì)提取出來， 以其作為抗原或半抗原去免疫小鼠等實驗動 物，制備特異性抗體，再用這種抗體（第一抗體）作為抗原去免疫動物制備第二抗體，并用 某種酶 （常用辣根過氧化物酶） 或生物素等處理后再

2、與前述抗原成分結(jié)合， 將抗原放大，由 于抗體與抗原結(jié)合后形成的免疫復(fù)合物是無色的， 因此，還必須借助于組織化學(xué)方法將抗原 抗體反應(yīng)部位顯示出來（常用顯色劑 DAB 顯示為棕黃色顆粒）。通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反 應(yīng)，顯示細胞或組織中的化學(xué)成分， 在顯微鏡下可清晰看見細胞內(nèi)發(fā)生的抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)物， 從而能夠在細胞或組織原位確定某些化學(xué)成分的分布、 含量。 組織或細胞中凡是能作抗原或 半抗原的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等 都可用相應(yīng)的特異性抗體進行檢測。 二、 免疫組織化學(xué)染色方法 1、 按標記物質(zhì)的種類， 如熒光染料、 放射性同位素、 酶 （主要有辣根過

3、氧化物酶和堿 性磷酸酶） 、鐵蛋白、 膠體金等， 可分為免疫熒光法、 放射免疫法、 酶標法和免疫金銀法等。 2、 按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）；與直 接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。 3、 按結(jié)合方式可分為抗原一抗體結(jié)合，如過氧化物酶 -抗過氧化物酶（PAP 法和親和 連接，如卵白素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（ABQ 法、鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連 結(jié)（SP）法等，其中SP 法是最常用的方法。 三、 幾種常用免疫組織化學(xué)方法的原理 1、免疫熒光方法 是最早建立的免疫組織化學(xué)技術(shù)。它利用抗原抗體特異性結(jié)合的原理，先將已知抗體 標上熒光素， 以此作為

4、探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原， 在熒光顯微鏡下觀察。 當抗原抗 體復(fù)合物中的熒光素受激發(fā)光的照射后即會發(fā)出一定波長的熒光， 從而可確定組織中某種抗 原的定位，進而還可進行定量分析。由于免疫熒光技術(shù)特異性強、靈敏度高、快速簡便，所 以在臨床病理診斷、檢驗中應(yīng)用比較廣。 2、免疫酶標方法 免疫酶標方法是繼免疫熒光后，于 60 年代發(fā)展起來的技術(shù)。 基本原理是先以酶標記的 抗體與組織或細胞作用， 然后加入酶的底物， 生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的 顆粒， 通過光鏡或電鏡， 對細胞表面和細胞內(nèi)的各種抗原成分進行定位研究。 免疫酶標技術(shù) 是目前最常用的技術(shù)。 本方法與免疫熒光技術(shù)相比的主要優(yōu)

5、點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期保 存，適合于光、電鏡研究等。 免疫酶標方法的發(fā)展非常迅速，已經(jīng)衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進 和創(chuàng)新， 其特異性和靈敏度都在不斷提高， 使用也越來越方便。 目前在病理診斷中廣為使用 的當屬 PAP 法、ABC法、SP 法等。 3、免疫膠體金技術(shù) 免疫膠體金技術(shù)是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水 溶膠， 它能迅速而穩(wěn)定地吸附蛋白， 對蛋白的生物學(xué)活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體 金標記一抗、二抗或其他能特異性結(jié)合免疫球蛋白的分子 (如葡萄球菌 A 蛋白)等作為探針， 就能對組織或細胞內(nèi)的抗原進行定性、 定位，甚至定

6、量研究。 由于膠體金有不同大小的顆粒， 且膠體金的電子密度高， 所以免疫膠體金技術(shù)特別適合于免疫電鏡的單標記或多標記定位研 究。由于膠體金本身呈淡至深紅色， 因此也適合進行光鏡觀察。 如應(yīng)用銀加強的免疫金銀法 則更便于光鏡觀察。 四、免疫組化技術(shù)的優(yōu)點 1、 特異性強 免疫學(xué)的基本原理決定了抗原與抗體之間的結(jié)合具有高度特異性，因 此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白( keratin )顯示上皮 成分，LCA 顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時才會出現(xiàn)交叉反應(yīng)。 2、 敏感性高 在應(yīng)用免疫組化的起始階段，由于技術(shù)上的限制，只有直接法、間接 法等敏感性不高的

7、技術(shù)，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現(xiàn)在由于 現(xiàn)，使抗體稀釋上千倍、 上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結(jié)合， 抗體抗原反應(yīng)，使免疫組化方法越來越方便地應(yīng)用于常規(guī)病理診斷工作。 ABC 法或 SP 法的出 這樣高敏感性的 3、定位準確、形態(tài)與功能相結(jié)合 該技術(shù)通過抗原抗體反應(yīng)及呈色反應(yīng)，可在組織 和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察， 這樣就可以進行形態(tài)與功能相結(jié)合的研究，對病理學(xué)研究的深入是十分有意義的。 免疫組化技術(shù)的關(guān)鍵問題匯總（ 1） 點擊次數(shù)： 2786 發(fā)表于： 2008-06-23 15:02 轉(zhuǎn)載請注明來自丁香園 來源：互聯(lián)網(wǎng) 一

8、、組織處理 恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在 組織細胞材料準備的過程中， 不僅要求保持組織細胞形態(tài)完整， 更要保持組織細胞的抗原性 不受損或彌漫， 防止組織自溶。 如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失， 即使用很靈敏的 檢測抗體和高超的技術(shù)， 也很難檢出所需的抗原， 反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕 擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 1、組織及時取材和固定 組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第 一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進行取材，最好 2h 內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切

9、拉組織，造成組織的擠壓， 組織塊大小要適中，一般在XX,切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的原則， （也 就是說組織塊的面積可以大到 3cmX 5cm 但組織塊的厚度千萬不能超過，否則將不利于組 織的均勻固定 ） 。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅速凝固。從而完 好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。 對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是 專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī) HE 病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進行免疫組化的染色，而 HE 染色的常規(guī)組織處理是采用 10% 的中性緩沖福爾馬林或 4%緩沖多聚

10、甲醛 4 倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強， 對組織的作用均勻進行固定,但組織固定時間最好在 l2h 內(nèi),一般固定時間不應(yīng)超過 24h。 隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。 2、組織脫水、透明、浸蠟 組織經(jīng)固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原 則是脫水透明要充分但不能過, 浸蠟時間要夠, 溫度不能高, 否則造成組織的硬脆使組織切 片困難，即使能切片，由于組織的硬脆，也使切片不能完好平整，染色過程中極易脫片，對 免疫組化染色抗原的定位及背景都不利，所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長， 正常大小的組織無水酒精脫水 lh X3次，二甲苯透明 lh X2次即可，浸

11、蠟及包埋石蠟溫度不 要超過 65 C。 二、切片 組織得到很好處理后在進行切片之前還應(yīng)對玻璃片進行處理， 由于我們檢測抗原是多 種多樣的， 因染色操作程序復(fù)雜， 時間較長， 有些抗原是要進行各種抗原修復(fù)處理， 如微波、 高壓、 水溶酶等，玻片如果得不到很好的處理，將易造成脫片，為保證免疫組化實驗的正常 進行，要求在貼片前對載玻片作適當處理， 必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防 脫片。 1、 Poly-L-Lysine （ 多聚左旋賴氨酸 ） 一般采用分子量 30000 左右的 %多聚賴氨 酸最好，也可用試劑公司出售的其濃溶液以 1：10 去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中， 傾盡余液，

12、在 60 C溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及 分子學(xué)檢測中的應(yīng)用，粘貼效果最好，但價格稍貴。 2、 明膠硫酸鉻鉀法 將明膠加熱溶于 500ml 蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入硫酸鉻 鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中 2mi n,取出控盡液體入溫箱中烤干備用。 此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng)注意，如 果液體變藍或粘稠狀停用。 3、 APES（3- 氨丙基 -乙氧基甲硅烷 ） 此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入 1:50 丙 酮稀釋的 APES 中，浸泡 20s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的 APES 京干即可

13、。 用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷,否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。 切片必須保持切片刀銳利,切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕,如有上述問題的切片 在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為 34 卩 m 切好的切片在 60C溫 箱中過夜， 注意烤片的溫度不宜過高， 否則易使組織細胞結(jié)構(gòu)破壞， 而產(chǎn)生抗原標記定位彌 漫現(xiàn)象。 6、顯色 免疫組化染色的顯色是最后的關(guān)鍵問題，一般辣根過氧化物酶（ HRP 的 檢測系統(tǒng)選用 DAB 或 AEC 顯色系統(tǒng)進行顯色。但要得到最佳的顯色效果，必須在鏡下嚴格控 制，以檢出物達到最強顯色而背景無色為最終點， 尤其 DAB 顯色時間短著色淺，時間長背景 又

14、深，都將影響結(jié)果判斷，根據(jù)經(jīng)驗 DAB 在配制完后最長宜放置 30min以內(nèi)，過時不能使用， DAB 加到組織切片時作用時間最長不宜超過 10min （最好在 5min內(nèi)），否則不管有無陽性都 應(yīng)終止反應(yīng)。對一些含有內(nèi)源性酶較高的組織用 DAB 顯色時極易出現(xiàn)背景色更應(yīng)盡早在鏡下 控制，以達到最佳的分辨效果（棕色）。 AEC 顯色系統(tǒng)（紅色）的弊端是易溶于有機溶劑， 所以封片時應(yīng)以水性封片劑為主，同時染色的切片也不能久存。 如果是堿性磷酸酶（AP）最好選用 NBT/BCIP 作為顯色系統(tǒng)（結(jié)果染為藍黑色）。 7、結(jié)果判斷 一是對以檢測結(jié)果陽性細胞指數(shù)來定性 （ 如核抗原的標記 ） ，判斷方法是

15、以一個視野中 的陽性細胞數(shù)與總細胞的百分比，再取 10 個相同視野算取平均指數(shù)；另一種方法以染色陽 性強度和陽性檢出率相結(jié)合而定， 一般陽性細胞數(shù)在 025 為陰性， 2550 為十， 5075 為十 十， 75 以上為十十十。此種判定方法容易出現(xiàn)人為誤差現(xiàn)象。有條件的實驗室最好能用圖 像分析系統(tǒng)進行結(jié)果檢測定量分析更為準確。 一切的判定方法都是力求使免疫組化染色結(jié)果 判斷更標準， 但各單位采取的標準不盡相同， 所以判斷標準化問題還有待長期實踐中病理學(xué) 術(shù)界商討判定標準。 IHC 中常見的抗原表達模式有以下幾種： （ 1）細胞漿內(nèi)彌漫性分布， 多數(shù)胞漿型抗體的反應(yīng)如此， 如細胞角蛋白 （ cy

16、tokeratin ， CK 和波形蛋白（vimentin ）等； （2 ）細胞核周的胞漿內(nèi)分布，其判別要點是細胞核的輪廓被勾畫得很清楚，如 CD3 多 克隆抗體的染色； （3） 胞漿內(nèi)局限性點狀陽性，如 CDl5 抗體的染色； （4） 細胞膜線性陽性，大多數(shù)淋巴細胞標記的染色如此，如 CD20、CD45RO； （5） 細胞核陽性，如 Ki-67 及雌、孕激素受體蛋白 ER PR 等。一種抗體可同時出現(xiàn) 細胞漿和細胞膜的陽性表達，如 EMA 可呈膜性和胞漿內(nèi)彌漫性陽性反應(yīng)； CD30 抗體可同時 呈膜性和胞漿內(nèi)點狀陽性反應(yīng)等。 影響免疫組化染色質(zhì)量的因素有很多，在實驗中應(yīng)注意組織的取材和固定，

17、選擇質(zhì)量 好的商品化抗體，恰當?shù)剡x擇和使用封閉和抗原修復(fù)手段，嚴格的技術(shù)操作和對照等。 假陰性反應(yīng)可發(fā)生在：組織內(nèi)待測抗原已被分解破壞，或抗原含量過低；抗原被 遮蓋，多由于醛類固定劑的使用，使組織中的大分子蛋白借醛鍵形成交聯(lián)而遮蓋待檢抗原； 抗體質(zhì)量不佳或稀釋度不當；技術(shù)操作失誤等。 假陽性反應(yīng)可發(fā)生在：抗體與非待檢抗原發(fā)生交叉反應(yīng)，在使用多克隆抗體時易出 現(xiàn)；組織對抗體的非特異性吸附，特別是在有大片組織壞死或組織中有較多富于蛋白的液 體時容易發(fā)生； 內(nèi)源性過氧化酶的作用， 在脾臟、 骨髓及一些炎性病變組織的染色中易出 現(xiàn)；內(nèi)源性堿性磷酸酶的作用， 特別是腸黏膜上皮和腎近曲小管的刷狀緣有高濃度

18、的堿性磷 酸酶，若處理不徹底，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果；判斷失誤， 將腫瘤組織中殘留的正常組織的免 疫組織化學(xué)陽性信號誤認為是腫瘤的染色反應(yīng)； 當腫瘤浸潤破壞正常組織時， 使被破壞的 正常細胞胞漿內(nèi)的可溶性蛋白釋放， 后者被腫瘤細胞非特異吸附或吞噬， 使瘤細胞出現(xiàn)該種 抗原的陽性反應(yīng)；外源性和內(nèi)源性色素的干擾。 8、對照片的設(shè)置 免疫組化的質(zhì)量取決于正確使用各種對照，沒有對照的免疫組 化結(jié)果是毫無意義的。 對照包括陰性對照、 陽性對照和自身對照。 在實踐中可用染色組織切 片中不含抗原的組織作為陰性對照， 而用含抗原的正常組織作陽性對照， 這種自我對照具有 節(jié)約的意義。 觀察染色結(jié)果時， 先觀察對照組織

19、的結(jié)果， 如陽性對照組織中陽性細胞呈強陽 性，陰性對照細胞呈陰性，內(nèi)源酶陰性， 背景無非特異性染色時， 表明本次實驗的全部試劑 和全過程技術(shù)操作準確無誤，待檢組織中的陽性細胞也就是可信的正確結(jié)果。 免疫組化染 色中對照片的設(shè)置非常重要， 它是判斷您的染色是否成功的關(guān)鍵依據(jù)， 而且也是檢測每一個 抗體的質(zhì)量標準，常設(shè)的對照如下，一般實驗最常用的只選第二種方法。 （1 ）空白對照（陰性對照）：第一抗體由 PBS 或非免疫血清取代。 （2） 陽性對照： 用已知含有要檢測抗原的切片作陽性對照。 （3） 回收實驗陰性對照： 已知抗原與相應(yīng)的第一抗體混合，發(fā)生結(jié)合沉淀，再用此 沉淀抗體復(fù)合物進行免疫組化實

20、驗，結(jié)果為陰性。 （4） 替代對照：用于第一抗體同種動物的血清或無關(guān)抗體代替第一抗體結(jié)果為陰性。 （5） 自身對照：在同一切片上，應(yīng)將不同組織成分中的陽性或陰性結(jié)果與檢測的目的 物對照比較。如 actin、CD34 在正常組織中的血管壁肌層應(yīng)為陽性， vimentin 可以間質(zhì)細 胞，對照 desmin 以血管壁及肌束為對照， S-l00 蛋白以小神經(jīng)末梢為對照等，如果應(yīng)為陽 性的組織是陽性， 則免疫組化技術(shù)正確， 如為陰性， 則表明染色技術(shù)有問題或免疫試劑質(zhì)量 有問題。 一、組織處理 恰當?shù)慕M織處理是做好免疫組化染色的先決條件，也是決定染色成敗的內(nèi)部因素，在 組織細胞材料準備的過程中， 不僅

21、要求保持組織細胞形態(tài)完整， 更要保持組織細胞的抗原性 不受損或彌漫， 防止組織自溶。 如果出現(xiàn)自溶壞死的組織，抗原已經(jīng)丟失， 即使用很靈敏的 檢測抗體和高超的技術(shù)， 也很難檢出所需的抗原， 反而往往由于組織的壞死或制片時的刀痕 擠壓，在上述區(qū)域易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 1、組織及時取材和固定 組織標本及時的取材和固定是做好免疫組化染色的關(guān)鍵第 一步，是有效防止組織自溶壞死，抗原丟失的開始，離體組織應(yīng)盡快的進行取材，最好 2 h 內(nèi)，取材時所用的刀應(yīng)銳利，要一刀下去切開組織，不可反復(fù)切拉組織，造成組織的擠壓， 組織塊大小要適中，一般在 cmX cmx cm,切記取材時組織塊寧可面積大，千萬不能厚的 原

22、則，（也就是說組織塊的面積可以大到 3 cmx 5 cm,但組織塊的厚度千萬不能超過 cm, 否則將不利于組織的均勻固定 ）。固定液快速滲透到組織內(nèi)部使組織蛋白能在一定時間內(nèi)迅 速凝固。從而完好的保存抗原和組織細胞形態(tài)。 對于固定液的選擇，原則上講，應(yīng)根據(jù)抗原的耐受性來選擇相應(yīng)的固定液，但除非是 專項科研項目，在病理常規(guī)工作很難做到這一點，因為病理的診斷和鑒別診斷都是在常規(guī) HE 病理診斷的基礎(chǔ)上決定是否進行免疫組化的染色，而 HE 染色的常規(guī)組織處理是采用 10% 的中性緩沖福爾馬林或 4%緩沖多聚甲醛 4 倍于組織體積進行組織固定，利用其滲透性強， 對組織的作用均勻進行固定,但組織固定時間

23、最好在 l2 h 內(nèi),一般固定時間不應(yīng)超過 24 h。 隨著固定時間的延長對組織抗原的檢出強度將逐漸降低。 2、組織脫水、透明、浸蠟 組織經(jīng)固定后進行脫水、透明、浸蠟和包埋。掌握的原 則是脫水透明要充分但不能過, 浸蠟時間要夠, 溫度不能高, 否則造成組織的硬脆使組織切 片困難,即使能切片,由于組織的硬脆,也使切片不能完好平整,染色過程中極易脫片,對 免疫組化染色抗原的定位及背景都不利,所以無水酒精脫水和二甲苯透明的時間不宜過長, 正常大小的組織無水酒精脫水 I hX3次，二甲苯透明 I hX2次即可，浸蠟及包埋石蠟溫度 不要超過 65 C。 二、切片 組織得到很好處理后在進行切片之前還應(yīng)對玻

24、璃片進行處理,由于我們檢測抗原是多 種多樣的, 因染色操作程序復(fù)雜, 時間較長, 有些抗原是要進行各種抗原修復(fù)處理, 如微波、 高壓、 水溶酶等,玻片如果得不到很好的處理,將易造成脫片,為保證免疫組化實驗的正常 進行,要求在貼片前對載玻片作適當處理, 必須在清洗干凈的玻片上進行粘合劑的處理以防 脫片。 1、 PoIy-L-Lysine （ 多聚左旋賴氨酸 ） 一般采用分子量 30000 左右的 %多聚賴氨 酸最好,也可用試劑公司出售的其濃溶液以 1：10 去離子水稀釋。方法是將玻片浸泡其中, 傾盡余液，在60 C溫箱中烤干備用，此方法的優(yōu)點是可以用于多種組織化學(xué)、免疫組化及 分子學(xué)檢測中的應(yīng)用

25、,粘貼效果最好,但價格稍貴。 2、明膠硫酸鉻鉀法 將 g 明膠加熱溶于 500 ml 蒸餾水中，完全溶解冷卻后加入 g 硫酸鉻鉀攪勻充分溶解即可使用。方法是將玻片浸泡其中 2 min ，取出控盡液體入溫箱中烤 干備用。此法價格便宜、方法簡單，任何實驗都可以使用，特別適用于大批量的使用，但應(yīng) 注意，如果液體變藍或粘稠狀停用。 3、 APES(3- 氨丙基 -乙氧基甲硅烷 ) 此法必須現(xiàn)用現(xiàn)配。將洗凈玻片入 1:50 丙 酮稀釋的 APES 中，浸泡 20 s，取出稍停再入丙酮或蒸餾水中刷去末結(jié)合的 APES 晾干即可。 用此方法粘合的玻片應(yīng)垂直烤片不能平拷，否則組織片中易出現(xiàn)氣泡。 切片必須保持

26、切片刀銳利，切片要薄而平整、無皺摺、無刀痕，如有上述問題的切片 在進行免疫組化染色都將出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，切片厚度一般為 34 卩 m 切好的切片在 60 C 溫箱中過夜， 注意烤片的溫度不宜過高， 否則易使組織細胞結(jié)構(gòu)破壞， 而產(chǎn)生抗原標記定位 彌漫現(xiàn)象。 4、抗原修復(fù) 經(jīng)甲醛固定的部分組織細胞，可使免疫組化標記敏感性明顯降低， 這是因為甲醛固定過程中形成醛鍵或保存的甲醛會形成羧甲基而封閉部分抗原決定簇。因 此，在染色時，有些抗原需先進行修復(fù)或暴露。 抗原修復(fù)方法可分為化學(xué)方法和物理方法。化學(xué)方法是以酶消化方法，常用胰蛋白酶 及胃蛋白酶， 配制濃度與消化時間要適度。 常用的物理方法有單純加熱、

27、微波處理和高壓加 熱。在選用這三種加熱法時，浸泡切片的緩沖液的離子強度和 PH 值、加熱的溫度和時間均 影響著抗原修復(fù)效果。目前最常用的修復(fù)方法有如下凡種： (1) 胰蛋白酶(Trpsin ) 主要用于細胞內(nèi)抗原的修復(fù)。一般使用濃度為 % 37C作 用 10min。配法：胰蛋白酶加入到 % CaCl2 (無水)水溶液中溶解后即可。 (2) 胃蛋白酶( Pepsin) 主要用于細胞間質(zhì)或基底膜抗原的修復(fù)。一般濃度為 %， 37C作用 30min。配法：胃蛋白酶溶于 L HCl 水溶液中。 熱引導(dǎo)的抗原決定簇修復(fù)( Heat Induced Epitope Retrieval , HIER)對大多

28、數(shù)的抗 體有益， 尤其是對核抗原的修復(fù)作用更加明顯， 最常用的抗原修復(fù)液是的枸櫞酸緩沖液和的 EDTA 緩沖液，它們的作用原理是通過鈉離子的螯合而實現(xiàn)的。 抗原修復(fù)液的 PH 值非常重要， 有效的抗原修復(fù) pH 值要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著 PH 值的升高染色的 強度逐漸增強，但最佳 PH 值范圍為，對于大多數(shù)抗原這個范圍的 pH 值都能進行有效的修 復(fù)，有些抗體(如 Ki-67、ER 則在 PH 值和更為有效。作為通用修復(fù)液堿性 pH 值的修復(fù) 液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性 pH 值的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修 復(fù)液，所以兩種抗原修復(fù)液可作為相互替補的進行

29、抗原修復(fù)。在進行 HIER 過程中應(yīng)防止切 片的干燥， 加熱時必須達到規(guī)定的溫度， 保溫時間要足夠， 對于一些不要抗原修復(fù)的抗體最 好不要采用 HIER 處理，否則對染色無益，但有些抗體則需要利用多種修復(fù)聯(lián)合應(yīng)用。 HIER 方法有： (1) 水浴加熱法 將脫蠟人水后的切片放人盛有修復(fù)的容器中，放人加熱煮沸水中， 當修復(fù)液溫度達到 95C左右時計時 I5min，自然冷卻，PBS 洗 3minX3次。 (2) 微波加熱法 將切片放入修復(fù)液中微波加熱使溫度在 96 C左右，計時 I0min , 在微波爐中停留 2min,室溫自然冷卻，PBS 洗 3minX3次。 (3) 高壓加熱法 將修復(fù)液在高壓

30、鍋中煮沸，切片插在染色架上，放入鍋中(要使 修復(fù)液淹沒切片)開始噴氣時蓋上壓力閥。 計時 2min，冷水沖至室溫取出切片，PBS 洗 3mi nX3 次。 5、免疫組化試劑的標準化 要求試劑公司提供標準化的試劑,并附詳細的試劑說明書,包括抗體的來源、免疫球 蛋白的亞類、單抗或多抗、使用稀釋度、 使用流程和注意事項、洗滌時緩沖液的適宜離子強 度和 PH 值等?？贵w的選擇是開展免疫組化最重要環(huán)節(jié)之一。 目前，抗體大部分來源于國外， 抗體種類繁多, 生產(chǎn)廠家各異, 再經(jīng)過中介渠道致有效期縮短, 影響抗體效價甚至陽性不表 達,因此對購入的抗體首先要進行檢測。 理想的抗體應(yīng)具備特異性強、 敏感性高和適應(yīng)性強 的特點。 現(xiàn)實市場銷售的一抗多為即用型,對抗體的滴度無須摸索,但對于濃縮型一抗,則應(yīng) 摸索出最佳的工作滴度, 抗體的濃度過高或過低都將可能出現(xiàn)陰性結(jié)果, 應(yīng)該用一個適當?shù)?稀釋度